Análisis colorimétrico de lactato intracelular en pequeña escala y del piruvato en el nematodo Caenorhabditis elegans

Resumen

Describimos una extracción en pequeña escala modificada y análisis colorimétricos de lactato y piruvato en el nematodo elegans C.. Cuando se utilizan kits de ensayo comerciales, el desarrollo técnico de su sensibilidad y su precisión es importante. Precipitación de proteínas en la extracción es el paso más crítico para la determinación cuantitativa de los metabolitos intracelulares.

Resumen

Lactato y piruvato son intermediarios clave de vías metabólicas de energía intracelular. Monitoreo de la relación lactato/piruvato en las células ayuda a determinar si existe un desequilibrio en el metabolismo de la energía relacionada con la edad entre la fosforilación oxidativa mitocondrial y la glucólisis aeróbica. A continuación, os mostramos la utilización de kits de ensayo colorimétricos comerciales para lactato y piruvato en el organismo modelo Caenorhabditis elegans. Recientemente, la sensibilidad y la precisión de los kits de ensayo colorimétricos/fluorimétrico han mejorado grandemente por la investigación y desarrollo llevado a cabo por los fabricantes de reactivos. Los mejores reactivos han permitido el uso de ensayos en pequeña escala con una placa de 96 pocillos en C. elegans. En general, un ensayo fluorimétrico es superior en sensibilidad para un ensayo colorimétrico; sin embargo, el método colorimétrico es más conveniente para el uso en laboratorios comunes. Otra cuestión importante en estos ensayos para la determinación cuantitativa es la precipitación de la proteína de homogeneizado de C. elegans muestras. En nuestro método de precipitación de la proteína, precipitados comunes (por ej., ácido tricloroacético, ácido perclórico y ácido metafosfórico) se utilizan para la preparación de la muestra. Una muestra de ensayo libre de proteína es preparada agregando directamente Frío precipitado (concentración final de 5%) durante la homogeneización.

Introducción

Concentraciones de lactato y piruvato son consideradas ampliamente como productos intermedios del metabolismo energético y están relacionados con los Estados de la glicolisis, ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y cadena de transporte de electrones en las células de organismos aerobios. Una serie de reacciones en la glicolisis se oxida glucosa a piruvato, que se encuentra en una encrucijada metabólica y puede convertir a los carbohidratos a través de la gluconeogénesis, a ácidos grasos y el metabolismo de la energía a través de acetil-CoA y al aminoácido alanina. El ciclo TCA se produce bajo la presencia de suficiente oxígeno disuelto y es fundamental para la convers....

Protocolo

1. sincronizada cultura de C. elegans

1. Antes de sembrar, la cultura la Escherichia coli (e. coli) tensión OP50 durante la noche a 37 ° C en 300 mL de medio líquido de caldo Luria-Bertani (LB). Tienda OP50 cultivadas a-4 ° C.
   1. Para hacer el medio líquido caldo LB, use 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 10 g de NaCl y 1,5 mL de NaOH N 1 y añadir a 1 L con agua desionizada. Autoclave.
      Nota: Las cepas OP50 y C. elegans están disponibles en el centro de genética de Caenorhabditis (Universidad de Minnesota, St. Paul, MN, USA).
2. Para hacer agar de nematodos crecimiento medio (NGM), uso d....

Resultados

Usando el análisis colorimétricos para la determinación cuantitativa de las concentraciones de lactato y piruvato, demostró la exactitud de estos análisis en comparación con informes anteriores en la C. elegans^7,8. Aquí, el proceso de precipitación de la proteína durante la extracción de la muestra fue el paso más crucial para generar valores precisos. Para la precipitación de la proteína, precipitados comunes (e.g

Discusión

Al utilizar estos kits de ensayo colorimétricos, el paso más crítico en la extracción de la muestra para detectar celular lactato y piruvato exactamente en C. elegans es el proceso de precipitación de la proteína durante la homogeneización (figura 1). No es estrictamente necesario utilizar un homogeneizador de teflón, como otros homogeneizadores (e.g., Dounce y Rectificadoras de tejido, o molinos de grano) son también adecuados para la extracción en pequeña escala de gusano.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de ensayo colorimétrico/fluorimétrico de lactato	BioVision	#K607-100	ensayos colorimétricos/fluorimétricos 100; Almacenar a -20oC
EnzyChrom Pyruvate Assay Kit	BioAssay Systems	#EPYR-100	colorimétricos/fluorométricos 100 ensayos; Almacenar a -20oC
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	#23225	ensayo colorimétrico; almacenar en
Ácido tricloroacético	Wako Pure Chemical	#207-04955	almacenar a temperatura ambiente
Homogeneizador de teflón	Iwaki/Pyrex	#358034 (Wheaton)	En lugar de Iwaki/Pyrex, disponibles por Wheaton

a temperatura ambiente