Aquí, presentamos un protocolo para visualizar el desarrollo de corazón en pez cebra en 4 dimensiones (4D). Imagen 4-D, mediante microscopía de fluorescencia de luz-hoja (LSFM), toma 3 dimensiones (3D) imágenes en el tiempo, reconstruir el corazón en desarrollo. Mostramos cualitativamente y cuantitativamente que esa tensión de esquileo activa endocárdica muesca señalización durante el desarrollo de la cámara, que promueve la trabeculación cardiaca.
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Artículo de método
Microscopía de fluorescencia de la hoja de luz para capturar imágenes de 4 dimensiones de los efectos de la modulación de la tensión de esquileo en el corazón de pez cebra en desarrollo
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Resumen
Resumen
Las fuerzas hemodinámicas experimentadas por el desarrollo cardíaco corazón influencia, especialmente trabeculación, que forma una red de ramificación crecimientos del miocardio. Programa genético de defectos en la muesca de señalización cascada participan en defectos ventriculares como cardiomiopatía no compactación Ventricular izquierda o síndrome de corazón izquierdo hipoplásico. Mediante este protocolo, puede determinarse que tensión de esquileo conducido trabeculación y señalización Notch están relacionados con uno otro. Usando microscopía de fluorescencia de luz-hoja, visualización del corazón de pez cebra en desarrollo era posible. En este manuscrito, se evaluó si las fuerzas hemodinámicas modulan el inicio de la trabeculación vía de señalización Notch y por lo tanto, influyen en la función contráctil se produce. Cualitativa y cuantitativa del esquileo tensión análisis, 4-D (3-D + tiempo) imágenes fueron adquiridas durante la morfogénesis cardiaca de pez cebra, y de microscopía de fluorescencia de luz hoja integrada con 4 D sincronización capturado el movimiento ventricular. Viscosidad de la sangre se redujo gata1a- morfolino oligonucleótidos (MO) micro-inyectable para disminuir la tensión de esquileo, de tal modo, abajo-regulación de la muesca señalización y atenuando trabeculación. La inyección de mRNA de Nrg1 con gata1a MO rescatado genes relacionados con la muesca para restaurar trabeculación. Para confirmar la tensión de esquileo por señalización Notch influencias trabeculación, contracción de cardiomiocitos más fue detenida por tnnt2a-MO para reducir las fuerzas hemodinámicas, por lo tanto, abajo-regulan genes de la blanco del muesca para desarrollar no trabeculada miocardio. Por último, corroboración de los patrones de expresión de genes sensibles a la tensión de esquileo de muesca se realizó sometiendo las células endoteliales a flujo pulsátil. Así, la microscopía de luz-hoja 4-D al descubierto las fuerzas hemodinámicas subyacentes de señalización Notch y trabeculación con importancia clínica a la cardiomiopatía no compactación.
Introducción
Fuerzas biomecánicas, como hemodinámica tensión de esquileo, están involucradas íntimamente en la morfogénesis cardiaca. En respuesta a las fuerzas de corte hemodinámica, surcos y crestas miocardio desarrollan en una red trabecular ondulatorio en alineación con la dirección de la tensión de esquileo en el auriculoventricular (AV) válvula1. Trabeculación cardiaca es necesario aumentar la función contráctil y masa miocárdica2. Mutaciones en vías de señalización Notch dan lugar a defectos congénitos del corazón en los seres humanos y otros vertebrados3. Por ejemplo, gata1a4....
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Protocolo
Los métodos siguientes se realizaron en cumplimiento de protocolos de UTA y UCLA IACUC. Estos grupos experimentales fueron utilizados con transgénicos Tg(cmlc2:gfp), los mutantes wea (atrio débil) o clo (cloche) : (a) tipo salvaje (WT) control, (b) gata1a MO y (c) tnnt2a MO inyecciones (tabla 1).
| Modelo | Nombre | Genes modificados | Fenotipo | Referencia |
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Resultados
LSFM fue utilizado en este manuscrito para adquirir 2-D y 3-d imágenes de alta resolución. Como se ve en la figura 1A y 1B, el lente de la iluminación indica la ficha técnica de iluminación en la muestra. Debido a la delgadez de la ficha técnica de iluminación, se ilumina solamente un solo plano. El objetivo de la detección es colocada perpendicular a la lente de la iluminación y se centra en el plano iluminado (figura 1B.......
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Discusión
En este protocolo, hemos demostrado que la proyección de imagen 4-D puede utilizarse para rastrear el desarrollo de una red trabecular en respuesta a cambios en las fuerzas biomecánicas. En particular, la tensión de corte experimentado por las células endoteliales inicia la muesca señalización cascada, que a su vez promueve la trabeculación. En este manuscrito, hemos demostrado que (1) gata1a MO inyección disminuyó la hematopoyesis y por lo tanto redujo la tensión de esquileo de la pared, (2) tnnt2a MO .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a William Talbot de la Universidad de Stanford para proporcionar al ser humano Nrg1 cDNA y Deborah Yelon de UCSD para proporcionar la WEA mutantes. Los autores también desean agradecer a Cynthia Chen por ayudar con la adquisición de la imagen. Este estudio fue apoyado por subvenciones de NIH HL118650 (a T.K. Hsiai), HL083015 (a T.K. Hsiai), HD069305 (a Carolina del norte Chi y T.K. Hsiai.), HL111437 (a T.K. Hsiai y Chi de Carolina del norte), HL129727 (a T.K. Hsiai), ....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Premezcla de PCR Hifi de Clontech | Takara | 639298 | PCR mastermix 1.1.1.1, 1.1.1.2, 1.1.1.5, 1.1.2.1, 3.1.4 |
| Human Nrg1 ADNc | Regalo de William Talbot, Universidad de Stanford, Stanford, California, EE. UU | N/A | Se utiliza para el rescate de trabeculación 1.1.1.3, 1.1.1.4, 1.1.2.1 |
| CFX Connect™ Sistema de detección de PCR en tiempo real | Bio-Rad | 1855201 | PCR Machine 1.1.1.5, 1.1.1.6, 1.1.2.2, 1.1.3.2 |
| pCS2+ | GE Health | Plásmido utilizado para sintetizar mRNA 1.1.2.1, 1.1.2.4, 1.1.2.5 | |
| Kit de purificación de nucleospinas | Clontech | 740609.25 | Purificación de ADN 1.1.2.3, 1.1.2.4, 1.1.6.2 |
| T4 ADN ligasa | Clontech | 2011A Solución de | ligadura de PCR 1.1.2.5 |
| Células competentes estelares | Clontech | 636763 | E. coli células utilizadas para la transformación 1.1.2.6, 1.1.3.1, 1.1.3.2 |
| Reactivo de transfección Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668027 | Reactivo de transfección 1.1.4 |
| mMessage SP6 kit | Invitrogen | AM1340 | Kit utilizado para sintetizar ARNm 1.1.6.3 |
| Aurum ARN Total Mini Kit | Bio-Rad | 7326820 | Purifica ARN 1.1.6.4, 3.1.2 |
| GeneTools 4.3.8 | GeneTools | N/A | Software para el diseño de imprimaciones 1.2.1, 3.1.3 |
| EPO cDNA | Creative Biogene | CDFH006026 aumenta WSS 1.2.2, 1.2.3, 1.1.7 | |
| AG1478 | Sigma-Aldrich | T4182 | Inhibidor de ErbB 1.3.1 |
| E3 medio | Para el crecimiento de embriones 1.3.1, 1.3.2, 5.1.5 | ||
| DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | γinhibidor de la -secretasa 1.3.2 |
| Agarosa | Sigma-Aldrich | A9539 | Se utiliza para el montaje de embriones 2.1.1.1 |
| ORCA-Flash4.0 LT Cámara digital CMOS | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Se utiliza para capturar imágenes 2.1.1.2, 2.1.1.3 |
| Amira Software | FEI Software | N/A | Imágenes visualizadas y analizadas en 3D y 4D 2.1.5.1.1-2.1.5.2.8 |
| Mesilato de Tricaone | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | Se utiliza para sedar o sacrificar embriones de forma humanitaria 3.1.1 |
| Kit de síntesis de ADNc iScript | Bio-Rad | 1708890 | sintetiza ADNc 3.1.2 |
| Microcentrífuga Eppendorf 5424 Eppendorf | 05-400-005 | Microcentrífuga 4.1.1.3 | |
| GI254023X | Sigma-Aldrich | 260264-93-5 | Inhibidor de ADAM10 4.1.2, 4.1.3 |
| Clorhidrato de isoprenalina | Sigma-Aldrich | I5627 | El isoproterenol aumenta WSS 5.1.5 |
| MATLAB | Mathworks | N/A | Análisis de mecánica cardíaca |
Referencias
- Lee, J., et al. Moving domain computational fluid dynamics to interface with an embryonic model of cardiac morphogenesis. PLoS One. 8 (8), e72924(2013).
- Peshkovsky, C., Totong, R., Yelon, D. Dependence of cardiac trabeculation....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart
Posted by JoVE Editors on 9/03/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Light-sheet Fluorescence Microscopy to Capture 4-Dimensional Images of the Effects of Modulating Shear Stress on the Developing Zebrafish Heart. Additional author names were added, and an author affiliation was updated.
The author list was updated from:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
to:
Victoria Messerschmidt*1, Zachary Bailey*1, Kyung In Baek2, Yichen Ding2, Jeffrey J. Hsu2, Richard Bryant1, Rongsong Li2, Tzung K. Hsiai2, Juhyun Lee1
The author affiliation for Rongsong Li was updated from:
Department of Medicine (Cardiology) and Bioengineering, UCLA
to:
College of Health Science and Environmental Engineering, Shenzhen Technology University
