La producción de células especializadas de la retina de células madre pluripotentes es un punto de inflexión en el desarrollo de la terapia basada en células madre para enfermedades de la retina. El presente trabajo describe un método sencillo para una generación eficiente de organoides de retina y epitelio pigmentado retiniano para investigación básica, traslacional y clínica.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Alimentador-libre las condiciones de cultivo para la generación de humanos derivados de iPSC de modelos de celulares de retina y definido sin Xeno
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La producción de células especializadas de las células de vástago pluripotent proporciona una poderosa herramienta para desarrollar nuevos enfoques para la medicina regenerativa. El uso de las células de vástago pluripotent humanas (iPSCs) es particularmente atractivo para estudios de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo distrofias retinianas, donde modelos de células retinianas iPSC marcan un importante paso adelante para entender y combatir la ceguera. En este papel, describimos un protocolo simple y escalable para generar, madurar y criopreservar organitas retiniana. Basado en el cambio de medio, la principal ventaja de este método es evitar múltiples y lentos pasos comúnmente necesitan una diferenciación guiada de iPSCs. Imitando las primeras fases de desarrollo retiniano por sucesivos cambios de medios definidos en iPSC humanas adherente culturas, este protocolo permite la generación simultánea de uno mismo-formar del neuroretinal estructuras y retiniano epitelial (RPE) las células pigmentadas en una manera eficiente y reproducible en 4 semanas. Estas estructuras que contienen células progenitoras de retina (RPC) pueden ser fácilmente aisladas de mayor maduración en una condición de cultura flotante que permite la diferenciación de RPC en los siete tipos de células retinianas presentes en la retina humana adulta. Asimismo, describen métodos rápidos para la criopreservación de los organoides retiniano y las células RPE para almacenamiento a largo plazo. Combinados, los métodos descritos aquí será útiles para producir y Banco humanas derivado de iPSC retinianas células o tejidos para investigación básica y clínica.
Introducción
La retina es una parte integral del sistema nervioso central (SNC) y tiene una capacidad limitada para regenerar espontáneamente después de una lesión traumática o de enfermedades. Por lo tanto, patologías degenerativas que causan pérdida definitiva de la célula retiniana, como degeneración macular senil (DMS), retinitis pigmentosa (RP), glaucoma y retinopatía diabética, suele llevan a la ceguera irreversible. Rescatar la retina degenerada es un gran desafío para que las terapias basadas en células madre con el objetivo de reemplazar las células dañadas o perdidas son uno de los más prometedores enfoques1,2
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
El protocolo descrito en este documento sigue las directrices del Comité de ética de investigación del Instituto de la Vision. El Instituto de la visión se ha permitido la manipulación del espécimen humano de acuerdo a la norma francesa. Muestra de manejo sigue protección de datos de los pacientes con arreglo a los principios de Helsinki y las normas nacionales después de la aprobación ética del "Comité de protección des Personnes (CPP) Ile V".
1. preparación de medios de cultivo y platos
-
Medios de cultivo
- Uso medio de iPSC, un medio químicamente definido dedicado a la cultura de células madre pluripote....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El primer paso para la diferenciación de iPSC humanas cultivada en condiciones libres de alimentador de16 es cerrar maquinaria de auto renovación mediante medio Bi a una diferenciación espontánea (figura 1A). Luego, en la D2, el medio Bi se complementa con un suplemento de N2 para diferenciar células iPSCs hacia los linajes neuronales y retinianas. Este proceso conduce a la aparición de brotes del neuroretinal en torno a D28 (
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo describe cómo producir células RPE y organitas retiniana, que contiene RGCs retinales y los fotorreceptores, de células de vástago pluripotent humanas en condiciones libre de xeno y alimentador. Compatible con el proceso de buenas prácticas de manufactura (GMP), el método cultivado presentada aquí permite una gran producción de células de la retina derivadas de iPSC como células RPE, RGCs y fotorreceptores para el desarrollo de terapias basadas en células madre y de la droga descubrimiento de métodos para .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
José-Alain Sahel, Sacha Reichman y Olivier Goureau son inventores en espera de patentes relacionadas con la generación de células de la retina de células madre pluripotentes humanas.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a los miembros del equipo de Goureau su entrada durante la instalación de los métodos descritos aquí y G. Gagliardi y M. Garita por su lectura crítica. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), la Asociación de Francia de la Retina y la transferencia de tecnología empresa SATT Lutech. También se realizó en el marco de la LIFESENSES LABEX (ANR-10-LABX-65) apoyado por la ANR en el programa de Avenir Investissements (ANR-11-IDEX-0004-02).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Vitronectina (VTN-N) Proteína humana recombinante, truncada | ThermoFisher Scientific | A14700 | |
| Recubrimiento CTS Vitronectina (VTN-N) Proteína humana recombinante, truncada | ThermoFisher Scientific | A27940 | Recubrimiento |
| Essential 8 Medio | ThermoFisher Scientific | A1517001 | medio |
| Essential 6 Medio | ThermoFisher Scientific | A1516401 | medio |
| CTS (Sistemas de Terapia Celular) N-2 Suplemento | ThermoFisher Scientific | A1370701 | Suplemento CTS |
| N-2 (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Suplemento B-27 (50X), sin suero | ThermoFisher Scientific | Suplemento | 17504044 |
| CTS B-27 Suplemento, XenoFree | ThermoFisher Scientific | A1486701 | suplemento CTS |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | medio |
| MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140035 | suplemento |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | antibiótico |
| CellStart CTS | ThermoFisher Scientific | A1014201 | Matrix CTS |
| Geltrex Calificado para hESC Factor de crecimiento reducido Matrix de membrana basal ThermoFisher | Scientific | A1569601 | Matrix |
| Reactivo de disociación celular suave | Stemcell Technologies | 7174 | solución de disociación |
| Cryostem Freezing Media | Clinisciences | 05-710-1D Medio de | criopreservación |
| Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) | Preprotech | 100-18B | FGF2 |
| Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) libre de animales | Preprotech | AF-100-18B | FGF2 Xeno free |
| AGANI aguja 23G | Terumo | AN*2332R1 | Matraz de aguja |
| 25 cm² Cultivo de Tejidos Tratada | Falcon | 353109 | T-25 cm² |
| Placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos | Costar | 3526 | Placa de 24 pocillos |
| Placa de 6 pocillos Cultivo de tejidos tratado | Costar | 3516 | Placa de 6 pocillos |
Referencias
- Zhao, C., Wang, Q., Temple, S. Stem cell therapies for retinal diseases: recapitulating development to replace degenerated cells. Development. 144, 1368-1381 (2017).
- Dalkara, D., Goureau, O., Marazova, K., Sahel, J. -A. Let There Be Light: Gene and Cell Th....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
Explorar más artículos
Organoides retinianos derivados de iPSC humanascélulas del epitelio pigmentario de la retinacélulas progenitoras retinianasdiferenciación en medios definidoscondiciones de cultivo flotantemétodos de criopreservacióndiferenciación de células retinianasprotocolo de aislamiento de organoidesexpansión de células RPEmaduración de células retinianas
