Artículo de método

Explorar el potencial de la hoja de células madre mesenquimales en el desarrollo de Carcinoma Hepatocelular en Vivo

DOI:

10.3791/57805

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11 de septiembre de 2018

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1Stem Cell and Regenerative Medicine Department, King Abdullah International Medical Research Centre, King Abdulaziz Medical City, Ministry of National Guard Health Affairs, 2College of Medicine, Experimental Surgery and Animal Laboratory, King Saud University

En este artículo

Resumen

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Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar un modelo de cáncer en vivo utilizando la tecnología de hoja de la célula. Tal modelo podría ser muy útil para la evaluación de la terapéutica contra el cáncer.

Resumen

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Un en vivo modelo animal que simula cáncer podría tener diversas aplicaciones que ofrecen información clínica importante. Las técnicas actualmente utilizadas para el desarrollo de modelos de cáncer en vivo tienen considerables limitaciones. Por lo tanto, en este estudio, nuestro objetivo es implementar la tecnología de hoja de la célula para desarrollar un modelo de cáncer en vivo . Carcinoma hepatocelular (HCC) se desarrolló con éxito en ratas desnudas utilizando hojas de célula creadas a partir de células de línea de células HCC. Las hojas de la célula de cáncer se generan a través de la adhesión intracelular y la formación de una estructura estratificada, controlada por la matriz extracelular. Esto permite que el trasplante de la hoja HCC en el hígado y la creación de un modelo animal con tumores dentro de un mes. Además, se investiga el papel de las células madre mesenquimales (MSC) en el desarrollo de este modelo de cáncer. Además de la hoja de línea de células HCC, se crean otro hojas de dos células: una hoja de células HCC y médula MSCs (BMMSCs) y una hoja de células HCC y cordón umbilical MSCs (UCMSCs). Las hojas que tienen una combinación de células HCC y MSCs también son capaces de producir un animal con tumores. Sin embargo, la adición de MSCs reduce el tamaño del tumor formado, y este efecto adverso en el desarrollo del tumor varía dependiendo de la fuente de las MSCs usado. Esto indica que se podría utilizar una hoja de la célula de ciertos subtipos MSC en control y gestión de tumor.

Introducción

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HCC es un cáncer primario del hígado que está significativamente asociado con un pronóstico pobre. Anualmente, casi medio millón se diagnostican nuevos pacientes con HCC, que representan el 85% de pacientes de cáncer de hígado en todo el mundo1. Hepatocarcinogenesis no es una enfermedad de forma individual; por el contrario, es una colección de enfermedades que tienen diferentes características histopatológicas y la variabilidad genética y genómica, además variados resultados pronóstico1. Por lo tanto, los principales retos en el desarrollo de una estrategia terapéutica efectiva para el CHC son el conocimiento limitado de la biología HCC y la falta de un adecuado modelo experimental animal que puede ayudar a entender esta compleja enfermedad. Un en vivo modelo animal que simula cáncer humano es necesario para la selección de genes candidatos y la identificación de marcadores pronóstico/predicción implicados en la inducción de cáncer, así como para investigar los diferentes factores que pueden afectar las respuestas de cáncer a los agentes terapéuticos.

Estudios de cáncer in vitro están todavía asociados con limitaciones importantes. Esto es debido a que las células cancerosas pierden muchas de sus características en vivo cuando se mantienen en cultivo. Los cambios que se producen a las células en vitro resultado de la ausencia de la fisiología del tejido todo en un entorno de ex vivo . Interacción de célula a célula de cáncer (stromal, inmune, vasculatura, epitelial, etc.) dentro del microambiente del tumor refleja grandemente en cáncer celular características2. El microambiente tumoral podría alterar la expresión de gene de la proteína de la célula de cáncer y características fenotípicas, además de angiogenetic y potencial metastásico. El sistema de cultivo bidimensionales (2D) en vitro también carece de una matriz de tejido adecuado, que es necesaria regular la progresión del tumor. Así, debido a estas limitaciones, en vivo modelos siempre deben ser utilizados para apoyar los resultados preliminares de los modelos en vitro . En este estudio, utilizamos tecnología de hoja de la célula para desarrollar un en vivo modelo animal que aclara el proceso biológico subyacente HCC.

Hace más de una década, laboratorio de Okano estableció un nuevo método de la ingeniería de tejido partiendo de células hoja tecnología3. Esta técnica utiliza un plástico termo-sensible de la cultura para permitir adherencia/desprendimiento celular reversible mediante el control de la hidrofobicidad superficial. Este método permite una extracción suave de células cultivadas en un formato (3D) tridimensional intacta (hoja i.e.,cell), con una cuidada matriz extracelular (ECM) y las interacciones célula a célula. La técnica de la hoja de la célula requiere cubrir el primero de los platos de la cultura con un poly(N-isopropylacrylamide) de polímero sensible a la temperatura (PIPA soy), que está comercialmente disponible y listo para usar. A una temperatura inferior a 20 ° C, PIPA soy polímeros se convierten hidratados y se disuelven en soluciones acuosas, mientras que, en una temperatura más alta (37 ° C), los polímeros se deshidrate y transforman en un precipitado turbio. El polímero contiene amida hidrofílico cadenas y las cadenas laterales hidrofóbicas (grupos isopropilo). A altas temperaturas, el movimiento browniano de las moléculas de agua se intensifica, mientras que a baja temperatura, las moléculas del agua que rodea los grupos isopropilo de la ruptura de la estructura hidratada y los grupos de isopropilo hidrofóbica agregadas debido a las interacciones hidrofóbicas. Por lo tanto, toda la cadena del polímero agregados y precipitados de4.

En el estudio presentado, esta técnica se emplea para desarrollar un modelo animal de HCC con tres hojas de células diferentes. La primera hoja empleada consiste en células HCC célula línea solamente, mientras que las otras dos hojas consisten en una combinación de células de línea de células HCC y MSCs de dos fuentes diferentes: MSCs (BMMSCs) de la médula ósea y cordón umbilical MSCs (UCMSCs). MSCs son células estromales no-hematopoyéticas que son capaces de distinguir los derivados intocell de la estirpe mesenquimal, incluyendo adipocitos, osteocitos, condrocitos y miocitos5. La razón por la que emplean estas células al crear la hoja de la célula de cáncer es la información inconsistente sobre el efecto de MSCs en cánceres. Se ha sugerido que MSCs pueden tener dos fenotipos distintos: "MSC1", un fenotipo proinflamatorias y "MSC2", un fenotipo inmunosupresores6. MSCs expresan receptores toll-like (TLRs). Cebado de TLR4 de MSCs aumenta su secreción de factores proinflamatorios, mientras que TLR3 cebado aumenta su secreción de factores inmunosupresores6. Un estudio en vitro de estos dos fenotipos informó que un cocultivo de MSC1 con líneas celulares de cáncer había atenuado crecimiento celular del cáncer, mientras que cultura Co MSC2 tenía el efecto opuesto7. Esto implica que MSCs pueden ser cáncer Pro o contra el cáncer, según su fenotipo. Así, además de desarrollar el modelo animal de HCC, utilizando la tecnología de hoja celular, queremos explorar el efecto de los trasplantes MSC en el desarrollo del tumor, y si estas células se aumentar o reducir el desarrollo de este modelo.

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Protocolo

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El protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales de Comité de ética de la Universidad Rey Saud. Procedimientos quirúrgicos, anestésicos y otros medicamentos utilizados en animales son aprobados por el Comité de ética de la Universidad Rey Saud. Todo el trabajo experimental es realizado por personal adecuadamente capacitado.

1. célula hoja construcción

  1. Cubrir los platos (platos de cultura sensible a la temperatura de 3.5 cm) de la cultura con puro suero bovino fetal (FBS) y asegúrese de cubrir toda la superficie del plato.
    Nota: Este paso es importante para la separación de la capa celular puesto que apoya el crecimiento de las células en una monocapa y evita la agregación celular.
  2. Incubar los platos por 24 h a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 y 95% aire.
  3. Retire el exceso FBS de platos recubiertos y deje que los platos se sequen a temperatura ambiente (RT) durante al menos 1 h.
  4. Preparar las suspensiones de tres células: 1 x 106 HepG2 células, células 1 x 106 HepG2 con BMMSCs y células 1 x 106 HepG2 con UCMSCs (en una proporción de 4:1 para BMMSCs y UCMSCs).
  5. La suspensión de células apropiadas a cada plato etiquetado de la semilla.
  6. Suspender todas las células en medio de cultivo DMEM suplementado con 10% de SBF y el 1% de penicilina/estreptomicina.
  7. Incube las células a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 y 95% aire.

2. células hoja desprendimiento

  1. En la confluencia de la célula del 100%, tomar los platos fuera de la incubadora de 37 ° C.
  2. Incubar el plato de hoja de células HepG2 durante 1 h a temperatura ambiente, mientras que la incubación la HepG2/BMMSC y platos de hoja de células HepG2/UCMSC 30-40 min a 20 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO2 y 95% aire.
    Nota: La hoja de la célula de sólo HepG2 es frágil; reducir la temperatura a 20 ° C causa daños a la estructura de la hoja.

3. ejecución del procedimiento quirúrgico

Nota: Durante el tiempo de incubación para la separación de la hoja de la célula, inicia un proceso de animales.

  1. Instrucciones para la preparación de la zona de la cirugía
    1. Llevar a cabo todos los procedimientos quirúrgicos en un área estéril separada dentro del laboratorio, como una campana, gabinete de flujo laminar o una sala de cirugía aséptica. Asegúrese de que todas las superficies de la zona de la cirugía son no porosos, sellado, durable y sanitizable.
    2. Use equipo de protección adecuado, incluyendo peelings, guantes, mascarillas y cubre la cabeza y zapatos.
    3. Herramientas de uso quirúrgico que estan limpio y esterilizado (vía autoclave; vástago saturado a alta presión) al principio de la cirugía.
    4. Cambiar guantes entre ratas.
  2. Preparación del animal para la cirugía
    1. Utilizar ratas desnudas de 8 a 12 semanas de edad.
    2. Crear anestesia inyectable para las ratas.
      1. Para preparar la solución de anestesia, ketamina-xilacina, mezclar 1 mL de solución salina fisiológica estéril (p. ej., cloruro de sodio 0.9%) en un frasco estéril de 10 mL de suero, 2 mL de ketamina y 1 mL de xilacina (a una concentración de 20 mg/mL) y agitar bien antes de uso.
      2. Para aplicar anestesia, inyectar 0,2 mL de la solución de ketamina-xilacina por 100 g de peso corporal de la rata por vía intraperitoneal.
        Nota: La dosis total de la solución es 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilacina.
    3. Eliminar suciedad/restos visibles del sitio quirúrgico.
    4. Comprobar la profundidad de la anestesia por la prueba el reflejo de retirada pedal (pizca de almohadilla de pie en ambos pies).
      Nota: Si el pellizco de almohadilla de pie provoca una respuesta, repetir a dosis de 0,05 mL/100 g (aproximadamente cada 30 minutos), luego vuelva a verificar la profundidad anestésica.
    5. Desinfectar el área quirúrgica con un exfoliante de dos etapas de povidona-yodo/isopropanol.
    6. Cubrir la rata con un paño estéril para evitar la contaminación de la incisión.
    7. Las ratas se inyectan por vía subcutánea con buprenorfina (0.01 - 0.05 mg/kg)8 antes de hacer la incisión.
    8. Con un bisturí estéril, haga un 7 - a 10 cm entre la piel y los músculos subyacentes para exponer el hígado.
      1. Separar el músculo abdominal de la piel con el borde plano posterior de la cuchilla.
      2. Apuñalar con cuidado la linea alba con un bisturí y extender el corte con unas tijeras afiladas.

4. trasplante de la hoja de la célula de

Nota: Trasplante de la célula de la hoja se realiza en el hígado.

  1. Recoger la capa celular de la placa de cultivo.
    1. Golpee suavemente el plato de la cultura en el Banco para separar la hoja de su superficie.
    2. Separar la capa celular de la superficie del platillo raspando el borde de la hoja en un medio círculo utilizando una pipeta estéril.
    3. Suavemente Retire el medio de todo la placa de cultivo.
    4. La hoja esté intacta sin ningún daño; de lo contrario, no puede ser utilizado (figura 1).
      Nota: Las hojas resultantes pueden ser detectadas directamente por el ojo.
  2. Preparar una membrana estéril (papel de filtro) para la cosecha de la hoja de la célula del plato.
    1. En primer lugar, poner en remojo la membrana con solución salina normal. Luego, retire el exceso salino con una almohadilla de algodón estéril.
    2. Coloque la membrana húmeda sobre la hoja de la célula, evitando arrugas y burbujas de aire entre la membrana y la capa celular.
    3. Añadir algunas gotas de suero fisiológico sobre la membrana y la capa celular a recogerlas más fácil.
      Nota: Para no romper la hoja de la célula, no utilice solución salina fría y levantar la membrana y la capa celular con fórceps.
    4. Dejar la membrana durante unos segundos asegurar que la capa celular está colocada correctamente en la membrana y luego recogerlo.
  3. Preparar el hígado para trasplante de la célula de la hoja.
    1. Asegúrese de que la superficie hepática está seca golpeando suavemente con una almohadilla de algodón estéril.
    2. Utilizando pinzas estériles, colocar la membrana con la hoja de la célula en un solo lóbulo del hígado de la rata.
    3. Añadir unas gotas de solución salina estéril y aplique una ligera presión a la membrana para separar la capa celular de él.
    4. Espere 5 minutos antes de retirar con cuidado la membrana.
      Nota: Esto se hace para asegurar que la hoja de la célula está conectada correctamente al hígado.
    5. Por último, cerrar los músculos y la piel incisiones con suturas de nylon 5-0.
    6. Desinfectar el área quirúrgica con povidona-yodo.
      Nota: La figura 2 muestra un diagrama del procedimiento de trasplante de la hoja del celular en el hígado de una rata desnuda.

5. después de la cirugía atención

  1. Inmediatamente después de la cirugía, la rata individualmente para evitar el canibalismo o la asfixia de la casa y supervisar regularmente (por lo menos cada 15 min) hasta que esté consciente y totalmente ambulante.
  2. Luego, evaluar las ratas diariamente durante 5-14 d, por lo menos 5 días postoperatoriamente, para asegurarse de que no hay complicaciones. Durante la evaluación diaria, asegúrese de lo siguiente.
    1. Se cierra la herida y las suturas están intactas, sin ser excesivamente apretada.
    2. No hay signos de infección en el sitio de la incisión, como calor, excesiva inflamación o purulenta la descarga.
    3. No hay signos asociados con el dolor, como menor consumo de alimentos y agua, pérdida de peso, deshidratación, piel acampar o respiración por la boca rápida y abierta. Para control de dolor moderado a intenso después de la cirugía, si inyectar las ratas por vía subcutánea con buprenorfina (0.01 - 0.05 mg/kg) cada 6-8 h9 para un mínimo de 48-72 h después de la operación.

6. Análisis de la zona trasplantada

  1. Un mes después del trasplante, scarifice la rata y recoger el área trasplantado para histológica y el análisis de immunohistochemical.

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Resultados

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Colonización de hojas de células trasplantadas en ratas:

Un mes después del trasplante, todas las hojas de células trasplantadas en hígados de ratas han desarrollado tumores (figura 3). El tamaño promedio de los tumores desarrollados desde hojas de células HepG2/UCMSC, HepG2/BMMSC y HepG2 fueron 4,5 cm, 4 cm y 2,5 cm, respectivamente10.

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Discusión

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Una gran cantidad de investigación se dedica a desarrollar un adecuado en vivo preclínicos modelo animal que se asemeja a los cánceres humanos. Actualmente, los principales enfoques utilizados para crear modelos animales de cáncer involucran la ingeniería genética y celular trasplante11. Modelos animales modificados genéticamente son buenas herramientas para la identificación y validación de genes diana, así como la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes la toxicidad droga-...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Los autores desean dar las gracias al personal de la Cirugía Experimental y laboratorio Animal de la Facultad de medicina de la Universidad Rey Saud, por su cooperación y apoyo, especialmente Hussain Almukhayzim y Hisham Aloudah. Los autores también desean reconocer el equipo de medios de comunicación de Rey Saud bin Abdul-Aziz University para preparar el visual material especialmente Muath bin Ghannam y Abdulwahab Alsulami.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
FBS Gibco/Invitrogen10270106
DMEM alto contenido de glucosa SigmaD5671-500ML
Penicilina/estreptomicina Life Technology15070063
solución salina fisiológica estérilSigma S0817-1GA
Línea celular HepG2 humanaATCC, EE. UUHB-8065
Médula ósea humana MSCs línea celular PromoCell, EE. UUC-12974
tejido de cordón umbilical humano MSCsPromoCell, EE. UU.  C-12971
Ketamina 50%Rompun, Bayer
Xilacina 2%Rompun23076-35-9
Alphadine®   solución.Riyadh PharmaLBL0816
Desechables:  < / fuerte>
15mL Tubo de centrífuga de polipropileno de alta claridad PPHalcón  
placas de cultivo estériles UpCell de 3,5 cm con el papel de filtro (membrana)Sigma174904-1CS
100-1000 µ l   Puntas de pipeta SigmaCLS4868-1000EA   
Procedimiento básico CortinaThermofisherPMD5293.0
Equipment  Pipeta
Plus, volumen variableEppendorf®   Investigación®Z683779-1EA
Incubadora de cultivo de tejidos 37 ° C, 5% CO2Cualquier marca
Cabina de seguridad biológicaCualquier marca
Incubadora de cultivo de tejidos 20 ° C, 5% CO2Cualquier marca
Herramientas quirúrgicas estériles y ratas desnudas: 
Pinzas
Tijeras
bisturí  
  Sutura de nylon  5-0AccutomeAB-3854SMonofilamento, Lanceta
1 ml Jeringas de TuberculinaFisher Scientific14-826-88
Ratas desnudas Río
. . 352097 Charles

Referencias

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