Rebanadas de cerebro-pituitaria sanas para las investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en peces teleósteos

Resumen

El artículo describe un protocolo optimizado para hacer rebanadas de tejido viable del cerebro-pituitaria, mediante el medaka (Oryzias latipes), de peces teleósteos y después las grabaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias mediante la técnica de patch-clamp con la configuración de parche perforado.

Resumen

Se han realizado investigaciones electrofisiológicas de las células hipofisarias en numerosas especies de vertebrados, pero muy pocos en peces teleósteos. Entre éstos, la mayoría clara se han realizado en células disociadas de primarias. Para mejorar nuestra comprensión de las células hipofisarias como teleósteos, se comportan en un medio ambiente biológicamente más relevante, este protocolo muestra cómo preparar rebanadas de cerebro-pituitaria viables utilizando el medaka (Oryzias latipes) de pequeños peces de agua dulce. Hacer las rebanadas de cerebro-pituitaria, pH y la osmolalidad de las soluciones se ajustaron a valores que se encuentran en los fluidos corporales de peces de agua dulce viven en 25 a 28 ° C. Tras la preparación de la rebanada, el protocolo muestra cómo llevar a cabo las grabaciones electrofisiológicas usando la técnica del perforado celulares-abrazadera del remiendo. La técnica de patch-clamp es una potente herramienta con resolución temporal sin precedentes y la sensibilidad, permitiendo la investigación de las propiedades eléctricas de las células intactas todo hasta canales de iones individuales. Parche perforado es el único que mantiene el medio intracelular intacto impide elementos reguladores en el citosol se diluye por la solución de electrodo pipeta patch. En cambio, cuando se realizan grabaciones de celulares tradicionales, se observó que las células pituitarias medaka pierden rápidamente su capacidad para disparar potenciales de acción. Entre las diferentes técnicas de perforación disponibles, este protocolo muestra cómo lograr la perforación de la membrana parcheada con el fungicida anfotericina B.

Introducción

La hipófisis es un órgano endocrino clave en vertebrados situados debajo del hipotálamo y posteriores al quiasma óptico. Produce y secreta hormonas de seis a ocho de los tipos celulares específicos. Hormonas hipofisarias constituyen un intermedio entre el cerebro y los órganos periféricos y manejar una amplia gama de procesos fisiológicos esenciales, incluyendo el crecimiento, la reproducción y la regulación de la homeostasis. Similar a las neuronas, las células endocrinas de la hipófisis son eléctricamente excitables con capacidad para disparar potenciales de acción espontáneamente ¹. El papel de estos potenciales de acción es dependiente de l....

Protocolo

Manejo de los animales se realizan según las recomendaciones para el cuidado y bienestar de los animales de investigación en la Universidad Noruega de Ciencias de la vida y bajo la supervisión de investigadores autorizados.

1. preparación de instrumentos y soluciones

Nota: Todas las soluciones deben ser estériles. Debe prestarse atención cuidadosa para el pH y la osmolalidad (osmol/kg agua) de todas las soluciones, que debe ser cuidadosamente adaptada al ambiente extracelular de las especies estudiadas. pH y la osmolalidad deben ajustarse con precisión equipos electrónicos tales como medidor de pH y punto de congel....

Resultados

Este protocolo muestra un protocolo paso a paso de cómo lograr confiables grabaciones electrofisiológicas de las células de la pituitaria (gonadotrope), utilizando una línea transgénica de medaka [Tg (lhb- hrGfpII)] donde el objetivo de las células (productoras de Lh gonadotropes) están marcados con proteína verde fluorescente (GFP).

Inicialmente, se llevaron a cabo las investigaciones electrofisiológicas con configurac.......

Discusión

Las grabaciones electrofisiológicas mediante la técnica de patch-clamp en rebanadas de cerebro-pituitaria requieren cuidadosa optimización. Protocolos bien optimizados para llevar a cabo las investigaciones de células vivas en teleósteos se limitan, con la mayoría de publicaciones utilizando protocolos basados en sistemas mamíferos. En este sentido, es importante ser consciente del hecho de que varios parámetros fisiológicos como pH y la osmolalidad son no sólo las especies dependientes, pero también mucho depende de si .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Vibratome	Leica	VT1000 S
metálicos	SAKURA	4122
arpa de acero	Warner instruments	64-1417
Pipetas de parche ultrapuras LMP	agarosa invitrogen	166520-100
Sutter	Instrument	BF150-110-10HP	Borosilicato con filamento Diámetro exterior:1,5 mm, diámetro interior:1,10 mm
Microscopio Slicescope Scientifica		pro6000
P-Clamp10	Molecular Devices	#1-2500-0180
software Digitalizador Digidata 1550A1	Molecular Devices	DD1550
Amplificador Multiclap 700B Headstage CV-7B	Molecular Devices	1-CV-7B
	GnRH Bachem	4108604	H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH Sal de trifluoroacetato
extractor de pipetas	Sutter Instrument	P-1000
anfotericina B	SIGMA	A9528	antibiótico formador de poros
polietilenimina	SIGMA	P3143	solución 50% PEI
		WPI MF28/g67-5
vidrio para el puente de agar	Instrumento	Sutter BF200-116-15	Borosilicato con filamento Diámetro exterior: 2,0 mm, diámetro interior: 1,16 mm Pulido al fuego
Software			Software de microscopía de código abierto
Cámara optiMOS sCMOS	Qimaging	01-OPTIMOS-R-M-16-C
sonicador	Elma	D-7700 singen
NaCl	SiGMA	S3014
KCl	SiGMA	P9541
MgCl2	SiGMA	M8266
D-Glucosa	SiGMA	G5400
Hepes	SiGMA	H4034
CaCl< sub>2	SiGMA	C8106
Sacarosa	SiGMA	84097
D-manitol	SiGMA	63565
MES-ácido	SIGMA	M0895
BSA	SIGMA	A2153

Pegamento quirúrgico WPI VETBOND 3M Vetbond Adhesivo para tejidos Cuchillas de acero inoxidable Campden Instruments 752-1-SS moldes PBS SIGMA D8537 Jeringa de microfilete en Micro-Manager