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Artículo de método

Alta resolución comparación de frecuencias de la conjugación bacteriana

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DOI:

10.3791/57812

⸱

10 de enero de 2019

 ,  , 
1Applied Chemistry and Biochemical Engineering Course, Department of Engineering, Graduate School of Integrated Science and Technology, Shizuoka University, 2Department of Bioscience, Graduated School of Science and Technology, Shizuoka University, 3Japan Collection of Microorganisms, RIKEN BioResource Research Center

En este artículo

Resumen

Con el objetivo de entender el comportamiento de los distintos elementos de ADN conjugativos bacterianos bajo condiciones diferentes, se describe un protocolo para la detección de diferencias en la frecuencia de conjugación, con alta resolución, para estimar cómo eficazmente la bacteria donante inicia verbal.

Resumen

Conjugación bacteriana es un paso importante en la transferencia horizontal de genes de resistencia a los antibióticos a través de un elemento de DNA conjugativos. Profundidad comparaciones de frecuencia verbal bajo diferentes condiciones se requieren para entender cómo se propaga el elemento conjugativos en la naturaleza. Sin embargo, los métodos convencionales para comparar frecuencia de conjugación no son apropiados para comparaciones de profundidad debido al alta fondo causado por la ocurrencia de eventos verbal adicional en la placa selectiva. Hemos reducido con éxito el fondo introduciendo un método número más probable de (proveedores médicos MPN) y una mayor concentración de antibióticos para prevenir la conjugación en medio líquido selectivo. Además, hemos desarrollado un protocolo para estimar la probabilidad de cómo a menudo donantes las células iniciar verbal por clasificar las células donantes solo en piscinas de receptores por célula activada por fluorescencia (FACS) de clasificación. Uso de dos plásmidos, pBP136 y pCAR1, las diferencias en la frecuencia de conjugación en las células de Pseudomonas putida podrían detectarse en medio líquido a diferentes velocidades de agitación. Las frecuencias de iniciación verbal eran más altas para pBP136 que para pCAR1. Con estos resultados, podemos comprender mejor las características de la conjugación de estos dos plásmidos.

Introducción

Conjugación bacteriana de plásmidos conjugativos y elementos genéticos móviles y elementos conjugativos e integrativo (CIEM) es importante para la diseminación horizontal de información genética. Puede promover la adaptación y evolución bacteriana rápida y transmitir genes de multirresistencia1,2. La frecuencia de conjugación puede verse afectada por las proteínas codificadas en los elementos conjugativos para movilización de ADN (MOB) y acoplamiento par formación (MPF), incluyendo el pili sexual, que se clasifica según MOB y MPF tipo3,4, 5. También puede verse afectado por el donante y el recipiente par6 y las condiciones de crecimiento de las células7,8,9,10,11,()12 tasa de crecimiento, densidad celular, superficie sólida o medio líquido, temperatura, disponibilidad de nutrientes y la presencia de cationes). Para entender cómo los elementos conjugativos extensión entre las bacterias, es necesario comparar la frecuencia de conjugación en detalle.

La frecuencia de Conjugación entre donante y receptoras parejas después de aparearse se estima generalmente por los métodos convencionales como sigue. (i) en primer lugar, se cuenta el número de colonias de donante y receptor; (ii) luego, se cuentan las colonias receptoras, que recibió los elementos conjugativos (= transconjugants); (iii) y por último, la frecuencia de conjugación se calcula dividiendo las colonias formando unidades (UFC) de la transconjugants los de la donante o destinatario13. Sin embargo, cuando se utiliza este método, el fondo es alto debido a los acontecimientos verbal adicional que también pueden ocurrir en las placas selectivas para obtener transconjugants cuando la densidad celular alta10. Por lo tanto, es difícil de detectar pequeñas diferencias en la frecuencia (por debajo de una diferencia de 10 veces). Recientemente hemos introducido un método de (MPN) número más probable utilizar medio líquido que contiene una mayor concentración de antibióticos. Este método reduce el fondo al inhibir la conjugación en medio selectivo; así, la frecuencia verbal podría ser estimada con mayor resolución.

Verbal se puede dividir en tres pasos: (1) accesorio de donantes y receptores par (2) Inicio de la transferencia conjugativa y (3) disociación del par14. Durante los pasos (1) y (3), no hay interacción física entre el donante y el receptoras células; por lo tanto, la densidad celular y las condiciones ambientales pueden influir estos pasos, aunque también son importantes las características de la pili del sexo. Paso (2) probablemente está regulada por la expresión de varios genes involucrados en la verbal en respuesta a cambios externos, que podrían ser afectadas por diversas características del plásmido, donante y receptor. Aunque el apego físico o la separación de pares donante-receptor puede ser matemáticamente simulada utilizando una estimación de las células como partículas, debe medirse experimentalmente la frecuencia de paso (2). Ha habido algunos informes sobre observaciones directas de cómo a menudo los donantes pueden iniciar verbal [paso (2)] mediante microscopía de fluorescencia de15,16; sin embargo, estos métodos no son alto rendimiento porque un gran número de células debe controlarse. Por lo tanto, hemos desarrollado un nuevo método para estimar la probabilidad de la ocurrencia de paso (2) mediante el uso de celular de fluorescencia activada (FACS) de clasificación. Nuestro método se puede aplicar a cualquier plásmido, sin identificación de los genes esenciales para la conjugación.

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Protocolo

1. preparación de un donante con proteína verde fluorescente (GFP)-kanamicina resistencia Gene-Tagged plásmidos y

  1. Introducción de genes marcadores en el pBP136 del plásmido objetivo
    Nota: El objetivo de este protocolo es generar pBP136::gfp. Las cepas de bacterias y plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la tabla 1.
    1. Crecen cultivos de Escherichia coli DH10B albergar pBP13617 en 5 mL de caldo Luria estéril (LB) y e. coli S17 1λpir18 que pJBA2819 [que contiene un kanamicina (Km)-gfp gene y de resistencia mut3 * gene con su promotor y terminador en un mini-Tn5] en 5 mL de LB estéril que contiene 50 μg/mL Km a 37 ° C durante la noche (O/N, 16 – 24 h) con agitación a 200 revoluciones por minuto (rpm).
    2. Recolección y lavado
      1. 1 mL de cada cultivo de cosecha, coloque en un microtubo 2 mL y centrifugar (10.000 × g, temperatura ambiente, 2 minutos). A continuación, deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 2 mL de tampón de fosfato estéril salino (PBS).
      2. Centrifugar nuevamente (10.000 × g, temperatura ambiente, 2 minutos) y resuspender en 500 μL de PBS estéril.
    3. Filtro de acoplamiento
      1. Preparar placas LB estériles (con 1.6% de agar) y coloque un filtro de membrana de tamaño de poro de estéril 0,22 μm en él. Mezcla 500 μL de e. coli S17-1λpir que pJBA28 con e. coli DH10B albergar pBP136 y punto la mezcla en el filtro de la placa LB. Incube la placa O/N a 30 ° C. Quite el filtro de la placa LB, colóquelo en un tubo de plástico estéril de 50 mL y añadir 1 mL de PBS estéril.
        Nota: pJBA28 puede replicar en la presencia de la proteína Π, codificada por el gen pir 18y puede ser transferido de 1λ S17pir a DH10B. pBP136 lleva ningún marcador gen17 y pueden ser transferidos de DH10B a S17 1λpir. Por lo tanto, no nos podríamos distinguir S17 1λpir que pBP136 y pJBA28 de pBP136 que DH10B y el mini-Tn5 (transpuesta en el cromosoma o pBP136) en esta etapa. Luego, utilizamos mezclas de ellos como donantes en los pasos posteriores (1.1.4.–1.1.5.).
    4. Cultivar una cultura de O/N de la mezcla anterior acoplamiento en LB estéril que contiene 50 μg/mL Km a 37 ° C con agitación a 200 rpm y una cultura de Pseudomonas putida KT2440 [Km-sensible (Kms), sensibles a la rifampicina (Rifs), sensibles a la gentamicina (Gms) y resistente a la tetraciclina (Tcr)] en medio con Tc de 12,5 μg/mL a 30 ° C con agitación a 200 rpm.
    5. Después de la cosecha y lavado las células como en el paso 1.1.2, usan (acoplamiento mezcla y KT2440) para filtro de acoplamiento (O/N, 30 ° C) como en el paso 1.1.3.
    6. Preparar las placas LB estériles que contiene 50 μg/mL Km y 12,5 μg/mL de CT (LB + Km + Tc placas).
    7. Diluir la mezcla resuspendida en el filtro de membrana con PBS estéril (1– 10 105-fold) y entonces cada dilución en LB + Km + Tc placas e incubar las placas a 30 ° C por 2 – 3 d.
    8. Recoger las colonias de las placas, cultivar una cultura de O/N en LB estéril que contiene Km Tc como P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr y Gmr)6 en LB estéril que contiene Rif (25 μg/mL) y Gm (30 μg/mL) en 30 ° C y 200 rpm.
      Nota: Como se describe en la nota anterior, las colonias en la LB + Km + Tc placas (de 1.1.7.) puedan KT2440 que pBP136 llevar un mini Tn5 y KT2440 con un mini-Tn5, porque pJBA28 podrían ser transferidos directamente desde S17 1λpir que pBP136 y pJBA28 a KT2440. Por esta razón otro acoplamiento con CA10RG p. resinovorans es necesaria para obtener el pBP136 de blanco con un mini-Tn5 en los siguientes pasos.
    9. Después de la cosecha y lavado las células como en el paso 1.1.2, utilizarlos para el filtro de acoplamiento (O/N, 30 ° C) como en el paso 1.1.3.
    10. Preparar las placas LB estériles que contiene Rif, Gm y Km (LB + Rif + Km + Gm placas).
    11. Agite la mezcla en el filtro y luego diluirla 101– 105-doblar, extender sobre LB + Rif + Km + Gm placas e incubar las placas por 2 – 3 d a 30 ° C.
    12. Seleccionar las colonias y compruebe si albergan pBP136 por PCR usando las cartillas específicas para el plásmido.
  2. Introducción de un gen marcador selectivo en el pCAR1 del plásmido objetivo
    Nota: El objetivo de este protocolo es generar pCAR1::gfp
    1. Cultivar una cultura de O/N de p. putida KT2440 que pCAR1 (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 a 200 rpm y 30 ° C y e. coli S17 1λpir18 que pJBA28 en 5 mL de LB estéril que contienen 50 μg/mL Km a 200 rpm y 37 ° C.
    2. Después de la cosecha y lavado las células como en el paso 1.1.2, utilizarlos para el filtro de acoplamiento (O/N, 30 ° C) como en el paso 1.1.3.
    3. Quite el filtro de la placa LB, colóquelo en un tubo de plástico estéril de 50 mL y añadir 1 mL de PBS estéril.
    4. Diluir la mezcla resuspendida con PBS estéril (1– 10 105-fold) y extienda la mezcla diluida en LB selectivo estéril + Tc + Km placas.
      Nota: pCAR1 no replica en e. coli; así, p. putida KT2440 que pCAR1 con un mini-Tn5 puede seleccionarse en LB + Tc + Km placas.
    5. Elige una colonia de la placa y cultivar una cultura de O/N en LB estéril que contiene Km y la Tc y la cultura de P. resinovorans CA10dm4RG en LB estéril que contiene Rif y Gm (200 rpm, 30 ° C).
    6. Después de la cosecha y lavado como en el paso 1.1.2, usar las células para el filtro de acoplamiento (O/N, 30 ° C) como en el paso 1.1.3.
    7. Agite la mezcla en el filtro y luego diluirla, se diseminan en LB + Rif + Km + Gm placas e incubar las placas por 2 – 3 d a 30 ° C.
    8. Seleccionar las colonias y compruebe si albergan pCAR1 por PCR con iniciadores específicos para el plásmido.
  3. Confirmar la transferencia de la plásmidos etiquetado y preparación de los donantes para los próximos pasos
    Nota: El objetivo de este protocolo es confirmar la transferencia de la plásmidos construida anteriormente y preparar a los donantes para los próximos pasos.
    1. Cultivar una cultura de O/N de p. resinovorans CA10dm4RG que pBP136::gfp o pCAR1::gfp en LB estéril que contiene Km y una cultura de p. putida SMDBS [Kms, Gms, Rifr, Tcr, lacI q, en la cual PA1/O4/O3-gfpmut3* no se expresa debido a su cromosomas lacIq gene]21 en 3 mL de LB con Tc (200 rpm, 30 ° C).
    2. Después de la cosecha y lavado las células como en el paso 1.1.2, utilizarlos para el filtro de acoplamiento (O/N, 30 ° C) como en el paso 1.1.3.
    3. Coloque el filtro en un tubo de plástico estéril de 50 mL y resuspender con 1 mL de PBS estéril. Diluir la mezcla resuspendida con PBS estéril (101– 105-doblar), extensión de la mezcla diluida en LB selectivo estéril + Tc + Km placas.
    4. Seleccionar las colonias y compruebe si albergan cada uno de la plásmidos por PCR con iniciadores específicos.
      Nota: Confirmación de la posición de inserción de los mini-Tn5 por la secuencia directa después de la extracción de plásmidos es opcional, para confirmar que la inserción no afecta la función de transferencia de la plásmidos.

2. cálculo de la frecuencia de conjugación por el método MPN

  1. Preparación estéril LB Km y LB + Gm placas.
  2. Cultivar una cultura de O/N de p. putida SMDBS que pBP136::gfp o pCAR1::gfp en 3 mL de LB estéril que contiene Km y una cultura de p. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) en 3 mL de LB con Gm (140 rpm, 30 ° C).
  3. Después de la cosecha y lavado las células como en el paso 1.1.2, utilizarlos para filtro de acoplamiento a 30 ° C por 45 min como en el paso 1.1.3.
  4. Diluidos en serie anterior donante y receptor (1 -10 107) de la cultura y difundirla en LB + Km (donante) o LB + Gm (destinatario) placas (cada uno por triplicado) para contar las colonias formando unidades (UFC). Incubar las placas a 30 ° C por 2 d.
  5. Agite la mezcla en el filtro en LB estéril que contiene Km y Gm y diluir en serie (de 21 224-107.2) utilizando una placa de cultivo celular de 96 pozos (por cuadruplicado).
  6. Incubar la placa de 96 pocillos para el momento adecuado (2 d a 30 ° C).
  7. Contar la UFC de donante y receptor en las placas (paso 2.4.) y contar el número de pozos en la que crecen los transconjugants.
  8. Calcular la MPN y su desviación mediante el programa de cálculo de MPN desarrollado por Jarvis et al. 22, que está disponible en http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls.
    1. Escriba el nombre del experimento (por ejemplo, 'test'), la fecha del experimento (por ejemplo, 2018/4/9), el número de serie de la prueba y el máximo. jajaja de diluciones (entrar en '24') en la hoja de la fila #7 del 'Programa' de Excel archivo ('MPN_ver5.xls').
    2. Escribir ' 2-1 (= 0.5) a 2-24 (= 5.96 × 10-8)' en la columna 'factor de dilución d', '0,01' columna 'volumen en ml o g w'y 4' en ' no. de tubos n' en las tablas automáticamente producidas de 'datos'.
    3. Introduzca el número de pozos en la que los transconjugants crecen en cada dilución de la muestra (0-4).
    4. Presione el botón de 'Calcular resultados' superior derecho y luego obtener los resultados (en MPN/μL) y sus límites de confianza de 95% (inferiores y superiores).
  9. Calcular la frecuencia de conjugación de la plásmidos al dividir el número de transconjugants (MPN/mL) por el número de donantes y receptores células (CFU/mL).

3. preparación para la estimación de la probabilidad de donantes iniciada Conjugación

  1. Cultivar una cultura de O/N de p. putida SMDBS que pBP136::gfp o pCAR1::gfp en 3 mL de LB estéril que contiene Km y una cultura de p. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) en 3 mL de LB estéril que contiene Gm utilizando 300 mL frascos (140 rpm, 30 ° C) como precultures.
  2. Transfiera 200 μL de las planas en 200 mL de LB estéril fresca que contiene Km o Gm en matraces de 500 mL e incubar a 30 ° C con agitación a 140 rpm.
  3. Medir la turbiedad a 600 nm (OD600) de la cultura mediante un espectrofotómetro UV-VIS y un lugar la cultura, diluido en LB (101– 108-fold diluciones), sobre una placa LB con Km o placas g incubar estos LB a 30 ° C por 1 – 2 d y determinar la UFC.
  4. Representar los valores de OD600 y la UFC con el tiempo de crecimiento para generar las curvas de crecimiento de donante y receptor.
  5. Crecen cultivos de la cepa donante y el recipiente a la fase de registro medio, basado en la curva de crecimiento.
  6. Después de la cosecha y lavado de las células, preparar 101– 103 CFU del donante en 10 μL de LB y5– 10 107 UFC de destinatario en 100 μL de LB.
  7. Mezclar 10 μL de la donante y 100 μL de las culturas receptores a diferentes densidades en placas de 96 pocillos (por triplicado). Por ejemplo, mezclar 101 UFC de la donante y 105 CFU del destinatario y añadir a cada uno de los 96 pocillos y mezclar 101 UFC del donante y 106 UFC de la receptora en otra placa de 96 pocillos, y así sucesivamente.
  8. Incubar la mezcla a 30 ° C por 45 min y luego añadir las altas concentraciones de antibióticos (100 μg/mL Km y 60 μg/mL Gm) a cada pocillo para inhibir la conjugación.
  9. Incubar la placa a 30 ° C por 2 d.
  10. Contar el número de pozos en la que crecen transconjugants.
  11. Elegir la densidad de receptores que es apropiada para la estimación de la probabilidad de donantes iniciada verbal basado en los datos anteriores (transconjugants debe encontrarse en al menos 1 de una placa de 96 pocillos).
    Nota: Transconjugants crecerá en todos los pozos cuando las densidades de las células del donante y receptor son altas y más de una conjugación se produce en un pozo. En cambio, no transconjugants se encontrará en cualquier pozos, cuando la densidad celular es demasiado baja. En la siguiente sección, una célula del donante solo se ordena en un pozo. Por lo tanto, la densidad de receptores debe ser al máximo.

4. estimación de la probabilidad de donantes iniciada Conjugación

  1. Preparar 200 mL de una cultura de fase logarítmica media de donantes SMDBS de p. putida que pBP136::gfp o pCAR1::gfp y destinatario p. putida KT2440RGD, como se describe en 3.6 – 3.7.
  2. Lugar 106 UFC de destinatario en 100 μL de LB en cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
  3. Configurar el sistema FACS (clasificador flujo de citometría y celular con un brazo robótico, un láser de argón 488 nm y un orificio de la boquilla 70 μm). Establece en forward scatter (FSC), con un umbral del 1% como el gatillo de la adquisición. Ajustar la ganancia de H y un aumento del FSC y la dispersión lateral (SSC) en sensibilidad máxima, que puede excluir falsas señales positivas, utilizando PBS como un control negativo. Configurar la puerta de clase partiendo de FSC y SSC y el modo de ordenación de gota de 0,5 para la pureza de la especie máxima.
  4. Especie una célula donante único por FACS en una placa LB (384 puntos diferentes), incubar la placa a 30 ° C por 2 d y luego cuenta cuántas colonias aparecen sobre la placa de las células clasificadas.
    Nota: Este procedimiento es para la validación de la puerta del conjunto. Si hay 384 colonias en la placa, significa que el 100% de las células ordenadas podrían formar colonias. La vigencia promedio de la clasificación siempre es 90 – 95%.
  5. Ordenar una célula donante único por FACS en cada pocillo de una placa de 96 pocillos con el destinatario (4.2).
  6. Incubar la placa por 45 min a 30 ° C y luego añadir altas concentraciones de antibióticos (100 μg/mL Km y 60 μg/mL Gm) a cada pocillo para evitar más verbal.
  7. Incubar la placa a 30 ° C por 2 d.
  8. Contar el número de pozos en los que transconjugants creció como determinado por la inspección visual con el ojo desnudo.
  9. Calcular la probabilidad de donantes iniciada Conjugación dividiendo el número de pozos con transconjugants por el número total de pozos en los que el donante se clasificó.

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Resultados

Comparación de la frecuencia de conjugación por el método MPN

En nuestro informe anterior, se compararon las frecuencias de la conjugación del pBP136::gfp y pCAR1::gfp en triple diluido medio líquido LB (1/3 LB) con diferentes velocidades de agitación después de un apareamiento de 45 min con 125 mL spinner frascos10. Se compararon las frecuencias de la conjugación del pBP136::gfp y...

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Discusión

Aquí, presentamos un protocolo de alta resolución para la detección de diferencias en la frecuencia de conjugación bajo diferentes condiciones, utilizando un método MPN para estimar el número de transconjugants. Un paso importante en el protocolo es diluir la mezcla de donante y receptor después de aparearse hasta que no transconjugants crecen. Otro paso es añadiendo altas concentraciones de antibióticos en el medio líquido selectivo para evitar más verbal. Estos procedimientos pueden reducir el fondo causado por la conj...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Dr. K. Kamachi de Instituto Nacional de enfermedades infecciosas (Japón) para proporcionar pBP136 y Prof. Dr. H. Nojiri de la Universidad de Tokio (Japón) para proporcionar pCAR1. También agradecemos al profesor Dr. Molin Sølen de la Universidad técnica de Dinamarca para proporcionar pJBA28. Este trabajo fue apoyado por KAKENHI JSPS (números de concesión 15H 05618 y 15KK0278) para MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
MoFlo XDPBeckman-CoulterML99030FACS
IsoFlowBeckman-Coulter8599600Solución de vaina
Fluorosferas (10 μ m)Beckman-Coulter6605359cuentas para configurar la incubadora FACS
Yamato Scientific Co. Ltd211197-IC802
Espectrofotómetro UV-VIS UV-1800SIMADZU CorporationUV-1800
placas de 96 pocillosNIPPON Genetics Co, LtdTR5003
tipo microplaca Placa de PetriAXEL1-9668-01para la validación de la clasificación
filtro de membranaADVANTECC045A025Apara pipetas de acoplamiento de filtros
Nichiryo CO. Ltd00-NPX2-20,
00-NPX2-200,
00-NPX2-1000		0.5-10 μ L, 20-200 μ L, 100-1000 μ
L pipetas multicanalNichiryo CO. Ltd00-NPM-8VP,
00-NPM-8LP		0.5-10 μ L, 20-200 μ L
TriptonaBD Difco211705
Extracto de levaduraBD Difco212750
NaClSigmaS-5886
AgarNakarai tesque01162-15
rifampicinaWako185-01003
gentamicinaWako077-02974
kanamicinaWako115-00342
Placa de PetriAXEL3-1491-51JPND90-15
microtubosFukaekasei131-815C
500 mL matraz giratorio desechableCorningCLS3578

Referencias

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