Artículo de método

Análisis unicelular de Immunophenotype y producción de citoquinas en sangre periférica por citometría de masas

DOI:

10.3791/57780

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26 de junio de 2018

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1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2OMNI Biomarkers, Development Sciences, Genentech, 3Department of Pediatrics, Division of Allergy and Immunology, University of Colorado School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos un enfoque proteómico unicelular para evaluar inmunológico fenotípico y funcional (inducción de citocinas intracelulares) alteraciones en las muestras de sangre periférica, analizadas mediante citometría de masas.

Resumen

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Las citoquinas juegan un papel fundamental en la patogénesis de enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, la medición de los niveles de citocinas ha sido objeto de múltiples estudios en un intento de comprender los mecanismos precisos que conducen a la ruptura de la autotolerancia y autoinmunidad posterior. Enfoques hasta el momento se han basado en el estudio de un aspecto específico del sistema inmune (un solo o pocos tipos celulares o citocinas) y no ofrecen una evaluación global de la enfermedad autoinmune complejo. Mientras que estudios de sueros de pacientes han producido penetraciones importantes en autoinmunidad, no proporcionan la fuente celular específica de las citocinas de desajuste detectadas. Aquí se describe un enfoque integral de unicelular para evaluar la producción de citoquinas en varios subconjuntos de células inmunitarias, dentro del contexto de "intrínseco" específico para cada paciente de plasma factores de circulación. Este enfoque permite la monitorización de la paciente específico phenotype inmune (marcadores de superficie) y función (citoquinas), ya sea en su natural "intrínseca patógenos" enfermedad estatal, o en la presencia de agentes terapéuticos (in vivo o ex vivo).

Introducción

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Las enfermedades autoinmunes son una causa importante de morbilidad y mortalidad que afecta a 3-8% de la población. En los Estados Unidos, trastornos autoinmunes se encuentran entre las principales causas de muerte entre las mujeres jóvenes y de mediana edad (edad < 65 años)1,2. Enfermedades autoinmunes se caracterizan por la presentación clínica heterogénea y los diversos procesos inmunológicos subyacentes. El espectro de la heterogeneidad del bien es representado a través de diferentes trastornos, como la participación conjunta en la artritis reumatoide (ar) y enfermedades neurológicas en la esclerosis múltiple (MS). Sin embargo, este nivel de heterogeneidad se ejemplifica también dentro de un desorden único, como el lupus eritematoso sistémico (les): algunos pacientes pueden presentar con patología renal, mientras que otros sufren de implicación hematológica o común3.

La inmunopatogénesis subyacente en los trastornos autoinmunitarios refleja la heterogeneidad clínica, con auto y hyper-activación de múltiples subconjuntos de la célula inmune innata y adaptativa y producción de citoquinas desregulación concomitante. Mientras que las citoquinas juegan un papel fundamental en la patogenia de la enfermedad autoinmune, entender su papel específico en el mecanismo de la enfermedad ha demostrado para ser un reto. Citocinas se caracterizan por pleiotropía (una citocina puede tener múltiples efectos en diferentes tipos de células), redundancia (varias citocinas pueden tener el mismo efecto), dualidad (una citocina puede tener efectos pro o antiinflamatoria bajo diversas condiciones), y plasticidad (citoquinas pueden ser moldeadas en un papel diferente de su "original", según el medio ambiente)4,5,6. Por lo tanto, métodos de nivel de la población no pueden distinguir heterogéneas respuestas celulares a la misma «medio de cytokine". Asimismo, diseños de los estudios que se centran en un aspecto específico del sistema inmune (un solo tipo de células o citocinas), no ofrecen una valoración global de todos los elementos que intervienen en complejas enfermedades autoinmunes. Mientras que estudios de sueros de pacientes han producido penetraciones importantes en autoinmunidad, no proporcionan la fuente celular específica de las citocinas de desajuste detectadas.

Recientemente, hemos desarrollado un enfoque proteómico unicelular para evaluar simultáneamente múltiples tipos de células inmunes y detectar sus diferentes perturbaciones de citoquinas en el medio de pacientes "patógenos" plasma de la sangre periférica circulante factores específicos. El flujo de trabajo descrito aquí se caracteriza por el uso de muestras de sangre periférica intacta, a diferencia de las células mononucleares aislados de sangre periférica (PBMCs). Sangre periférica representa el vehículo más fisiológicamente relevante para el estudio de enfermedad mediada inmune sistémica, incluyendo 1) no-células mononucleares de sangre a menudo implicados en enfermedad autoinmune (es decir, neutrófilos, plaquetas) y plasma 2) circulación de factores, tales como ácidos nucleicos, complejos inmunes y citocinas, que tienen funciones de activación inmunes. Para capturar la "intrínseca patógenos" desequilibrada producción de citoquinas, las muestras son procesadas inmediatamente después del sorteo de la sangre (T0, tiempo cero) y después de 6 h de incubación a 37 ° C (temperatura corporal fisiológica) con un transporte de la proteína periférica de la sangre inhibidor en la ausencia de cualquier condición estimulante exógeno (T6, tiempo 6 h), para detectar la producción de citoquinas (acumulación, T6-T0) que refleje el estado de "intrínseco" de la enfermedad (figura 1). Para el estudio de procesos de desregulación que reflejan sobre o debajo-activación de la señalización vías implicadas en las respuestas inmunológicas pertinentes a la enfermedad, las muestras de sangre periférica son tratados (6 h de incubación a 37 ° C con un inhibidor del transporte de la proteína) con una exógena estimular la condición que refleja la patogénesis de la enfermedad, como los agonistas de Toll-Like-Receptor (TLR) en el caso de SLE (T6 + R848, tiempo 6 h con 1 μg/mL R848), para detectar la producción de citoquinas que reflejaría una respuesta a los ácidos nucleicos (comparando T0 vs T6 vs T6 + R848, figura 1). Para estudiar los efectos inmunomoduladores de la terapéutica disponible ex vivo, lo que se refiere a los procesos de desregulación inmune precisa para ciertos pacientes, muestras de sangre periférica son tratadas con un inhibidor JAK en la correspondiente terapéutico concentración (aquí, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tiempo 6 h con 5 uM ruxolitinib), para detectar cambios en el estado de enfermedad "intrínseca" en respuesta a la droga (T0 vs T6 vs T6 + 5R, figura 1). Un inhibidor JAK fue elegido para este estudio porque inhibidores de JAK se han demostrado para tener éxito en el tratamiento de trastornos autoinmunes como la RA

Evaluar simultáneamente los procesos de estabilización descritos en varios subconjuntos de células inmunitarias, muestras de sangre periférica de SLE pacientes y controles sanos se procesada como se describió anteriormente y se analizaron por citometría de masas. Citometría de masas, también denominada citometría-tiempo de vuelo, ofrece análisis unicelular de parámetros más de 40 sin problemas de espectral solapan de8,7,9. Esta técnica utiliza isótopos metal de tierras raras en forma de iones metálicos solubles como etiquetas a los anticuerpos, en lugar de fluoróforos10. Detalles adicionales sobre la plataforma tecnológica de citometría de masas (es decir, ajuste y calibración, adquisición de muestra) se pueden encontrar en Leipold et al. y McCarthy et al. 11 , 12 la alta dimensionalidad de citometría de masas permite la medida simultánea de múltiples citocinas en subconjuntos de la célula inmune innata y adaptativa con granularidad unicelular (Tabla de materiales).

Parámetros clínicos y de laboratorio convencionales actuales no son a menudo sensible o lo suficientemente específicos para la detección de actividad de la enfermedad actual o la respuesta a los inmunomoduladores específicos13, reflejando la necesidad de delimitar mejor la inmune subyacente cambios que impulsan las llamaradas. Dada la omnipresencia del cytokine dysregulation en enfermedad autoinmune, tiene una plétora de enfoques de tratamiento que utilizan anticuerpos o inhibidores moleculares pequeños contra citoquinas o señalización de las proteínas implicadas en la regulación de la producción de citoquinas recientemente surgido. En su formato básico, el enfoque analítico de sangre periférica descrito aquí proporciona una plataforma para identificar subconjuntos de la célula altera específico para cada paciente y su producción anormal de citocinas en la enfermedad autoinmune con manifestaciones sistémicas. Esta metodología permite la personalización de opciones terapéuticas como citoquinas altera específico pueden ser identificados, y tratamiento específico pueden ser opciones prueba ex vivo para evaluar su capacidad de immunomodulate el paciente enfermedad específica proceso.

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Protocolo

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Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Colorado múltiples institucional de junta (COMIRB) de la Universidad de Colorado. Todos los procedimientos descritos a continuación deben realizarse en una campana de cultivo estériles para tejidos, salvo estipulación en contrario, con las puntas de pipeta filtrada, y filtraron todos los reactivos.

1. preparación de reactivos para el procesamiento de la sangre periférica

  1. Preparar el ruxolitinib alícuotas stock (10-15 μL/vial de un solo uso) en 10 mM por diluir el Reactivo liofilizado en DMSO según las instrucciones del fabricante (conservar a-80 ° C). Mantener concentraciones de DMSO en todos los ensayos incluidos los controles sin estimular por debajo del 0.2% (vol/vol).
  2. Preparar R848 alícuotas stock (resiquimod) (10-15 μL/vial de un solo uso) en 1 μg/μL, diluyendo el Reactivo liofilizado en agua estéril como el instrucciones del fabricante. Tienda a-80 ° C.
  3. Prepare los lipopolisacáridos alícuotas stock (LPS) (5 μL por vial para un sólo uso) en 1 μg/μL diluir el Reactivo liofilizado en agua estéril siguiendo las instrucciones del fabricante. Tienda a-80 ° C.
  4. Preparar la célula tinción de medios (CSM) con PBS, 0,5% BSA y 0.02% NaN3.
  5. Adquirir y mantener listo el cóctel de inhibidor (PTI) de transporte de la proteína (Tabla de materiales).
  6. Descongelar y diluir el ruxolitinib frasco stock (10 mM) 1:10 en PBS estéril (1 mM). Dejar reposar a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejidos.
  7. Descongelar y diluir el frasco stock R848 (1 μg/μl) 1:10 en PBS estéril (0,1 μg/μl). Dejar reposar a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejidos.
  8. Descongelar y diluir el LPS frasco stock (1 μg/μl) 1: 100 en PBS estéril (0.01 μg/μl). Dejar reposar a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejidos.
  9. Caliente previamente estéril RPMI (sin L-glutamina) en un baño estándar 37 ° C (durante al menos 10 minutos).
  10. Diluir el buffer lyse/fix 1:5 en ddH filtrada2O (concentración de trabajo) en el escritorio (no necesita ser estéril).
    Nota: 1 mL de sangre entera requiere 20 mL de la concentración de trabajo de lyse/solución tampón.
    1. Hacer lyse/fix buffer 5 condiciones de 1 mL de sangre cada uno (por lo menos 100 mL). Alícuota 20 mL de la concentración de trabajo del buffer de lyse y arreglos en tubos cónicos de 50 mL por mililitro de sangre entera (mantener la solución de lyse/solución a 37 ° C hasta que se necesite). Etiqueta las condiciones en los tubos cónicos con tampón de lyse y arreglos como sigue: T0 (tiempo cero), T6 + 5R (tiempo 6 h con 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tiempo 6 h con 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tiempo 6 h con 0,1 μg/mL LPS), T6 (tiempo de 6 h).
  11. Etiqueta redonda de fondo tubos de poliestireno estéril con tapas y tubos de microcentrífuga de 1 mL con la misma nomenclatura que en el paso 1.10.

2. estimulación y procesamiento de sangre periférica (figura 1)

  1. Coloque la etiqueta redonda inferior tubos de poliestireno de paso 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) sobre una rejilla.
    Nota: Los siguientes pasos se realizan en este tipo de tubo a menos que se especifique lo contrario. Tapa los tubos cuando se transfiere entre la campana de cultivo de tejidos y la incubadora para mantener la esterilidad.
  2. Añadir 1 mL de 37 ° C RPMI (sin L-glutamina) a cada uno de los tubos (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). Invertir el tubo de la colección de sangre varias veces, añadir 1 mL de sangre a cada tubo y pipeta arriba y abajo varias veces para homogeneizar con RPMI (dilución con RPMI previene la aglutinación de la sangre durante el período de incubación de 6 h).
  3. Añada 10 μL de la 1:10 el ruxolitinib T6 + 5R. Mezclar cuidadosamente con una pipeta P1000. Coloque la rejilla de los tubos en la incubadora a 37 ° C y comenzar la incubación de la sincronización (T = 0).
  4. Procesar la muestra T0 como sigue.
    1. Pipetear todo el contenido del tubo T0 en un tubo cónico etiquetado que contiene 20 mL de tampón de lyse y arreglos de concentración de trabajo de 37 ° C. Para optimizar la recuperación de la célula, enjuague el tubo con tampón de lyse/corrección trabajo concentración. Mezclar por inversión del tubo cónico.
    2. Incubar a 37 ° C durante 15 min permitir la lisis y la fijación. Tras fijación, realice todos los pasos subsecuentes en la sobremesa. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    3. Decantar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de PBS frío hielo para romper los pellets y luego llenar la cónica a un volumen de 15 mL con PBS.
    4. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Decantar el sobrenadante. Repita el lavado PBS (medidas 2.4.3–2.4.4) si los gránulos son de color rojos. Resuspender las células en 1 mL de CSM para romper los pellets y luego transferir al tubo de microcentrífuga etiquetados (paso 1.11) para la tinción de anticuerpo. Tomar un 10 μl de muestra para contar las células usando un contador de células automatizado o hemocitómetro.
      Nota: Puesto que todas las células están fijadas en este punto, no es necesario incluir una tinción de viabilidad.
    5. Centrifugar las células a 500 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante, dejando el sedimento en ~ 60 μL de volumen residual. Mantenga este pellet en hielo hasta muestras de otras condiciones hayan completado el procesamiento.
  5. En T = 30 min, mover el portatubos (paso 2.3) a la campana de cultivo de tejidos y realice lo siguiente.
    1. Añada 10 μL de los 0,1 μg/μL R848 T6 + R848. Mezclar cuidadosamente con una pipeta P1000.
    2. Añada 10 μL de los 0.01 μg/μL de LPS a T6 + LPS. Mezclar cuidadosamente con una pipeta P1000.
    3. Agregar 4 μL de inhibidor de proteína del transporte (acciones a 500 X) T6, T6 + 5R y T6 + LPS (pero no a T6 + R848) y devolver las muestras a la incubadora hasta T = 6 h. mezcla cuidadosamente con una pipeta de P1000 cada 2 h.
      Nota: R848 es un agonista TLR endoplasmic y por lo tanto requiere un retardo temporal en la adición del inhibidor proteína de transporte para permitir el acceso a su receptor de destino.
  6. En T = 2 h, añadir 4 μL de inhibidor de transporte la proteína cóctel (acciones a 500 X) T6 + R848 tubo. Mezclar todas las muestras con una pipeta P1000 y reacomode la rejilla en la incubadora hasta T = 6 h.
  7. Mezclar las muestras con una P1000 una vez más en T = 4 h.
  8. En T = 6 h, proceso T6 T6 + LPS, T6 + R848 y T6 + 5R tubos de muestras de sangre como se describe en el paso 2.4 para la muestra T0.
  9. Almacenar los pellets de células en volumen residual del CSM a-80 ° C para procesar en una fecha futura. Como alternativa, proceda a código de barras y anticuerpo tinción sin almacenar.

3. código de barras de las células de la sangre lisada o fijo

  1. Descongelar las muestras fija lisis de la célula desde el almacenaje de-80 ° C lentamente sobre el hielo; un máximo de 20 muestras puede ser etiquetado con código de barras único y agruparon mediante este sistema. Diluir el buffer de perm X barcoding 10 1:10 con PBS; hacer suficiente amortiguamiento para ~ 3 mL por muestra.
  2. Llenar un canal no estéril con el CSM y uno con el buffer de perm X barcoding 1. Añadir 1 mL de hielo frío CSM a muestras recién descongeladas, mezclar cuidadosamente con una pipeta y transferir a los tubos respectivos cluster de polipropileno previamente etiquetados.
  3. Tome una muestra μL 10 para contar las células usando un contador de células automatizado o hemocitómetro. Normalizar el recuento a 1.5 – 2 x 106 células por muestra en cada tubo de cluster: Retire y deseche el volumen de exceso por encima de 2 x 106 células.
  4. Centrifugar las células a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Resuspender las células en 1 mL de tampón de la ondulación permanente de 1 X barcoding con una pipeta multicanal y centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar apagado el sobrenadante.
  5. Alinee los tubos de clúster en un estante en el mismo orden como se indica en la clave de código de barras para que la muestra coincide con su código de barras. Añadir 800 μL 1 X buffer de código de barras de la ondulación permanente por pipeta multicanal para todas las muestras en los tubos de clúster sin tocar el precipitado de células con las puntas de pipeta (no mezcla) para reducir la pérdida de la célula. Dejar de lado la gradilla con los tubos de cluster.
  6. Quitar 20-plex Pd Barcoding Kit tubo tiras de-20 ° C y descongelar a temperatura ambiente. Añada 100 μL de tampón de perm X barcoding 1, mezclar bien y transferir 120 μL de la mezcla de código de barras resuspendidos en las correspondientes muestras de células en los tubos de cluster.
  7. Mezclar bien con una pipeta multicanal por lo que hay no hay contaminación cruzada entre muestras de código de barras individual. Incubar tubos de racimo durante 30 min a temperatura ambiente para permitir que los códigos de barras etiquetar las células.
  8. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de CSM.
  9. Centrifugar y resuspender en CSM otra vez como en el paso 3.8.
    Nota: Cada muestra ahora se etiqueta con un código de barras único, y las muestras están listas para combinarse.
  10. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Con una sola pipeta y utilizando la misma punta, transferir todos los pellets de célula en ~ 70-80 volumen residual μL a un tubo de poliestireno. Expulsar la punta de la pipeta; dejar de lado la pipeta solo con este Consejo.
  11. Con una pipeta multicanal y puntas nuevas, añadir ~ 100 μL CSM a cada tubo de clúster original para maximizar la recuperación de la célula. Con la pipeta solo con la punta que había reservada, transferir todos pellets de células en volumen residual de ~ 100 μL al mismo tubo de poliestireno.
  12. Añadir CSM para rematar el tubo poliestireno (~ 3 mL). Conteo y registro el número del celular del código de barras combinado conjunto. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar el sobrenadante. Proceder a la coloración de las muestras con código de barras en el mismo día.
    Nota: Es normal esperar 20 – 30% pérdida de la célula en el proceso de código de barras.

4. tinción de código de barras lisis/fijo glóbulos y preparación para el análisis de citometría de masas instrumento

Nota: Cada 1 X título de anticuerpo de tinción (1 μL del anticuerpo por 100 μL de reacción de tinción), puede manchar generalmente 3-4 x 106 células. Por lo tanto, cuando todas las muestras de código de barras se combinaron en un tubo, la cantidad de anticuerpo debe ampliarse. Si 20 cantidad de muestras con código de barras 30 x 106 células, y cada título de X 1 puede manchar 3 – 4 x 106 células, la muestra de código de barras sólo requiere un 10 X título, a diferencia de la tinción de cada muestra individualmente, que requeriría una cantidad de X 20 de anticuerpo (1 X por tubo individual). La concentración de anticuerpos al numero de celular debe titularse con cuidado para cada Cóctel de anticuerpos individuales (no discutido aquí).

  1. Mancha las células con anticuerpos (Tabla de materiales) para la inducción superficial de coloración y citoquinas.
    1. Hacer la tinción superficial cóctel calculando la cantidad para ser añadido y contabilidad para error de pipeteo (es decir, si 20 muestras de código de barras de 2 x 106 células en cada muestra, la coloración 10 X mancha del título es necesario para cálculos de volumen final, compensar errores de pipeteo haciendo un 10.5 X coloración de la solución final).
    2. Agregue 10 X valor de volumen para la pelotilla de celular con código de barras la coloración de la superficie. Para reducir la pérdida de la célula, con la misma punta, mezclar y medir el volumen de las manchas superficiales y el sedimento celulares.
    3. Basado en el volumen de células y tinción de cóctel, añadir CSM a un volumen de coloración final de 50 μL por número de muestras de células (por ejemplo, si ejecuta un conjunto de 20 muestras, 50 μL X 20 = 1 mL). Incubar durante 30 min a 4 ° C. Agite la muestra cada 15 minutos para promover incluso manchas.
    4. Durante la incubación de mancha superficial, preparar el tampón de Perm/lavado (Tabla de materiales) por dilución 1:10 con ddH filtrada2O. preparar volúmenes de 2 mL para permeabilización y 5 mL para lavado. Mantener a 4 ° C o en hielo.
    5. Fuera la superficie del tubo con el CSM la coloración, y centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min aspirar el sobrenadante. Resuspender la muestra con código de barras en 2 mL de 4 ° C, 1:10 tampón de dilución de Perm/lavado. Incubar a 4 ° C durante 20-30 min a permeabilizar totalmente las células.
    6. Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min y aspirar el sobrenadante.
    7. Para la tinción intracelular, siga los pasos de tinción similares (en cuanto a la coloración superficial). Sin embargo, utilizar los 4 ° C, 1:10 tampón de dilución de Perm/lavado en lugar del CSM para hacer el total volumen de tinción para que las células permanezcan en un ambiente permeabilizing durante la tinción intracelular.
    8. Añadir el anticuerpo intracelular cóctel a la superficie manchada y permeabilized pellets celulares (medidas 4.1.2–4.1.17). Traer el total volumen de 50 μL por número de muestras de células de tinción. Incubar por 60 min a 4 ° C. Agite la muestra cada 15 minutos para asegurar incluso la coloración.
    9. Durante la tinción intracelular, preparar la solución intercalator: 900 μL de PBS filtrada + 100 μL del filtrado 16% PFA (concentración final de 1.6% PFA) + 0,2 μL de 500 uM de tinte intercalator (Tabla de materiales).
    10. Rematar el precipitado de células + anticuerpo intracelular cóctel con frío 1:10 solución de Perm/lavado.
    11. Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min y aspirar el sobrenadante. Rematar el tubo tinción con CSM. Cuente y anote el número de celular. Centrifugar a 600 x g a 4 ° C por 5 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 mL de solución intercalator paso 4.9. Incubar durante al menos 20 min a temperatura de intercalación completo, o durante la noche a 4 ° C (muestras en solución intercalator pueden permanecer a 4 ° C hasta una semana antes de ejecutar el instrumento de la citometría de masas).
  2. Preparar las células para el instrumento de la citometría de masas.
    1. Fuera el tubo con 3 mL de filtrado ddH2O y centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspender las células en 3 mL de filtrado ddH2O. pasar esta suspensión a través de un filtro μm 100 para quitar cualquier suciedad o agregados que potencialmente podrían obstruir el instrumento de la citometría de masas.
    2. Contar y registrar la filtración posterior al número de celular. Centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 ° C
  3. Preparar la solución de calibración de grano (Tabla de materiales) diluyendo 1:10 en el ddH filtrada2O.
  4. Resuspender la tinción las células en el volumen requerido del 1:10 diluyeron solución de calibración de grano para lograr una concentración celular de ~ 1 x 106 células/mL.
    Nota: Para una CyTOF1 en 45 μl/min, el óptimo recomendado es de 5 x 105 células/mL; para Helios en 30 μL/min, 7.5 x 105 células/mL.
  5. Proceder a ejecutar el ejemplo en la citometría de masas instrumento9.

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Resultados

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Figura 1 muestra el flujo de trabajo para la estimulación y procesamiento de las muestras de sangre periférica, incluyendo asignación de alícuotas de la muestra de sangre, momento de la incorporación de agentes de estimulación, proteína transporte inhibidor de Cóctel e incubación veces hasta la lisis de glóbulos rojos (gr) y la fijación. La elección de los agentes estimulantes dependerá de las vías de señalización y citoquinas que son objeto de evaluación. Po...

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Discusión

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Aquí describimos una novela, unicelular, enfoque proteómico para evaluar simultáneamente múltiples tipos de células inmunes y detectar sus diferentes perturbaciones de citoquinas en el ambiente de paciente "patógenos" plasma de la sangre periférica circulante factores específicos. Este método emplea sangre periférica como el vehículo analítico y la citometría de masas como herramienta para la evaluación de anormalidades fenotípicas y funcionales celulares inmunes. El método es fácilmente aplicable a humanos y ratones est...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a Aimee Pugh-Bernard por su entrada intelectual y comentarios útiles. Este trabajo fue apoyado por el Premio de investigación biomédica Boettcher Foundation Webb Waring y Premio número K23-1K23AR070897 de los NIH a Elena W.Y. Hsieh. Ella también fue apoyada por número de concesión HD000850 K12 del Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano y la Lucile Packard Foundation para la salud de los niños, Stanford CTSA UL1 TR001085 e investigación en salud infantil Instituto de Stanford University.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RuxolitinibSanta CruzSC-364729AStock Conc: 10 mM; Conc Final: 5 μ M
R848Invivogentlrl-r848-5Conc de stock: 1 μ g/μ L; Conc Final: 1 μ g/mL
LPS-EKInvivogentlrl-eklpsStock Conc: 1 μ g/μ L; Conc final: 0.1 μ g/mL
Estéril PBSLonza17-516F
Tampón Lyse/Fix BDbiosciences558049Stock Conc: 5X; Conc final: 1X (diluido en ddH2O)
BD Phosflow permanente/tampón de lavado IBD biosciences557885Conc de existencias: 10X; Conc final: 1:10 (diluido en ddH2O)
RPMIGibco21870-076
Azida de sodio (NaN3)Sigma-AldrichS-8032Conc de stock: >99.9%; Conc final: 0.0002
Inhibidor del transporte de proteínas (PTI)eBiosciences00-4980-93Conc de stock: 500X; Conc final: 1X
DNA IntercalatorFluidigm201192BConc de stock: 500 μ M; Conc final: 0.1 μ M
Medios de tinción celular (CSM)PBS + 0.5% BSA, 0.02% NaN3
MaxPar Código de barras Perm BufferFluidigm201057Conc de stock: 10X; Conc final: 1X
20-plex Pd Juego de códigos de barrasFluidigmS0014Conc de stock: n/a; Conc final: n/a
EQ TM perlas de calibración de cuatro elementosFluidigm201078conc de stock: 10X; Conc final: 1X
16% Solución de formaldehído libre de MeOHThermo28908Conc de stock: 16% (p/v); Precio final: 1,6% (c/v)
Tubos de poliestireno estériles de fondo redondoVWR60818-496Precio de stock: n/a; Conc final: n/a
Tubos de polipropileno LightLabsA-9001Conc de stock: n/a; Conc final: n/a
Helios CyTOF instrumentFluidigmHelios Todaslas soluciones que se utilicen en el análisis CyTOF deben estar libres de contaminación por metales. El ddH2O se utiliza en la preparación de cualquier solución debe tener una resistividad de al menos 18.0 MΩ. El ddH2O y cualquier solución preparada por uno mismo deben almacenarse en botellas nuevas de plástico o vidrio que nunca hayan sido esterilizadas en autoclave.
NombreCompanyNúmero de catálogoComentarios
Anticuerpos utilizados para la citometría de masas
Marcadores de superficie
CD1cBiolegendL161Masa: 161
CD3BDUCHT1Masa: 144
CD4BiolegendSK3Masa: 174
CD7BDM-T701Masa: 149
CD8BiolegendSK1Masa: 142
CD11bFluidigmICRF44Masa: 209
CD11cBDB-ly6Masa: 152
CD15BDHI98Masa: 115
CD14BiolegendM5E2Masa: 154
CD16eBioscience/ThermoB73.1Masa: 165
CD19Santa CruzSJ25C1Masa: 163
CD21BiolegendBu32Masa: 141
CD27BDL128Masa: 155
CD38FluidigmHIT2Masa: 172
CD45 totalBiolegendHI30Masa: 89
CD45RABiolegendHI100Masa: 153
CD56MiltenyiREA196Masa: 168
CD66BDB1.1/CD66Masa: 113
CD86FluidigmIT2.2Masa: 150
CD123Fluidigm6H6Masa: 143
CD278/ICOSBiolegendC398.4A Masa: 156
CD179/PD1BiolegendEH12.2H7Masa: 162
IgDBiolegendIA6-2Masa: 146
IgMBiolegendMHM-88Masa: 151
CXCR5BDRF8B2Masa: 173
HLADRBiolegendL243Masa: 167
Citoquinas
IL-1 y alfa;Biolegend364-3B3-14Masa: 147
IL-1 y beta;Bioleyenda H1b-98Misa: 169
IL-1RASanta Cruz AS17Masa: 157
IL-6BiolegendMQ2-13A5Masa: 164
IL-8BDE8N1Masa: 160
IL-12/IL-23p40Biolegend C8.6Masa: 171
IL-17ABiolegend BL168Masa: 148
IL23p19eBioscience/Thermo23dcdpMasa: 176
MIP1 y beta;BDD21-1351Masa: 158
MCP1BD5D3-F7Masa: 170
IFNαMiltenyi LT27:295Masa: 175
IFNγBiolegend4S. B3Masa: 165
PTENBDA2B1Masa: 159
TNF&alfa;BiolegendMab11Mass: 166
Nota: Si el fabricante indica que Fluidigm, este anticuerpo se compró a Fluidigm con metal preconjugado. Si se indica que el fabricante no es Fluidigm, este anticuerpo se autoconjugó utilizando el etiquetado multimetálico MaxPar  Kit (Fluidigm Cat: 201300) según protocolo del fabricante.

Referencias

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