Cultivos de tejido ováricos se puede utilizar como modelos de la atresia de desarrollo, la ovulación y el folículo folículo e indicar mecanismos reguladores de procesos dinámicos de ovarianos.
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Artículo de método
Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón
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Resumen
Resumen
Las hembras mamíferas ovulan periódicamente una cantidad casi constante de ovocitos durante cada ciclo estral. Para sostener tal regularidad y periodicidad, regulación ocurre a nivel de eje hipotalámico-pituitario-gonadal y en el desarrollo de los folículos en el ovario. A pesar de estudios activos, mecanismos de desarrollo del folículo no son claros debido a los varios pasos de la activación del folículo primordial inactiva a la ovulación y debido a la complejidad de la regulación que difiere en cada fase folicular. Para investigar los mecanismos de desarrollo folicular y la dinámica de los folículos durante el ciclo estral, se desarrolló un modelo de cultura de tejido ovárico de ratón que puede ser utilizado para observar el desarrollo folicular utilizando un microscopio. Desarrollo sistemático del folículo, la ovulación periódica y atresia del folículo pueden todas reproducidas en el modelo de ovario cultivadas, y las condiciones de cultivo pueden ser moduladas experimentalmente. Aquí, demostramos la utilidad de este método en el estudio de los mecanismos de regulación del desarrollo folicular y otros fenómenos de ovarianos.
Introducción
Los ovarios de la hembra del ratón contienen varios mil folículos1, y la ovulación periódica madura aproximadamente diez ovocitos en cada ciclo estral. Los folículos se clasifican en varias etapas del desarrollo: primordial, primaria, secundaria, antral y los folículos de Graaf, dependiendo de la forma de la capa celular granulosa que rodean a cada ovocito. La mayoría de los folículos primordiales están inactivos, y algunos de ellos se activan y se convierten en folículos primarios en cada estro ciclo2. Después de la etapa folicular secundaria, desarrollo folicular está regulado principalmente por gonadotropinas, foliculares estimulante hormona (FSH) y hormona luteinizante (LH). Sin embargo, desarrollo del folículo primordial y principal es independiente de la gonadotropina, y los mecanismos de regulación que rigen estas etapas siguen siendo mal inderstood3,4,5. Además de factores de crecimiento y hormonas, el folículo primordial y primario está regulado por las interacciones entre los folículos de6,7. Por lo tanto, se realizaron análisis de la dinámica folicular en los tejidos de ovario de ratón e investigaron los mecanismos de regulación asociados con cultivos de tejido ovárico8,9,10.
Adjunto, presentamos dos métodos del modelo de cultivo de tejido ovárico. El primero se utiliza para analizar el desarrollo del folículo por la medida de áreas foliculares, y la segunda se utiliza para estudiar el mecanismo de regulación durante el desarrollo temprano del folículo de primordial a la etapa de folículo secundario con ratones transgénicos. Para el análisis del desarrollo del folículo, utilizan principalmente ovarios de ratones hembra 4 - semanas de edad debido a que permiten la fácil visualización de los folículos. Para inducir la ovulación periódica y desarrollo de modelos en vivo del folículo, reproducen de LH y la ovulación observada, la atresia del folículo y secreción de estradiol bajo condiciones de cultivo de tejidos. Imágenes de los ovarios cultivados fueron capturados, y los procesos de desarrollo del folículo se analizaron por los cambios de trazado en la zona folicular. Sin embargo, en los análisis de microscopía de campo claro, la distinción entre folículos primordiales y principios primarios era claro. Así, se desarrolló un método para detectar folículos pequeños y distinguir entre el primordial, primario, y folículo secundario en cultiva tejidos ováricos usando Oogenesin1 pro3 (Oog1). 9 y R26-H2B-mCherry ovarios de ratones transgénicos a los 0 y 4 días después del nacimiento11. Oog1 expresión es detectable en ovocitos después de entrada en meiosis y aumenta gradualmente con el desarrollo del folículo, lo que permite la observación de la transición de primordial a primarios folículos con imágenes de Time-lapse de tejido de ovario cultivadas11 ,12. Aunque se han utilizado métodos morfológicos para estudiar factores que activan los folículos primordiales inactivos13,14,15,16, desarrollo fisiológico del folículo en los ovarios es difícil de observar, y los efectos de varios factores siendo desacostumbrados. Los métodos actuales de la cultura fueron diseñados para abordar esta falta en tiempo real Análisis de factores objetivos.
En el presente estudio, con desarrollo folicular utilizando un método de imagen Time-lapse y había caracterizado el proceso de desarrollo folicular. Nuestros nuevos métodos ofrecen una herramienta sin precedentes para la investigación de la fisiología de los ovarios.
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Protocolo
Ratones fueron alojados en una sala de ambiente controlada a 23 ± 1 ° C con un ciclo oscuro h 12 h luz/12. Protocolos de cuidado de los animales y los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las directrices para la experimentación Animal en la Universidad médica de Aichi y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal titular.
1. preparación de medio de cultivo y platos
- Para preparar medio de cultivo base, agregar suero bovino fetal (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL) y penicilina-estreptomicina (penicilina 100 U/mL, estreptomicina, 100 mg/mL) al mínimo esencial medio (MEM-alfa) y la mezcla en tubos de 50 mL.
Nota: Volumen Total requiere de medios de cultivo varía entre experimentos y 1 mL de medio de cultivo es generalmente suficiente para platos de cultura de fondo de cristal de 3,5 cm. - Verter alícuotas de 1 mL de medio de cultivo mezclado en platos de cultura de fondo de cristal de 3,5 cm y coloque lugar 30 mm de la célula cultura insertos en platos. Precaliente los platos en una incubadora (5% CO2 y 37 ° C) y los medios de comunicación.
2. preparación del tejido ovárico
- Pre-warm fosfato tampón salino (PBS) (−) y MEM-alfa que contiene 5% FBS, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina 100 mg/mL en una incubadora (5% CO2 y 37 ° C).
Nota: Aproximadamente 3 mL alícuotas de PBS (−) por ovario son suficientes para el uso durante la disección del ovario, y alícuotas de 1 mL de MEM-alfa son suficientes para el almacenamiento transitorio de los ovarios solo en platos de 3,5 cm. -
Suprimir los ovarios de ratones femeninos 4 semana - el viejo del ICR (nombrado después de Instituto de investigación del cáncer) y de los tejidos que rodean al ovario usando tijeras y pinzas en un microscopio estereoscópico. Reserva los ovarios retirados en medio de cultivo (véase el paso 2.1) hasta su uso.
- Lugar los ovarios solo sobre el papel de filtro humedecidos con pre calentado PBS (−) (véase el paso 2.1) y cortar en 4 pedazos con una cuchilla de micrótomo en un microscopio estereoscópico.
Nota: Los ovarios de ratones ICR 4 semana - el viejo son unos 2 mm de diámetro. El número de piezas depende del tamaño de ovario; sin embargo, trozos gruesos de alrededor de 500 μm permiten observaciones de folículo apropiado (en piezas más gruesas que 500 mm, se disminuye la transparencia del tejido, en pedazos más finos de 500 mm, se rompen y se perdieron muchos folículos antrales). - Después de la disección, coloque a las muestras de ovario en rodajas con medio de cultivo en platos de 3,5 cm (vea el paso 2.1).
- Lugar los ovarios solo sobre el papel de filtro humedecidos con pre calentado PBS (−) (véase el paso 2.1) y cortar en 4 pedazos con una cuchilla de micrótomo en un microscopio estereoscópico.
3. ovario cultivo de tejidos
- Gota aproximadamente 0,5 μl de medio de cultivo por rebanadas de tejido ovárico en la inserción de la cultura de célula donde estará el tejido ovárico mediante una micropipeta.
- Coloque a cada muestra en rodajas en una gota de medio de cultivo sobre los insertos de la cultura de célula con unas pinzas.
- Cultura de los tejidos del ovario de 5% CO2 a 37 ° C.
- Reemplazar el medio de cultivo con medio fresco precalentado cada 2 días.
Nota: El horario para los cambios de medio para el cultivo de secciones de ovario de 4 semana - viejos ratones ICR se presenta en la figura 1.- Para reproducir la oleada de LH, tratar cultivadas 4 semana - viejos ovarios de ratones ICR con el medio que contiene 100 mU/mL FSH y LH de 12 h cada 4 días (figura 1).
4. microscopio imágenes de ovarios cultivados
- Iniciar la proyección de imagen los ovarios cultivados después de día 1 cuando los tejidos han adherido en los insertos de la cultura de célula y realizar análisis de microscopio confocal o invertida en intervalos de 24 h para permitir un crecimiento suficiente del folículo entre puntos de tiempo.
Nota: La microscopia Confocal es superior a la microscopía invertida para la observación de los folículos en los ovarios todo cultos.
5. Time-lapse proyección de imagen de ovarios cultivados
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Optimizar las condiciones de proyección de imagen de Time-lapse, incluyendo láser intensidades y tiempos de exposición, para el sistema de proyección de imagen (tabla 1).
- Seleccione muestras pareadas ovario de ratones solo para el uso como los grupos tratamiento y control. Variar intensidades láser y tiempo de exposición para lograr las mejores imágenes (tabla 1).
- Comparar el crecimiento del folículo bajo cada condición de cultivo mediante la medición de áreas de folículo en imágenes de muestras de control a intervalos de 24 h y en time-lapse de muestras (ver paso 6). Al mismo tiempo, contar el número de ovuladas ovocitos en cada ovario conjunto y seleccionar las condiciones óptimas de imagen Time-lapse.
- Capturar imágenes a intervalos de 30 min con el sistema Time-lapse de imágenes bajo las condiciones determinadas (tabla 1).
6. Análisis de crecimiento de folículo
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Para analizar el desarrollo del folículo, medir las áreas de folículo en las imágenes utilizando el software ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
- Inicialmente, establecer la escala de la imagen haciendo clic en "Set escala" debajo de "Analizar" en la barra de herramientas. Introduzca las longitudes de lado de la imagen capturada y el correspondiente número de píxeles en los campos en blanco de "Distancia del conocido" y "Distancia en píxeles", respectivamente.
- Haga clic en "Mano libre" en la barra de herramientas y contorno de los folículos en las imágenes capturadas de campo brillante.
- Haga clic en "Medida" en "Analizar" en la barra de herramientas.
Nota: Si desean otros datos de medición, haga clic en "Configurar medición" debajo de "Analizar" en la barra de herramientas y marque las casillas apropiadas en la lista.
7. análisis del desarrollo folicular utilizando ratones transgénicos
- Recoger los ovarios de postnatal días 0 y 4 (P0 y P4) hembra de ratones transgénicos que contienen los transgenes Oog1pro3.9 R26-H2B-mCherry cultura en partes movibles como se describe en los pasos 1.1, 3.2, excepto no rodaja la P0 y ovarios de P4.
- Reemplazar el medio de cultivo con medio fresco, precalentado en platos de 3,5 cm en una incubadora con 5% CO2 a 37 ° C cada 2 días.
Nota: La concentración de LH en el medio de cultivo de ovarios P0 y P4 puede seguir siendo constante debido a las oleadas de LH no ocurre en ratones P0 y P4. - Ajuste del microscopio para visualizar solamente AcGFP1-positivo primario los folículos en ovarios P4 cultivados (tabla 1).
Nota: Sólo primarios y primordiales de los folículos están presentes en ovarios de ratón hembra P4. - Captura de imágenes de culto P0 Oog1pro3.9R26-H2B-mCherry ovarios de ratones transgénicos en intervalos de 30 minutos utilizando la configuración utilizada para ovarios P4 (ver paso 5.2).
- Rastrear y analizar el desarrollo del folículo de señales AcGFP1 y H2B mCHerry.
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Resultados
La figura 1 muestra el protocolo para los cambios en los medios de comunicación en cultura del tejido ovárica. Siguiendo este programa, ovarios de ratones ICR 4 semanas de edad fueron cultivadas e imagen a intervalos de 24 h mediante microscopía confocal (figura 2). Durante el cultivo de tejidos de ovario durante 3 semanas, más folículos antrales y secundarios fueron degenerados por atresia del folículo y algunos fueron ovuladas ...
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Discusión
En este estudio, hemos desarrollado dos nuevos métodos para estudiar el desarrollo folicular en ovarios de ratón. El primer método implica el cultivo de los tejidos de ratones adultos ovárico en rodajas seguida por análisis del desarrollo del folículo, y el segundo involucra el uso de Time-lapse de imágenes para visualizar el desarrollo folicular temprano durante la etapa independiente de la gonadotropina. Anteriormente, utiliza el método de cultivo de tejidos de ovario presente para evaluar el efecto del factor inhibido...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Dr. Naojiro Minami (Universidad de Kioto) para proporcionar los ratones Oog1pro3.9 . Esta investigación fue apoyada por el JSP (KAKENHI # JP15H06275) y la Fundación de Nitto.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Hormona folículo estimulante de la hipófisis humana | SIGMA | F4021 | |
| Hormona lutinizante de la hipófisis equina | SIGMA | L9773 | |
| Solución de penicilina-estreptomicina | Wako Pure Chemical Industries | 168-23191 | |
| MEM a, GlutaMax, sin nucleótidos | Thermo Fisher | 32561037 | |
| Plato con fondo de vidrio | MatTek | P35G-0-10-C | Plato de 35 mm, cubreobjetos n.º 0, diámetro de vidrio de 10 mm |
| Inserto de cultivo celular Millicell | Merck Millipore | PICM0RG50 | Diámetro: 315 mm, tamaño de poro: 0,4 mm, material: PTTE hidrófilo |
| Placas de cultivo celular de 3,5 cm | Greiner Bio-One | 627160 | |
| 50 ml / tubo de centrífuga con tapón de triple sellado | IWAKI | 2345-050 | |
| Cuchillas desechables de perfil bajo 819 | Leica | 14035838925 | |
| LSM 710 | Carl Zeiss | Microscopio confocal | |
| CellVoyager, CV1000 | Yokogawa Electric Corporation | Imágenes time-lapse | |
| BZ-X700 | KEYENCE | Time-lapse imaging |
Referencias
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