Detección de anticuerpos que neutralizan la absorción celular de terapias de reemplazo enzimático con un ensayo basado en células

Resumen

Aquí presentamos un método de citometría de flujo basadas en células para detectar anticuerpos neutralizantes u otros factores que interfieren con la absorción celular de terapias de reemplazo de la enzima en una matriz humana, tales como líquido cefalorraquídeo (LCR) o suero humano.

Resumen

La administración de terapias de reemplazo de la enzima (ERTs) y otras terapias biológicas en pacientes pueden producir una inmunorespuesta contra las drogas. La caracterización de estos anticuerpos contra la droga (ADA), especialmente aquellos que pueden neutralizar la actividad biológica de la droga, denominada anticuerpos neutralizantes (NAbs), es crucial para entender los efectos de estos anticuerpos en la droga perfil farmacológico. Este protocolo describe un método de citometría de flujo basadas en células para detectar factores que neutralizan la absorción celular de un representante de ERT lysosomal en matriz humana. El protocolo consta de tres procedimientos: proyección, un paso de confirmación, título ensayos para detectar, identificar y establecer el nivel relativo de neutralización de título de anticuerpos en muestras de materia.

En este método, las muestras son mezcladas con el producto ERT conjugados fluoróforo primero incubaron con células [por ejemplo, los linfocitos T humanos (células de Jurkat)] que expresan un receptor de 6-fosfato de manosa de cación independiente de superficie de la célula (CI-M6PR), y por último, se analizaron con un citómetro de flujo. Una muestra sin NAbs dará lugar a la absorción de los conjugados fluoróforo ERT producto vía CI-M6PR, considerando que, la presencia de NAbs se unen a la droga interfiere con el atascamiento de CI-M6PR y absorción. La cantidad de la ERT conjugados fluoróforo internalizado por las células de Jurkat es medida por citometría de flujo y evaluada como la inhibición de la señal de porcentaje (%) en comparación con la respuesta obtenida en presencia de una matriz representante drogas con anterioridad. En la etapa confirmatoria, las muestras son previamente incubadas con bolas magnéticas conjugado con ERT a agotar los factores específicos de drogas que se unen a la droga (como NAbs) antes de una incubación con las células. Entonces en serie se diluyen las muestras que de la pantalla y confirman positivo de NAbs droga-específicas en el análisis para generar un título de anticuerpos. Títulos de anticuerpos semi-cuantitativo pueden ser correlacionados con medidas de eficacia y seguridad de la droga.

Introducción

Evaluación de la inmunogenicidad es una parte importante de la seguridad y eficacia de monitoreo para cualquier producto terapéutico biológico, incluyendo ERTs. Los pacientes pueden desarrollar una respuesta inmune que puede afectar directamente la droga seguridad, eficacia y perfiles farmacocinéticos/farmacodinámicos. Un subconjunto de estos ADA, llamado NAbs, puede inhibir la eficacia de la terapia de sustitución de dos maneras: a través de la inhibición de la absorción ERT en la celda objetivo o mediante la inhibición de la actividad catalítica de la ERT. El método presentado aquí está diseñado para medir NAbs que interfieren con la absorción ERT en las células. Para controlar totalmente la seguridad y eficacia de la terapia de sustitución terapéutica, monitoreo continuo de NAbs es crucial para dilucidar cualquier posibles correlaciones con los resultados clínicos o efectos farmacodinámicos¹.

Plataformas para la evaluación de NAbs contra proteínas terapéuticas incluyen la actividad enzimática celular y ensayos de ligando¹. La plataforma de ensayo óptimo se selecciona de acuerdo con diversos criterios: el mecanismo de acción del producto terapéutico, la sensibilidad del ensayo plataforma, selectividad, precisión y lo que es importante, su capacidad para imitar la acción inhibitoria de atrapó en vivo . Ensayos de unión a ligando pueden ser apropiados en ciertos casos (por ejemplo, cuando una línea celular relevante no puede ser identificada o si no puede lograrse la sensibilidad apropiada en un análisis basado en la célula). Sin embargo, en el proyecto 2016 FDA guía para documento de industria y otros documentos aceptados en el sector, NAb celulares ensayos se recomiendan porque puede mejor reflejan el mecanismo biológico de la droga en vivo^{1,2 , 3}.

Los componentes críticos para el desarrollo de un análisis de NAb celular citometría de flujo incluyen una línea de celular adecuado que responde a la estimulación de drogas, un sustituto positivo-control NAb que neutraliza la ERT, un ERT conjugados fluoróforo y la especie de la prueba biológica matriz^4,5,6. La selección de la línea de la célula es dependiente sobre el mecanismo de acción de ERT y múltiples líneas celulares deben ser evaluadas durante el ensayo de desarrollo³. En el método descrito aquí, las células de Jurkat T humanas fueron seleccionadas para su expresión CI M6PR endógeno en la superficie celular y la falta de receptores del fragmento anticuerpo (TCAs) que se unen indistintamente la región Fc de la mayoría de anticuerpos^7,8 . Durante el desarrollo del ensayo, es importante establecer un control negativo para los estudios de validación y la muestra del paciente pruebas, como el suero de individuos que no han sido tratados con el artículo de prueba¹. Líneas celulares también deben tolerar las matrices de diferentes especies para la continuidad en las distintas etapas no clínicos y clínicas post-marketing de drogas desarrollo¹. Otro componente es la selección del control positivo del ensayo. El control positivo para el ensayo de absorción celular ERT fue elegido basado en su capacidad para enlazar la terapéutica y neutralizar la absorción a través de CI-M6PR^9,1. A menudo es difícil obtener cantidades útiles o sostenibles de antisueros neutralizantes de seres humanos para su uso como un control de análisis, especialmente en poblaciones de pacientes de enfermedades raras². Alternativas incluyen antisueros de animales hiper inmunizados o purificados por afinidad policlonales o monoclonales anticuerpos con en el ensayo correspondiente de la matriz¹. Cuando se utiliza una matriz específica, es posible que factores inhibitorios distintos anticuerpos presentes en la matriz pueden inhibir la absorción de la ERT. Otro componente fundamental del ensayo es la ERT conjugados fluoróforo. La selección del fluoróforo para la conjugación de ERT debe ser evaluada para cada ERT, basado en necesidad del análisis de brillo, estabilidad de pH y potencial solapamiento espectral en otros canales en el citómetro de flujo.

El ensayo descrito aquí es un ejemplo para la medición de un NAb a una proteína terapéutica, como una terapia de sustitución, que entra en la célula vía CI-M6PR. Varios ERTs, destinadas a tratar los trastornos de depósito lisosomal (LSDs), utilizan esta vía para la captación celular y lisosomal focalización, incluyendo alfa de elosulfase para el síndrome de Morquio A, cerliponase alfa para la enfermedad de Batten CLN2, agalsidasa alfa para la enfermedad de Fabry, y alglucosidase alfa para la enfermedad de Pompe^10,11. El propósito de este método es medir los niveles relativos de NAbs que interfieren con la droga vinculante e internalización vía M6PR CI. Esto se realiza en los niveles de detección, confirmación y titulación pasos³. Muestras son evaluadas primero para positividad de NAb y luego confirmó la positividad en el paso de confirmación. Finalmente, las muestras que de la pantalla y confirman positivo pueden diluirse en serie para generar un título del anticuerpo del¹. Este ensayo de absorción celular flujo cytometry drogas proporciona un método sensible y mecánico relevante en vitro de medición NAbs de drogas específicas que pudieran afectar el perfil farmacológico de un medicamento. Anteriormente el método validado y había probado muestras clínicas utilizando esta plataforma para la droga elosulfase alfa⁸. Aquí describimos el protocolo paso a paso detallado que puede aplicarse a otras proteínas terapéuticas o ERTs.

Protocolo

Matrices humanas fueron adquiridas de fuentes comerciales con la aprobación de su Junta de revisión institucional (IRB) pero deben ser tratados como potencialmente infecciosos. Asegurarse de que el entorno de laboratorio utilizado mantenga una cultura de seguridad¹².

1. antes de iniciar el ensayo

1. Preparar estreptavidina conjugada ERT granos magnéticos según las instrucciones^{13 el fabricante}.
2. Preparar muestras de control de calidad (QCs): spike un anticuerpo de control positivo (PC) (p. ej., un NAb) en la matriz específica(por ejemplo, los CSF o suero).
   Nota: Orientación de la FDA y la EMA recomienda preparar un alta y una baja del control de calidad para validación de ensayo y pruebas^1,14de rutina.
   1. Por ejemplo, para obtener un control de calidad en 10 μg/mL, añadir 10 μl de control positivo de stock de 1 mg/mL en 990 μl de la matriz correspondiente (por ejemplo, CSF) para un volumen total de 1000 μl.
   2. Alícuota las muestras de control de calidad en un volumen adecuado para un solo usan (por ejemplo, 50 μL) y congelan las alicuotas a -60 a-80 ° C¹.
   3. Alícuota un corte-punto-control (CC), matriz específicos no tratado con el artículo de prueba(por ejemplo, los CSF o suero) de un solo uso (p. ej., 50 μL) y congelar las alicuotas a -60 a-80 ° C¹.
3. Llevar a cabo una reacción de Conjugación entre el fluoróforo y la ERT utilizando un kit de etiquetado de proteínas según protocolo^{15 el fabricante}. Alícuota la muestra en un volumen adecuado para un solo uso (por ejemplo, 50 μL) y congelar las alicuotas a -60 a-80 ° C.

2. día 1: Galjanoplastia de la célula y preparación de la muestra

1. Preparación de las placas de la célula
   1. Utilizar una campana de cultivo de tejidos y mantener un ambiente aséptico para los siguientes pasos. Rocíe cada objeto que será colocado en la campana con etanol al 70% y mantener un ambiente limpio^16,17,18.
   2. Caliente el medio de crecimiento de la célula (e.g., RPMI-1640 con 10% fetal bovino suero y 1% penicilina-estreptomicina) en un baño de agua o grano a 37 ° C¹⁹.
   3. Células de Jurkat cuenta el humano T linfocitos y placa 100 μl por pocillo en 7.5 x 10⁵ células/mL en un fondo redondo 96 pocillos célula placa de cultivo apropiada para el uso en un citómetro de flujo equipado con un cargador de la placa.
      1. Por ejemplo, utilizar un hemocitómetro o un contador de células automatizado para contar las células^20,21.
      2. Asegurar que las células tienen por lo menos 70% viabilidad antes de proceder con el experimento (por ejemplo, evaluar la viabilidad con la tinción de azul de tripán)¹⁷.
   4. Incubar las células en una incubadora de 37 ° C con 5% CO₂ y 95% de humedad durante la noche por 14-20 h.
2. Preparación de la muestra de investigación
   1. Diluir al tema o análisis de muestras de control de medios libres de suero (por ejemplo, RPMI-1640). En el método de ejemplo aquí, diluya las muestras 1: 2.5 en RPMI-1640 añadiendo 60 μL de la muestra a 90 μl de medio sin suero. (por ejemplo, tiras de 8 tubos). Continúe con el paso 3.1 el procedimiento de ensayo preparar un fluoróforo ERT.
      Nota: La dilución de 1: 2.5 fue determinada experimentalmente y es óptima para el método presentado aquí. Diluciones de la muestra óptima deben ser determinadas para cada método que se desarrolla.
3. Confirmación del grano y muestra la preparación de
   1. Calcular el número de conjugados de ERT granos necesaria para las muestras de confirmación.
      1. Por ejemplo, para 10 muestras, utilice 10 μl de las muestras x 100 de perlas ERT conjugado por ejemplo + 30% adicional para compensar cualquier pérdida durante el paso de lavado = 1.300 μL de conjugado con ERT granos.
   2. Vórtice los granos completamente. Añadir el número calculado de granos a un tubo cónico de 15 mL por lavado.
   3. Lavar las bolas magnéticas conjugado con ERT agregando 1.300 μL de tampón de unión o según lo sugerido por el fabricante (por ejemplo, con solución salina con tampón fosfato con 0.1% polisorbato 20) siguiendo los pasos por debajo de¹³.
   4. Vórtice el tubo completamente. Coloque el tubo en una gradilla para tubos magnéticos por 2 min. Sin molestar a los granos, cuidadosamente aspirar y descartar el sobrenadante.
      Nota: La solución cambiará de color café oscuro a claro cuando los granos se tiran al imán.
   5. Resuspender los granos con 1.300 μL de tampón de Unión. Repita los pasos de lavado para un total de cuatro lavados.
   6. Después del último lavado, suspender las cuentas de 1.300 μL de tampón (previamente calculado en el paso 2.3.1.1) de Unión. Añada 100 μl por pozo para un 96 pocillos, blanco, fondo redondo, placa de polipropileno no vinculante según el mapa de la placa (por ejemplo, una confirmación bien por muestra o del control de calidad; la voluntad de la muestra se divide en duplicados cuando se incuban con el fluoróforo ERT).
   7. Coloque la placa en un imán de lado bordeado de 96 pocillos y permitir que los granos formar un pellet. Cuidadosamente aspirar el sobrenadante y deséchelo.
      Nota: La solución cambiará de oscuro marrón claro después de aproximadamente 1 – 2 min en el imán bordeado de lado. Los granos obtenidos se llaman los granos "secos".
   8. Si las muestras examinados positivas y están siendo confirmadas, añadir 100 μl de cada muestra con y sin granos conjugado de ERT en caso/asignado bien. Sellar la placa con una capa de plástico y agite por un mínimo de 60 min en un agitador rotatorio a aproximadamente 800 rpm a temperatura ambiente (RT).
      Nota: Previamente preparados y congelados positivo y negativo QCs y el CC deben incluirse en cada placa.
   9. Después de la incubación, coloque la placa confirmatoria en el imán de lado bordeado de 96 pocillos y permitir que los granos formar un pellet.
4. Preparación de la serie de dilución de título
   1. Para preparar una serie de título, en serie diluir la muestra en la matriz agrupada un número suficiente de veces para cruzar el título predeterminado del corte del punto¹.
   2. Por ejemplo, mezclar 30 μl de la muestra con 60 μL de matriz agrupado en una serie de diluciones de 1:3 para un total de 8 diluciones (por ejemplo, tiras de 8 tubos). Continúe con el paso 3.1 el procedimiento de ensayo preparar ERT fluoróforo.

3. día 1: Procedimiento del ensayo

1. Preparar el fluoróforo ERT en el medio libre de suero (por ejemplo, 60 μL por pozo, o aproximadamente 6 mL/placa).
   1. Por ejemplo, para preparar 10 mL de 1 μg/mL fluoróforo ERT, añadir 10 μl de 1 mg/mL stock ERT fluoróforo a 9,99 mL de medio sin suero (p. ej., RPMI-1640).
2. En una nueva incubación placa (p. ej., placa de polipropileno de 96 pocillos, fondo redondo, blanca no vinculante), añadir las muestras preparadas del paso 2.2, 2.3 o 2.4 y un fluoróforo ERT en una mezcla 1:1 en pocillos duplicados (por ejemplo, transferir 60 μL de cada uno preparada la muestra y añadir 60 μL de la ERT fluoróforo por pozo).
   Nota: Un mapa de la placa del experimento de ejemplo se proporciona en la figura 1.

Figura 1: ejemplo de un diseño de placa experimento. Muestras y un fluoróforo ERT se incubaron toda la noche a 2 – 8 ° C. Controles como control de calidad (HQC), control de baja calidad (LQC) y control de calidad negativo (NQC) fueron examinados y confirmados en esquinas opuestas de la placa para evaluar la uniformidad de la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Mezcle las muestras y la ERT fluoróforo mediante pipeteo arriba y abajo varias veces con una pipeta multicanal. Envuelva las placas en el papel e incúbelos durante la noche a 2 – 8 ° C por 14 a 20 h.

4. día 2: Añadir las muestras preparadas a las células

1. Retire la placa de incubación de la muestra de la incubación a temperatura de 2 – 8 ° C y caliente las placas colocándolos en un baño de grano a 37 ° C por 10 – 15 minutos.
2. Eliminar las células de la incubadora de CO₂ . Realizar una inspección visual de las células plateadas usando un microscopio invertido para asegurar que las células aparecen sanos y distribuido uniformemente a través de los pozos^17,19.
3. Añadir 100 μl de las muestras previamente mezcladas y ERT fluoróforo a una placa de células según el mapa de placa experimental.
4. Coloque la placa de la célula con las muestras de agregado en la incubadora de CO₂ a 37 ° C. Incube la placa para 3 h y 15 min.
   Nota: Este tiempo se estableció en el laboratorio como óptimo para la respuesta de señal a ruido en el ensayo.
5. Centrifugar la placa de la célula durante 6 min a 320 x g en una centrífuga de mesa 14 – 18 ° c. Confirmar la presencia de un precipitado de células en la parte inferior de los pocillos de la placa.
6. Sostener la placa en un ángulo de 30 – 45°. Retire con cuidado el sobrenadante de cada pozo sin perturbar el sedimento celulares. Añadir 200 μL de 1 x DPBS en el precipitado de células en cada pozo para resuspender las células.
7. Repita la célula lavado pasos para un total de 3 lavados. Proceder de inmediato al paso 5 para la tinción de viabilidad celular.

5. día 2: Tinción de viabilidad de la célula

1. Usando una pipeta multicanal, añadir 100 μl de una solución de trabajo de 1 x mancha vivos o muertos a cada pocillo, seleccionado para una longitud de onda de emisión distinta a la de la ERT fluoróforo y preparado según las instrucciones de los fabricantes²².
2. Incubar la placa por 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar la placa durante 6 min a 320 x g en una centrífuga de mesa 14 – 18 ° c.
3. Retire con cuidado el sobrenadante de cada pozo sin perturbar el sedimento celulares. Lavar las células 1 x con 1 x DPBS.

6. día 2: Fijación de las células con paraformaldehído al 1%

1. Usando una pipeta multicanal, añada 100 μl de refrigerados (a 2 – 8 ° C) 1% paraformaldehido (PFA) en cada pocillo.
2. Sellar las placas y suavemente pulso vortex para mezclar. Envuelva la placa en el papel y colóquelo a 2 – 8 ° C durante al menos 10 minutos para permitir la fijación.
   Nota: Tenga cuidado para evitar salpicaduras en el sello de placa.
3. Añadir 50 μl de 1 x DPBS en cada pocillo con una pipeta multicanal hacia arriba y hacia abajo antes del análisis.

7. flujo Cytometry

1. Coloque las placas en el citómetro de flujo con el cargador de la placa y ejecutarlos.
2. Adquirir y registrar la intensidad de fluorescencia media medida (MFI) utilizando el software de citometría de flujo (véase Tabla de materiales).
   Nota: Vea la figura 2 como un ejemplo para la configuración del cargador. La tasa de flujo de muestra, volumen de la muestra, mezcla de volumen, mezcla velocidad y número de mezclas están optimizados para este ensayo. Estos criterios pueden ajustarse usando los botones "flechas para arriba" o "abajo" al lado de los números para cada criterio, dependiendo el flujo cytometry adquisición software²³.

Figura 2: ejemplo de la configuración de cargador de flujo citómetro. La configuración del cargador debe ser optimizada para cada ensayo que se desarrolla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Crear un citómetro análisis/puertas/parcelas como se muestra en la figura 3.
   Nota: La creación de la puerta y aplicación pueden ser diferente para cada flujo cytometry software²³.

Figura 3: estrategia de control de la citometría de flujo. Células Jurkat fueron separadas de los eventos totales y recogidas por el forward scatter (FSC) vs dispersión lateral (SSC) canales de trazar y dibujar una puerta en la población objetivo. Camisetas (las células) se separaron de Dobletes o células grandes agregados usando el área FSC (FSC-A) y FSC (FSC-H) de altura. Células vivas fueron elegidas por compuerta en negativo para una tinción de viabilidad de células de camiseta. La intensidad de fluorescencia media (IFM) se midió en células Jurkat únicas, vivo y se grafica como un histograma. Los valores MFI de las células con la absorción de drogas bloquearon (por ejemplo, HQC) y de células con control aparecen cantidades de absorción (rojo y azul, respectivamente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Excluir las células muertas a partir del análisis y grabar aproximadamente 10.000 eventos²³.

8. Análisis de datos

1. Exportar los datos (raw MFI) al software de análisis (véase Tabla de materiales).
   Nota: Dependiendo de los análisis necesarios, los siguientes análisis de datos pueden realizarse utilizando el software de análisis.
2. Calcular la media imf de pocillos duplicados (QCs y muestras) y el coeficiente de variación (% CV) para evaluar la variabilidad de la propagación de los duplicados de la media.
   
   
   
3. Para muestras y QCs que fueron evaluados en el ensayo, calcular el porcentaje señal de inhibición (% SI) en relación con la media imf de la de la matriz combinada de QCs CC.
   
4. Si es necesario, calcular los ratios de recuperación (RR) para los confirmados QCs y las muestras en relación con los valores correspondientes de la pantalla.
   

Resultados

En el primer día del método, una alícuota congelada de células Jurkat fue descongelada y plateada, y se prepararon las muestras de prueba. La figura 1 muestra un mapa de la placa de ejemplo. En el segundo día, las muestras fueron mezcladas con las células de Jurkat y se incubó a 37 ° C durante aproximadamente 3 h y 15 min. Las células fueron entonces lavadas fijo con PFA y analizaron en un citómetro de flujo. Figura 2 muestra ejemplo flujo citómetro ajustes.

La citometría de flujo compuerta estrategia fue diseñada para medir la cantidad de droga conjugados fluoróforo en vivo sola Jurkat células²⁴ (figura 3). Las células fueron separadas de los desechos mediante la elaboración de una puerta que excluye la ruina celular [generalmente, baja forward scatter (FSC)] y las células muertas [generalmente, alta dispersión (SSC)], dejando sólo en las células para análisis²⁵. Las células fueron separadas luego de racimos de célula dibujando una puerta que excluye a la zona alta de FSC y FSC baja altura²⁶. Las células fueron tratadas con una tinción de viabilidad que las células muertas o insalubres sin una membrana intacta y una puerta adicional fue creada para excluir las células muertas²². La IMF de las células vivas se utilizó para el análisis de la captación ERT conjugados fluoróforo. Como ejemplo de resultados de análisis de potencial, la matriz enriquecida con una alta cantidad de control positivo de anticuerpos contra la droga sustituta [p. ej., control de calidad (HQC)] inhibido conjugados fluoróforo absorción de ERT, dando por resultado una MFI baja de aproximadamente 300 (figura 3). En contraste, las células incubadas con la matriz en la ausencia de los anticuerpos de control positivo deben tener una mayor IMF (IMF = 37.830 en la figura 3), demostrando la aceptación de la ERT conjugados fluoróforo.

La neutralización de anticuerpos de control positivo para el ejemplo fue seleccionado basado en el mecanismo de acción de la droga (es decir, la captación ERT por CI M6PR). Un panel de fluoróforos también fue probado y comparado para ensayo óptima sensibilidad y rango dinámico¹. 5e de cypHer fue probada debido a su mayor fluorescencia en un pH ácido, que podría ser relevante para algunos ERTs como una medida adicional de focalización lysosomal de la droga²⁷. Un colorante fluorescente verde (por ejemplo, Alexa Fluor 488) y un tinte fluorescente far-red (p. ej., Alexa Fluor 647) también fueron examinados. Un ejemplo de cómo diferentes fluoróforos podría realizar se presenta en la figura 4a y 4b. En el ejemplo, el Alexa Fluor 647 ERT tuvo el mejor rendimiento debido a su sensibilidad superior (por ejemplo, el % más alto SI en la concentración más baja de la PC) y amplio rango dinámico (~ 3 órdenes de magnitud).

Figura 4: ejemplo resultados de conjugados fluoróforo-Tre diferentes. (A) durante el desarrollo del ensayo, una curva de dilución del control positivo (PC) debe evaluarse utilizando diferentes conjugados fluoróforo ERTs. En el ejemplo mostrado aquí, dos conjugados fluoróforo ERTs (5e Alexa Fluor 488 y CypHer) 6.25 μg/ml y un brillante ERT conjugados fluoróforo (Alexa Fluor 647) 1,56 μg/ml fueron analizadas en presencia de aumento de las concentraciones de NAbs de control positivo. (B) este panel muestra las curvas de panel A graficar, usando MFI para mostrar el aumento significativo en el rango dinámico con un ERT Alexa Fluor 647-conjugados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El método descrito es un enfoque en niveles para detectar, confirmar e interpolando un nivel cuasi-cuantitativo de NAb título³. Para establecer el ensayo está listo para su validación, los parámetros incluyendo análisis de sensibilidad, precisión, selectividad, especificidad, tolerancia de droga, robustez, y puntos de corte deben ser evaluados según establecido guidances^1,3 .

Las muestras se consideraron potencialmente positivas en este ensayo cuando se obtuvieron valores de % SI mayores que la proyección corta punto (SCP). El SCP se determinó estadísticamente drogas ingenuas muestras de una población representativa y midiendo una disminución relativa de la señal de intensidad (SI)³. Orientación (por ejemplo de la FDA) recomienda que el SCP se establece en el 95^º percentil del conjunto de datos normalmente distribuido, y métodos para el cálculo del SCP, han sido descritos en detalle en otra parte¹. Cualquier muestra que disminuye la señal de ensayo (medida como un incremento en el % SI) o por encima del SCP fue determinada ser potencialmente positivo y las muestras con resultados superiores al SCP (no cambio o disminución en % SI) se consideran negativas.

Muestras positivas (% SI el SCP) que fueron probadas en el ensayo confirmatorio para determinar la especificidad de los NAbs a la ERT. El análisis confirmatorio se realizó incubando las muestras con bolas magnéticas conjugado con ERT para remover anticuerpos específicos a la droga o factores inhibitorios. El RR (la proporción de IMF confirmatoria para detección MFI) fue evaluado para determinar que el número de NAbs extraído de la muestra. Un RR mayor que el umbral calculado de positividad [es decir, el punto de corte confirmatorio (CCP)] indica la presencia de NAbs de lucha contra las drogas. Como en el análisis de la proyección, el PCCh primero debe establecerse mediante la evaluación de tratamiento de muestras de una población representativa en el análisis confirmatorio. PCCh se basó en una tasa de falsos positivos estadísticamente determinada de 1% y fue el umbral que designa una muestra positivamente confirmada (figura 5)³.

Las muestras que se examinaron y se confirmaron la positividad en serie se diluye y probadas en el ensayo de titulación para determinar el nivel relativo o título de NAbs en cada muestra. La dilución más alta en la que una muestra de prueba positiva cuando se cruzó un umbral designado [por ejemplo, el título de corte punto (TCP)] es el título (figura 5) muestra^1,3.

Figura 5: muestra de ejemplo, resultados de las pruebas. Estos paneles muestran ejemplos de las muestras que probaron positiva o negativa por la investigación ya sea encima o debajo de un SCP de 17.51% SI. Luego se analizaron muestras positivas en el ensayo confirmatorio mediante bolas magnéticas conjugado de droga a agotar el anticuerpo específico de drogas de las muestras antes de la prueba en el ensayo. Muestras con un ratio de recuperación (RR) mayor que el punto de corte confirmatorio (es decir, RR = 1,315) eran considerados para ser confirmado positivo. Las muestras que se confirmaron la positividad se diluyeron hasta que la señal cruza el título point (TCP) para establecer el título (factor de dilución) en la que el resultado de la muestra es igual al título de corte punto de corte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Ensayo de repetibilidad y variabilidad fueron probados durante varios días y con más de un analista. Las QCs fueron inicialmente dispuestos en un único lote y sub-alícuotas para el uso de 1 x. En el curso de 3 d, dos analistas realizan el ensayo con varios conjuntos de QCs para demostrar la precisión del ensayo. En los datos del ejemplo mostrados, el % CV de la precisión intra - e Inter-ensayo para las QCs son inferiores a la recomendación de la dirección de la FDA de % CV < 20% (figura 6)¹.

Figura 6: ejemplo de control de calidad precisión datos generados durante tres días con dos analistas de. Los datos de precisión se calcularon mediante un análisis de varianza (ANOVA) utilizando la fórmula presentada en el DeSilva et al. ²⁸. la intra-lote (en carreras) y lotes inter (entre) las estadísticas se divulgan como % CV haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Anticuerpos neutralizantes u otros factores que impiden la absorción ERT por CI M6PR tienen el potencial de afectar la seguridad o eficacia ERT¹. Por lo tanto, es importante evaluar NAbs en muestras de materia mediante un modelo robusto correspondiente al mecanismo de la droga de la acción. Nosotros y otros hemos encontrado que el rendimiento de algunos formatos de la prueba biológica (por ejemplo, la dimerización del receptor, expresión de luciferasa, etc.) no se alinea con las recomendaciones de la autoridad de salud para el ensayo de precisión, sensibilidad y reproducibilidad ²⁹. en el método de prueba descrito aquí, las células Jurkat que expresan endógenos CI-M6PR se emplean para monitorear NAbs específicas para la captación lisosomal de ERT. Combinado con una lectura de citometría de flujo, este ensayo utiliza un modelo fisiológico de la célula con alto rendimiento, sensibilidad, reproducibilidad y precisión ensayo adecuado. NAb la detección con un flujo cytometry lectura también se ha aplicado a otras indicaciones. Por ejemplo, han desarrollado métodos para detectar anticuerpos preexistentes contra hepatitis E y virus adeno-asociado (AAV)^30,31.

Pasos críticos en el protocolo incluyen seleccionar un fluoróforo adecuado, incorporando un LQC que monitores análisis sensibilidad, asegurando un nivel suficiente de viabilidad celular y mantener la estricta observancia de los tiempos de incubación. En el ejemplo presentado aquí, fluoróforos (p. ej., Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647 y CypHer 5e), conjugan con un ERT lysosomal, variada ampliamente en su desempeño. Alexa Fluor 647, que era también el más brillante de fluoróforo probado³², fue seleccionado para el desarrollo adicional del ensayo. Recomendamos evaluar varios fluoróforos temprano en el desarrollo del ensayo para proporcionar la mayor sensibilidad y rango dinámico. Sensibilidad del ensayo durante la prueba de la muestra debe ser vigilado por incluyendo un LQC que está lo suficientemente cerca al límite de sensibilidad que fracase en el 1% de la prueba de carreras¹. Junto con la HQC la LQC también actúa como una conveniencia de sistema control de calidad para controlar la deriva de análisis en tiempo de³. Rendimiento y viabilidad celular óptima se logra preparando un banco de células de alícuotas de un solo uso y calificación de los bancos nuevos de la célula basados en control de calidad comparables resultados de^3,18. Célula y tiempos de incubación conjugados fluoróforo drogas también son fundamentales para un funcionamiento de ensayo consistente ya que aumenta la absorción de drogas con la cantidad de tiempo que la droga se incuba con las células. Para minimizar la variabilidad día a día en la absorción de drogas, datos de muestra pueden normalizarse a las muestras de control de matriz agrupados en cada plato (por ejemplo, las muestras de control de punto de corte en el método anterior). Otro factor importante en la producción de datos consistentes con este método es supervisar la uniformidad de la placa y minimizar los posibles efectos de borde. Un experimento inicial puede incluir realizar el análisis usando un solo control de calidad en toda la placa entera, mientras que experimentos más robustos pueden realizarse durante el ensayo validación (por ejemplo, precisión y exactitud)¹. Esto demuestra la importancia de la placa mapa diseño³³. Como se muestra en el ejemplo de mapa de la placa, las muestras de control de calidad colocan a ambos lados del monitor de la placa de una uniformidad que puede rastrearse en el tiempo con gráficos de Levey-Jennings³⁴.

Mientras que este ensayo controla NAbs y otros factores que pueden inhibir la absorción ERT lysosomal, adicional puede realizar experimentos para confirmar una inhibición de la absorción debido a los anticuerpos. Una opción es tratar las muestras con la proteína A/G/L, que no específica se une a la inmunoglobulina³⁵. Si las muestras siguen un resultado positivo después de agotamiento A/G/L de proteína, un factor inhibitorio del anticuerpo no puede ser responsable de bloquear la absorción de la droga. El método descrito aquí fue diseñado para medir la inhibición de la absorción mediada por anticuerpos y el control positivo y otro ensayo de parámetros deben ser reconsiderados si se encuentra un alto porcentaje de muestras tema con factores inhibitorios no anticuerpo.

El ensayo puede caracterizarse más para demostrar los tráficos de droga fluoróforo en el compartimento celular adecuado basado en mecanismo de la droga de acción. En el ejemplo presentado aquí, se espera un ERT M6PR CI se unen en la superficie celular y tráfico al lisosoma. Divulgamos previamente los resultados de varios experimentos que indican casi la totalidad de la señal fluorescente observada en los resultados del método de fluoróforo ERT en el lisosoma⁸. Encontramos que la señal ERT fluoróforo fue eliminada tras un tratamiento de las células con citocalasina B, que interrumpe la internalización a través de la inhibición de la reorganización de la actina. Además, experimentos que apagó el fluoróforo externo con azul de tripán o lenta internalización mediante la colocación de las células a 4 ° C, indican que la ERT fluoróforo es interiorizado rápidamente y muy poca fluorescencia es debido a un ERT limitado en la superficie celular. Lisosomal focalización fue confirmado por visualización de la co-localización de tinte pH-sensible lysotracker con la droga conjugados fluoróforo mediante microscopía confocal. Una especificidad de absorción a través de CI-M6PR también puede ser verificada usando M6P exógeno para competir con medicamentos etiquetados para el atascamiento del receptor. Experimentos similares se deben realizar para verificar la cinética de absorción y la localización celular de fármacos conjugados fluoróforo en otros ensayos.

Esta plataforma de análisis basadas en celdas se ha utilizado para estudiar NAbs para drogas terapéuticas que utilizan CI M6PR endocitosis mediada por receptor. Recientemente reportamos resultados usando esta plataforma de ensayo que no demostrado ninguna correlación entre el desarrollo de una eficacia NAb y drogas elosulfase alfa^36,37. Para validar el ensayo clínico muestra pruebas, los parámetros, incluyendo análisis de sensibilidad, precisión, selectividad, especificidad, tolerancia de droga, robustez y puntos, de corte debe ser evaluados según guías establecidas^{3, 4}. también cabe señalar, de ERTs lysosomal, que NAbs puede desarrollar con el potencial de interferir con la actividad de drogas mediante el enlace de cerca el sitio catalítico de la enzima. En general, consideramos que este tipo de NAb a ser de menor prioridad desde el ambiente áspero de ácidos y proteolítico de los lisosomas no es favorable a anticuerpo-ERT interacciones^2,39,40de monitoreo. Sin embargo, es posible que NAbs proteolítica-resistente y puede inhibir la porción catalítica de una droga de⁴⁰. Este ensayo monitores fluoróforo ERT la absorción y el lisosoma, una limitación del análisis es la incapacidad para controlar NAbs proteolítica resistente. Si se sospecha este tipo de NAb basado en datos de eficacia o seguridad, un ensayo que supervisa la actividad del ERT debe desarrollado y utilizado para muestras de ensayo.

La evaluación de la inmunogenicidad es importante en la comprensión de los efectos de NAbs en eficacia y seguridad de la droga. La identificación de NAbs capaz de inhibir en vitro fármacos absorción vía CI-M6PR ofrece una oportunidad para la comprensión de la actividad de NAb en vivo. El método presentado aquí utiliza una línea celular humana que expresa M6PR de CI para medir la interferencia de la absorción celular de conjugados fluoróforo lysosomal ERT. Este método ya se ha utilizado para monitorizar NAbs ERTs varios destinados a tratar enfermedades lysosomal del almacenaje. Esta plataforma de ensayo puede aplicarse a otros métodos para estudiar los efectos de NAbs terapéutica biológica que requieren una internalización celular para su correcto funcionamiento.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
0,22 y micro; unidad de filtro m, matraces de filtro al vacío de 500 ml	Corning	CLS430769
Placas de cultivo de 96 pocillos de fondo redondo	Thermo-Nunclon	163320
Depósitos de reactivos estériles	VistaLab	3054-1004
placa de microplaca de poliestireno de fondo redondo blanco de 96 pocillos	Corning	3605
Tubos de polipropileno de 96 pocillos, tiras de 8 tubos	Corning	4408
Bastidor de tubos separador de talón magnético	V& P Scientific, Inc	VP 772F2M-1, VP 772F2R-2, VP 772F2R-3
DynaMag -2 Imán	Thermo Fisher Scientific	12321D
DynaMag -96 Imán con faldón lateral	Thermo Fisher Scientific	12027
BD FACSCanto II Citómetro de flujo	BD Biosciences
alto rendimiento (HTS)	BD Biosciences
Contador de células automatizado BioRad TC20 Agitador	BioRad	1450103
	VWR	12620-928
Microcentrífuga Galaxy MiniStar	VWR	C1413
incubadora de CO2	Nuaire	NU-4750
Cabina de bioseguridad	Labcono	Purifier Cell Logic +
Jurkat Cell Line	ATCC	TIB152 y comercio;
Alexa Fluor 647 Kit de etiquetado de proteínas	Thermo Fisher Scientific	A20173
Dynabeads M270 Streptavidin	Thermo Fisher Scientific	65306
EZ-Link NHS-LC-LC-Biotina	Thermo Fisher Scientific	21343
RPMI-1640 1x	Medium Life Technologies	A10491-01-500mL
Suero fetal bovino (FBS)	ATCC	30-2020
Pen-Strep (100x) formulación líquida	Corning	30-002-CI
1x DPBS sin calcio y magnesio	Corning	21-031-CV
4% Paraformaldehído Ciencia de	la Microscopía Electrónica	15735-85
VIVO/MUERTO Kit de tinción de células muertas violetas fijables, para excitación de 405 nm	Life Technologies	L34955
Tween 20	Sigma	P1379-100mL
Albúmina de suero bovino	Sigma	3059
Matriz humana agrupada (p. ej. suero humano o líquido cefalorraquídeo)	Biorrecuperación IVT	solicite un presupuesto en el sitio web
Película de placa de poliéster VWR	VWR	60941
Seal & Muestra de papel de aluminio	Beckman Coulter	538619