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Artículo de método

Cuantificación de Vibrio cholerae de colonización y de la diarrea en el modelo de pez cebra adulto

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DOI:

10.3791/57767

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12 de julio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology, and Biochemistry, Wayne State University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Pez cebra son un natural Vibrio cholerae anfitrión y se puede utilizar para recapitular y estudiar el ciclo infeccioso de colonización a la transmisión. Aquí, demostramos cómo evaluar niveles de colonización de V. cholerae y cuantificar diarrea en pez cebra.

Resumen

Vibrio cholerae es mejor conocido como el agente infeccioso que causa el cólera enfermedad humana. Fuera del huésped humano, V. cholerae sobre todo existe en el medio acuático, donde interactúa con una variedad de especies acuáticas más altas. Vertebrados peces son conocidos por ser un anfitrión de medio ambiente y son un reservorio potencial de V. cholerae en la naturaleza. V. cholerae y las especies de peces teleósteos Danio rerio, conocidas comúnmente como el pez cebra, originan el subcontinente indio, lo que sugiere una interacción prolongada en ambientes acuáticos. Pez cebra son un organismo modelo para estudiar muchos aspectos de la biología, incluyendo enfermedades infecciosas. Pez cebra puede ser fácilmente y rápidamente colonizado por V. cholerae después de la exposición en agua. Colonización intestinal por V. cholerae conduce a la producción de la diarrea y la excreción de replicado V. cholerae. Estos excretan bacterias puede entonces ir a colonizar nuevos huéspedes de pescado. Aquí, demostramos cómo evaluar V. cholerae-colonización intestinal en pez cebra y cómo cuantificar V. cholerae-indujo diarrea de pez cebra. El modelo de colonización debe ser útil a los investigadores que están estudiando si los genes de interés pueden ser importantes para la colonización del huésped o supervivencia ambiental. La cuantificación de pez cebra diarrea debe ser útil a los investigadores estudiar cualquier patógeno intestinal que están interesados en explorar el pez cebra como modelo.

Introducción

Vibrio cholerae es una bacteria acuática, gram-negativa que provoca la cólera de la enfermedad humana como diarrea esporádica1,2. V. cholerae se encuentra en el medio ambiente en muchas áreas del globo, a menudo asociado con otros organismos acuáticos. Estos organismos asociando incluyen plancton, masas de huevos de insectos, crustáceos y vertebrados peces especies3,4,5,6,7. Varios estudios han aislado V. cholerae de los tractos intestinales de peces en diferentes áreas geográficas7,8,9,10. La presencia de V. cholerae en pescados indica que los peces pueden actuar como un reservorio ambiental. Peces también podrían estar implicados en la transmisión de la enfermedad a los seres humanos y en la difusión geográfica de V. cholerae las cepas6.

Para entender mejor cómo V. cholerae interactúa con pescado, Danio rerio, mejor conocido como pez cebra, fue desarrollado como un sistema modelo para el estudio de V. cólerae11. Pez cebra son nativas de Asia meridional, incluyendo la región de la bahía de Bengala, que se piensa para ser el primer reservorio de V. cholerae. Antes del primer comienzo pandemia de cólera en 1817, cólera no había divulgado fuera de lo que hoy es India y Bangladesh. Por lo tanto, pez cebra y V. cholerae seguramente asociados con otros sobre escalas de tiempo evolutivo, sugiriendo que pez cebra se encuentran a V. cholerae en el ambiente natural12.

El modelo de pez cebra para V. cholerae es simple de ejecutar y se puede utilizar para estudiar el patógeno entero ciclo de vida de V. cholerae . Peces están expuestos a V. cholerae por bañarse en el agua que ha sido inoculado con una cantidad conocida de V. cholerae. Dentro de unas horas, colonización intestinal tiene lugar, seguido por la producción de diarrea. Diarrea consiste en mucina, proteínas, bacterias excretadas y otros contenido intestinal. El grado de diarrea puede cuantificarse usando unos simples medidas13. V. cholerae que ha sido excretada por los peces infectados puede entonces pasar al infectar peces ingenuos, completando el ciclo infeccioso. Por lo tanto, el modelo de pez cebra recapitula el V. cholerae enfermedades humanas proceso12,14.

Lo más frecuentemente usado V. cholerae modelos animales han sido históricamente ratones y conejos14,15,16,17,18. Estos modelos han sido instrumentales en la adición a nuestro conocimiento de V. cholerae patogenia. Sin embargo, porque los ratones y los conejos no son natural V. cholerae hosts, hay limitaciones qué aspectos del ciclo de vida V. cholerae pueden ser estudiado. La colonización de V. cholerae de ratones y conejos por lo general requiere la ausencia de microbiota intestinal o un tratamiento previo con antibióticos para dañar la microbiota intestinal. Ambos modelos requieren sonda nasogástrica para introducir las bacterias del tracto digestivo o manipulación quirúrgica para inyectar directamente las bacterias en los intestinos. Pez cebra tienen una ventaja en que peces adultos con una microbiota intestinal intacta son fácilmente colonizados y el proceso infeccioso ocurre naturalmente, sin ninguna manipulación necesaria.

El presente trabajo muestra la utilización del pez cebra como modelo en la infección por V. cholerae . La infección, la disección, enumeración de colonización V. choleraey la cuantificación de la diarrea causada por V. cholerae será descrito12,13. Este modelo es probable ser útil para los científicos interesados en el proceso de la enfermedad de V. cholerae y el V. cholerae ambiental estilo de vida.

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Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Universidad Estatal de Wayne. Este método primero fue descrito en Runft et al. 12

1. determinación de los niveles de colonización Intestinal

Nota: Colonización Intestinal es la métrica más útil en el modelo del pez cebra como puede ser utilizado para comparar la aptitud relativa de varias cepas de V. cholerae o los efectos de las mutaciones o golpes de gracia del gene.

  1. Inoculación de pez cebra por inmersión
    Nota: Este medio de exposición se asemeja a curso natural de la infección.
    1. Preparación de V. cholerae
      1. Inocular los 5 mL de caldo de lisogenia (LB) con un aislado V. cholerae Colonia de una LB plato e incubar a 37 ° C con agitación (180 rpm) durante 6-8 h (la cultura).
      2. Inocular 25 mL de medio fresco de LB en autoclave en un matraz cónico de 250 mL con 50 μl de la cultura durante la noche anterior. Incubar de 16 – 18 h a 37 ° C con agitación (150 rpm).
      3. Leer la densidad óptica a 600 nm (OD600) de una dilución 1/10 de la noche a la mañana cultura para estimar el número de bacterias por mL (el OD600 = 1 es ~ 109 UFC/mL.)
      4. Recoger las células por centrifugación a 6.000 g durante 10 minutos Retire los medios con una pipeta o retirar en una solución desinfectante. Resuspender las células en PBS estéril a la concentración deseada, típicamente entre 1 x 107 a 1 x 1010 por ml de PBS.
        Nota: Aquí, nos referimos a agua de ósmosis inversa autoclave con sales de mar de 60 mg/L como agua estéril infección.
    2. Inoculación e incubación
      1. Coloque un vaso de precipitados de 400 mL que contiene 200 mL de agua estéril infección un pez cebra cuatro o cinco.
      2. Añadir 1 mL de V. cholerae (del paso 1.1.1.4.) para obtener la concentración deseada de la infección (normalmente 5 x 104 a 5 x 107 UFC/mL) en 200 mL de agua de la infección.
      3. Cubrir el vaso con una tapa perforada para evitar que los peces saltando; la parte superior de una caja de punta de 200 μL funciona bien para esto.
      4. Marcar cada vaso y colocarlos en una incubadora de frente de vidrio fijada a 28 ° C para la duración del experimento.
    3. Procedimiento para la exposición transitoria
      Nota: Una exposición transitoria a V. cholerae (típicamente 6 h) seguida de la eliminación de las bacterias inoculación es útil para estudiar la transmisión y para la cuantificación más exacta de la bacteria excreta.
      1. Después de 6 h de exposición, vierta el agua del vaso a través de una rejilla para recoger los peces. Deseche el agua infectado en un recipiente de cloro para matar la V. cholerae.
      2. Coloque el pescado quitado en un vaso de precipitados de 200 mL de agua estéril infección. Permitir a los peces a nadar en esta agua limpia durante 5 minutos eliminar las bacterias de la superficie de los peces.
      3. Repita el procedimiento neto (paso 1.2.2) y coloque el pescado en un nuevo vaso de precipitados de 200 mL de agua estéril infección. Mantener los peces en este vaso para la duración del experimento.
  2. Eutanasia
    1. Cuando el experimento ha llegado a su punto final deseado, tomar una muestra de la infección agua (15 mL es suficiente) permitir conteos bacterianos excretados y la medición de la diarrea (como análisis de mucina, contenido de proteína o OD), si lo desea (sección 2).
    2. Vierta el resto del agua a través de una rejilla (para recoger el pescado) en cloro para matar el V. cholerae en el agua.
    3. Coloque el pescado en un vaso que contiene agua de infección y 336 μg/mL de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Metanosulfonato) e incubar los peces en esta solución de Metanosulfonato por 20 min a TA.
      Nota: Los balancines fueron esterilizados con una solución de cloro 10%.
  3. Disección
    1. Preparación de pescado
      1. Sacar un pez fuera de la solución de Metanosulfonato con una cuchara desechable de plástico y colóquelo en la superficie de disección.
      2. Coloque el pescado con su lado ventral hacia arriba y el pin a través de la quijada más baja, con el extremo romo del perno del ángulo lejos del centro del cuerpo. Coloque otro pin justo posterior al ano, también en ángulo lejos del cuerpo.
    2. Exposición del tracto intestinal
      1. Limpiar la superficie ventral de los peces con un paño sin pelusa humedecido en etanol al 70%.
      2. Esterilizar un bisturí y tijeras de Vannas por inmersión en etanol al 70% y les llamas.
      3. Haga una pequeña incisión longitudinal en el vientre debajo de la piel por penetrar las escalas y con el bisturí. Tenga cuidado de no cortar demasiado profundo, ya que el tracto intestinal se encuentra debajo de la piel.
      4. Con las tijeras, extender la incisión cuidadosamente a lo largo de la longitud del cuerpo, corte no más profundo que el nivel de la piel y evitando el ano.
      5. Hacer dos cortes laterales con las tijeras hacia la cabeza de los peces para permitir una apertura de la incisión.
      6. Perno de la piel en cada lado de las incisiones laterales en la superficie de disección, pesca los pernos hacia fuera, lejos del cuerpo.
        Nota: Las puntas de los pernos fueron esterilizadas previamente por flameado con alcohol.
    3. Eliminación del tracto intestinal
      Nota: El tracto intestinal debe verse como un tubo muy delgado, pálido encima de los otros órganos.
      1. Llama-esterilizar las pinzas y luego usarlos para eliminar todo el tracto intestinal (generalmente 12-15 mm de longitud). Colocar el intestino en un tubo de homogeneización que contiene perlas de vidrio (ver pasos 1.4.1–1.4.2) y 1 mL de 1 x PBS o LB, en el hielo.
  4. Homogeneización
    1. Preparar los tubos de homogeneización adelantado por verter ~1.5 g de perlas de vidrio de 1 mm en 2 mL tubos de tapón de rosca (llenarlos aproximadamente mitad de camino) y luego esterilizarlas en autoclave.
    2. Añadir 1 mL de LB estéril o de 1 x PBS.
    3. Una vez que los intestinos del pez cebra han sido tornillo adicional (paso 1.3.3.1) a los tubos, las tapas muy bien y luego fijar los tubos en el homogenizador vórtex.
    4. Homogeneizar las muestras durante 1 min en la configuración máxima, luego enfriar en hielo durante 1 – 2 minutos repiten este ciclo de homogeneización una vez más para una homogeneización completa.
      Nota: También funciona varios otros métodos de homogeneización.
  5. Cuantificación de los niveles de colonización intestinal
    1. Preparar los tubos (tubos de ensayo de vidrio o tubos de microcentrífuga de 1,5 mL) para la dilución seriada de la homogeneizado agregar 900 μl de LB o 1 x PBS a cada tubo. Para cada pescado, preparar los tubos 5 y 6 y hacer 10 veces diluciones seriadas del homogeneizado intestinal mediante la adición de 100 μl de homogenado al primer tubo Vortex para mezclar y luego agregar 100 μl del primer tubo al segundo tubo.
    2. Repita este procedimiento hasta que todas las diluciones se han preparado.
    3. Placa de 100 – 200 μL de cada dilución en placas de LB agar que contiene 100 μg/mL de estreptomicina (si está usando cepas resistentes a estreptomicina) y 40 μg/mL de X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside). Incubar las placas a 30 ° C durante 16-18 h.
    4. Después de la incubación durante la noche, contar las colonias de V. cholerae en las placas, usando un contador de colonias automático o manualmente contando las colonias; es útil marcar las colonias contadas con una punta de marcador.
    5. Determinar la UFC por intestino de pescado multiplicando el recuento de placa por el factor de dilución de la suspensión, teniendo en cuenta el volumen que era plateado.

2. medición de la diarrea de pescado

Nota: Cuatro métricas diferentes fueron utilizados para determinar diarrea de peces: los niveles de mucina en el agua, los niveles de proteína total de excreta en el agua, el OD600 de agua y el V. cholerae UFC en el agua13. Diarrea normalmente se hace visualmente evidente aproximadamente 6 h después de la exposición del pez cebra a V. cholerae como se describió anteriormente.

  1. Determinar niveles de mucina
    Nota: La secreción de mucina es inducida durante la colonización de V. cholerae y es una buena medida de los niveles de excreción, especialmente temprano en la infección13. La mucina es una variación de la microtitulación ácido Schiff ensayo19.
    1. Preparar los siguientes materiales: ácido solución 50% (w/v) y 0,1% ácido solución de trabajo (10 μl del stock de ácido 50% a 5 mL de ácido acético al 7%, utilice inmediatamente después de hacer), normas de mucina, placas de microtitulación de 96 pocillos, Schiff reactivo.
      1. Preparar normas de mucina suspendiendo las siguientes cantidades de mucina (de un tipo de estómago porcino III) en un tampón de acetato de sodio (100 mM sodio acetato, 5mM EDTA, pH a 5.5 con ácido acético glacial): 400 μg/mL, 300 μg/mL, 200 μg/mL, 150 μg/mL , 100 μg/mL, 75 μg/mL, 50 μg/mL, 25 μg/mL y 10 μg/mL.
        Preparar la placa mediante la adición de 100 μl de infección agua a cada pocillo que se utilizarán en el análisis como sigue: en blanco de 1 x PBS; mucina estándares como se describe anteriormente, o una muestra de agua de la infección de peces. Hacer cada muestra por triplicado.
    2. Añadir 50 μl de solución de ácido peryódico 0.1% fresco cada uno bien con una pipeta multicanal y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo varias veces.
    3. Envolver la placa firmemente en plástico e incubar a 37 ° C por 1 – 1,5 horas.
    4. Enfriar la placa a temperatura ambiente durante 5 – 10 minutos añadir 100 μl de en solución (reactivo de Schiff de) para cada bien y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para mezclarlo.
    5. Envolver la placa en papel plástico e incubar a temperatura ambiente en una plataforma oscilante hasta que el color ha desarrollado; el color se desarrolla generalmente dentro de 20 minutos, leer la absorbancia a 560 nm utilizando un lector de placas.
    6. Trazar una curva estándar de mucina (OD560vs μg/mL mucina estándar). Determinar los niveles de mucina de las incógnitas, identificando donde el OD560 cada desconocido cae en la curva estándar y la correspondiente concentración de mucina para ese valor de la lectura.
  2. Determinar los niveles de proteína
    Nota: Además de mucina, niveles de proteína total en el agua son otro proxy para los niveles de diarrea (heces líquidas nublada) producido por los peces. Este procedimiento utiliza un ensayo estándar de Bradford para estimar niveles de proteína. Niveles de proteína se calculan en base a una curva estándar de albúmina de suero bovino (BSA).
    1. Mezclar 100 μl de uno de los niveles de BSA (ver nota más abajo) o 100 μl de infección (agua desde el vaso de precipitados que contenga peces infectados) con 900 μl de Bradford reactivo de ensayo (el reactivo de análisis de proteínas Pierce funciona bien para esto) en una cubeta desechable. Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 2 minutos.
      Nota: Las siguientes normas de BSA fueron utilizadas: 1.800 μg/mL, 1.000 μg/mL, 750 μg/mL, 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 50 μg/mL y 25 μg/mL. Las normas de BSA se diluyeron en agua destilada esterilizada.
    2. Leer OD660 de cada estándar o muestra a través de un espectrofotómetro.
    3. Trazar la curva estándar de BSA (OD660vs μg/mL). Determinar los niveles de proteína de las incógnitas por determinar donde OD660 cada desconocido cae en la curva estándar de BSA y lea la concentración de mucina correspondiente para ese valor.
  3. Medida OD600
    Nota: La presencia de diarrea (heces líquidas nublada) es visiblemente evidente después de que varios h y OD600 determinación simple pueden utilizarse para cuantificar esto.
    1. Invertir el tubo que contiene el agua de infección varias veces para distribuir el contenido. Añadir 1 mL de la muestra de agua a una cubeta desechable. Use 1 mL de agua estéril infección como control negativo.
    2. Realizar una medición "en blanco" en el espectrofotómetro a 600 nm, utilizando la muestra de control negativo. Leer cada muestra de agua a 600 nm y registro de los resultados.
  4. Determinación de excreta V. cholerae UFC/mL después de la infección
    Nota: Un componente importante de la diarrea producida por el pez cebra a través de la V. cholerae. La determinación de las UFC/mL se puede utilizar para fines tales como la estimación de la replicación bacteriana en el tracto intestinal del pescado y como una medida de una dosis infecciosa en experimentos de transmisión. Esta medida se realiza mejor cuando ha ocurrido una infección transitoria. Si se utiliza una infección 24 h, este ensayo mide el inóculo combinado plus excreta V. cholerae.
    1. Tomar una muestra de agua en el momento deseado y diluirlo en serie como se describió anteriormente.
    2. Las diluciones seriadas en medios selectivos (agar LB con estreptomicina u otro antibiótico apropiado o DCLS) de la placa e incubar a 30 ° C durante 24 h.
    3. Contar las colonias. Calcular la UFC por mL de agua como se describe en el paso 1.5.

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Resultados

V. cholerae la colonización del tracto intestinal de pez cebra

Para proporcionar un ejemplo de los niveles de colonización típica que observamos, inocularon 5 x 106 UFC de la pandemia EL Tor V. cholerae cepa N16961 en 200 mL de agua en un vaso de precipitados que contiene varios peces cebra. Después de 6 h de infección, los peces eran lavados en agua dulce y transferidos a un vaso de precipitados de 200...

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Discusión

El pez cebra es un modelo relativamente nuevo para el estudio de V. cholerae pero tiene mucho potencial para el descubrimiento futuro de aspectos desconocidos de V. cholerae biología y patogénesis11,12,13 . El modelo de pez cebra adulto tiene las ventajas de ser ambos naturales V. cholerae host que contiene microbiota intestinal intacta, maduro y un modelo ambiental. Desventajas del modelo son que los ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Gracias a la melodía Neely, Jon Allen, Basilea Abuaita y Donna Runft por sus esfuerzos en ayudar a desarrollar el modelo de pez cebra. La investigación divulgada aquí fue apoyada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas de los institutos nacionales de salud, números de concesión R21AI095520 y R01AI127390 (a Jeffrey H. Withey). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente las opiniones oficiales de los institutos nacionales de salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Instrument
Shaker incubadoraNew Brunswick Scientific, Edison, NJIncubadora Excella E25
NUAIRE, Plymouth, MNEspectrofotómetro de flujo
Thermo, Waltham, MAGeaesys 6
Homogeneizador de vórticeMinibeadbeater24112011
Máquina de pesajeOhaus, Columbia, MDAdventurer Pro
Heat StirerCorning, Corning, NYPC-420D
Quemador
contador de colonias automatizadoREVSCI120417B
Materiales
400 ml vasos de precipitados de vidrioPyrex
tapas perforadasSoporte de micropunta con orificios de la caja
cucharas de plástico desechables OfficeDepot, Boca Ratón, FLD15-25-7008
Sistema de tanque de pecesAquaneering, San Diego, CA
Purificador de aguaRO Aqua FXTK001
Red de pescaMarina
alimento para pecesTetra fin
Camarones en salmueraSelva roja marcaO.S.I. pro 80
espuma de poliestireno
Alfileres BisturíesHerramientas científicas
PinzasHerramientas científicas finas, Foster City, CA11223-20
herramientas, Foster City, CA15000-11
Tubos con tapón de rosca de 2 mlFisher Scientific, Hampton, NH02-681-375
Perlas de vidrio de 1 mmBio Spec11079110
Perlas de vidrio para esparcirSigma, St. Louis, MO18406-500G
Placa de PetriFisher Brand, Hampton, NHFB0875713
Tubo de centrífuga de 1,5 mlMidsci, Valley Park, MOAVSS1700
Tubo de centrífuga de 50 mlCorning Falcon, Corning, NY352098
Tubos de ensayo Pyrex9820
Pipeta de vidrioFisher Brand, Hampton, NH13675K
MicropipetasSartorius Biohit, Gö Ttingen, Alemaniam1000/m200/m20
ConsejosGenesee Scientific, San Diego, CA24-150RS/24-412
Chemicals
Instant Sales oceánicas solución salina
tamponada con fosfatoVWR Life Science, Radnor, PAK813-500ml
Tricaína (3-aminobenzoato de etilo metanosulfonato salSigma, St. Louis, MOA5040
5-Bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósidoSigma, St. Louis, MO10651745001
Schiff' s reactivo Sigma, St. Louis, MO84655-250 mL
ácido peryódicoFisher Scientific, Hampton, NH10450-60-9
Mucina del estómago porcinoSigma, St. Louis, MOM2378-100G
Albúmina sérica bovinaFisher Scientific, Hampton, NH9046-46-8
Pierce 660nm Reactivo de ensayo de proteínasThermo, Waltham, MA22660
LB medio
TryptonBD Biosciences, San José, CA211705
Extracto de LevaduraBD Biosciences, San José, CA212750
NACLFisher Scientific, Hampton, NHBP358-212
AgarBD Biosciences, San José, CA214010
AgarTCBSBD Biosciences, San José, CA265020
DCLS AgarSigma, St. Louis, MO70135-500gm
Software
Microsoft office
Prism 5
automáticode puntasTablero de finas, Foster City, CA 10000-10 Tijeras Vannas Scientific de

Referencias

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