Aquí, presentamos un protocolo para una purificación eficiente solo paso del humano sin etiquetar activo desplazamiento de diez-once-2 (TET2) 5-METILCITOSINA dioxygenase utilizando cromatografía de intercambio iónico y su ensayo con una masa líquida de la cromatografía-tandem Espectrometría (LC-MS/MS)-enfoque basado en.
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Artículo de método
Eficiente purificación y desarrollo análisis LC-MS/MS-based para diez-once 2 desplazamiento 5-METILCITOSINA dioxigenasa
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En este artículo
Resumen
Resumen
La regulación epigenética de la transcripción mediada por la 5-METILCITOSINA (5mC) ha desempeñado un papel crítico en el desarrollo de eucariota. Desmetilación de estas marcas epigenéticas se logra por oxidación secuencial de diez-once desplazamiento dioxygenases (TET1-3), seguido de la timina ADN glicosilasa dependiente supresión base reparación. Inactivación del gen TET2 debido a mutaciones genéticas o por otros mecanismos epigenéticos se asocia con un pronóstico pobre en pacientes con diversos tipos de cáncer, especialmente de malignidades hematopoyéticas. Aquí, describimos una purificación eficiente solo paso de enzimáticamente activa sin etiquetar dioxigenasa de TET2 humana usando la cromatografía de intercambio catiónico. Además ofrecemos un enfoque líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) que se puede separar y cuantificar las cuatro bases del ADN normales (A, T, G y C), así como de las cuatro bases de citosina modificado (5-metil, 5-hidroximetil, 5-formil y 5-carboxilo). Este ensayo puede utilizarse para evaluar la actividad de tipo salvaje y mutante TET2 dioxygenases.
Introducción
La posición C5 de bases de citosina en los dinucleótidos CpG es el sitio predominante de metilación (5mCpG) en genomas mamíferos1. Además, varios estudios recientes han descubierto extensa metilación de citosina de C5 (5mC) en sitios de CpG no (5mCpH, donde H = A, T, o C)2,3. modificación de la 5mC sirve como un silencioso transcripcional en retrotransposones endógeno y genes promotores3,4,5. La metilación del ADN en 5mC también juega un papel importante en la inactivación del cromosoma X, impr....
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Protocolo
1. clonación y purificación del Dioxygenase TET2 humano sin etiquetar
- Clon humano TET2 dioxigenasa (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) en el vector de destino de pDEST14 utilizando la técnica de recombinación específica del sitio como se describió anteriormente22.
Nota: Estudios previos han demostrado que el dominio C-terminal TET2 dioxigenasa (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) es el dominio catalítico activo mínimo21,23. Para expresar el dominio sin etiquetar de dioxygenase TET2 utilizando el vector de pDONR221, secuencias Shine Dalgarno y Kozak se incorporaron en el primer avance dura....
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Resultados
Modificación dinámica de 5mC en ADN por TET-familia dioxygenases juega un papel importante en las regulaciones transcripcionales epigenéticas. Dioxygenase TET2 es transformado con frecuencia en diversas malignidades hematopoyéticas12. Para investigar el papel de la enzima TET2 en desarrollo normal y la enfermedad, hemos clonado su dominio catalítico activo mínimo sin ninguna etiqueta de afinidad en el vector de pDEST1422. El dioxygenase TET2.......
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Discusión
Las mutaciones en el gen TET2 son algunos de los cambios genéticos más frecuentemente detectados en pacientes con malignidades hematopoyéticas diversos. Hasta la fecha cientos de mutaciones diferentes de TET2, que incluyen el cambio del marco y absurdo y mutaciones sin sentido, se han identificado en pacientes12. Pacientes con mutaciones TET2 muestran niveles bajos de 5hmC genómica en la médula ósea en comparación con aquellos con TET2 wt14. TET2 mutantes .......
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Divulgaciones
Los autores tienen intereses financieros para declarar.
Agradecimientos
Esta investigación fue financiada por el Departamento de defensa en la forma de un premio de Idea (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplásica y subvención de la Fundación de MDS, y concesión UMRB a Authors M.M. gracias Mohit Jaiswal y Subhradeep Bhar para clonación inicial de TET2 en vector de pDEST14.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HEPES | Carbosynth | FH31182 | |
| Sulfato de hierro (II) heptahidratado | Sigma-Aldrich | F8633 | |
| &alfa;-Ácido cetoglutárico (ácido 2-oxoglutárico) | Sigma-Aldrich | K1750 | |
| Ácido L-ascórbico | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica dihidratado | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Acetato de amonio | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Acetonitrilo | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Agua de grado HPLC | Fisher Scientific | 7732-18-5 | |
| Oligo limpio y concentrador | Zymo Research | D4061 | |
| DNAse I | New England Biolabs | M0303S | |
| S1 Nucleasa | Thermo Scientific | ENO321 | |
| CIAP (Fosfatasa alcalina intestinal de ternera) | New England Biolabs | M0290S | |
| LB | Media Affymetrix | J75852 | |
| IPTG | Carbosynth | EI05931 | |
| MES [Ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfónico monohidratado] | Carbosynth | FM37015 | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G7893 | |
| SP Sepharose | Fisher Scientific | 45-002-934 | |
| 2'-Desoxi-5-metilcitidina | TCI | D3610 | |
| 2'-Desoxi-5-hidroximetilicitidina | TCI | D4220 | |
| Ácido 2'-desoxicitidina-5-carboxílico, sal de sodio | Baya & amperio; Asociados | PY 7593 | |
| 5-Formil-2'-desoxicitidina | Baya & Asociados | PY 7589 | |
| 2'-Deoxycytidine | Berry & Asociados | PY 7216 | |
| 2'-Desoxiadenosina | Carbosynth | ND04011 | |
| 2'-Desoxiguanosina | Carbosynth | ND06306 | |
| 2'-Desoxitimidina | VWR Life Science | 97061-764 | |
| Tecnología de pasarela | Thermo Fisher | 11801016 | |
| Beckman Allegra X-15R | Beckman Coulter | 392932 | |
| Desmembrador Sónico 550 | Fisher Scientific | XL2020 | |
| Ä Sistema KTA FPLC | Pharmacia (GE Healthcare) | 18116468 | |
| Sistema de liofilización FreeZone 4.5 | Labconco | 7750020 | |
| Zymo Oligo columnas de purificación | Zymo Research | D4061 | |
| BDS Hypersil C18 columna | Keystone Scientific, INC | 105-46-3 | |
| 3200 Q-Trap espectrómetro de masas | AB Sciex | ||
| HPLC | Shimadzu HPLC | ||
| XK16/20 Columna FPLC | Farmacia (GE Healthcare) | 28988937 |
Referencias
- Suzuki, M. M., Bird, A. DNA methylation landscapes: provocative insights from epigenomics. Nature reviews. Genetics. 9, 465-476 (2008).
- Lister, R., et al. Global epigenomic reconfiguration during mammalian brain development. Science. 341
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Reimpresiones y permisos
