Un enfoque de mutagénesis de saturación novela: Solo paso caracterización de sitios en el ARN usando fosforotioatos de unión de proteína reguladora

Resumen

Las proteínas que se unen a secuencias específicas de RNA desempeñan papeles críticos en la expresión génica. Caracterización detallada de estos sitios de Unión es crucial para nuestra comprensión de la regulación génica. Aquí, se describe un enfoque solo paso para la mutagénesis de la saturación de los sitios de unión a proteínas en el ARN. Este enfoque es relevante para todos los sitios de unión a proteínas en el ARN.

Resumen

Regulación de los genes desempeña un papel importante en el desarrollo. Numerosas proteínas de unión de ADN y ARN unen sus secuencias diana con alta especificidad para el control de la expresión génica. Estas proteínas reguladoras controlan la expresión génica a nivel de ADN (transcripción) o a nivel de RNA (splicing pre-mRNA, poliadenilación, transporte del mRNA, decaimiento y traducción). Identificación de secuencias reguladoras ayudan a entender no sólo cómo un gen es activado o desactivado, sino también qué genes aguas abajo están regulados por una proteína reguladora particular. Aquí, describimos un enfoque de un paso que permite la mutagénesis de saturación de un sitio de unión de la proteína en el ARN. Se trata de dopaje de la plantilla de la DNA con wild-type de nucleótidos dentro del sitio de Unión, síntesis de RNAs separados con cada nucleótido fosfotioato y el aislamiento de la fracción unida tras incubación con proteína. Interferencia de nucleótidos wild-type resulta en su exclusión preferencial de la fracción unida a las proteínas. Esto se controla por electroforesis del gel siguiendo la hendidura química selectiva con yodo de fosfodiéster que contiene fosforotioatos (mutagénesis fosfotioato o PTM). Este enfoque de mutagénesis de saturación solo paso es aplicable a la caracterización de cualquier sitio de unión de la proteína en el ARN.

Introducción

Regulación de los genes juega un papel importante en biología. Genes pueden ser regulados a nivel de transcripción splicing pre-mRNA, 3' final de formación, exportación del RNA, traducción, localización de mRNA, decaimiento, estabilidad de modificación poste-de translación, etc. que ambos DNA y RNA-proteínas desempeñan un papel clave en la gene Reglamento. Mientras que los análisis genéticos moleculares han identificado numerosas proteínas reguladoras, solamente un subconjunto pequeño de ellos se han caracterizado completamente para sus funciones celulares o sitios de enlace en vivo. Mutagénesis y análisis filogenético de la secuencia ofrecen enfoques complementarios para caracterizar las interacciones entre proteínas DNA o RNA.

Proteínas RNA-que atan son importantes en procesos de desarrollo, incluyendo la diferenciación sexual. La proteína de Drosophila Sex-lethal (SXL) o la proteína sexo interruptor está ausente en los machos, pero presente en las hembras. Reconoce secuencias ricas en uridina o pirimidina-zonas adyacentes a sitios específicos del empalme en blancos de abajo pre-mRNA (transformador, sexo letaly lethal2 específicas del hombre) en células somáticas^{1,2 ,3,4}. Además, regula el sitio de poliadenilación conmutación atando a las secuencias enhancer ricos en uridina poliadenilación en la transcripción potenciador de rudimentario (e)^5,6. Probable de SXL regula objetivos adicionales en la línea germinal femenina que están pendientes de ser identificados^{1,7,8,9,10,11, 12 , 13}.

Por lo general, caracterización de un sitio de Unión consiste en mutagénesis, por ejemplo, por eliminación o sustitución de uno o varios nucleótidos. Cada sitio de Unión mutante, en relación con la secuencia de ARN de tipo salvaje, luego se analiza mediante una serie de concentraciones de proteína para determinar su afinidad (K_d o equilibrio disociación constante) de la proteína de interés; K_d es la concentración de proteína necesaria para obtener la Unión del RNA de 50%. Este proceso requiere mucho trabajo de detallado mutagénesis implica la generación y análisis de numerosos mutantes — tres nucleótidos del tipo no salvaje para cada posición en el sitio de Unión. Así, hay una necesidad de un enfoque alternativo para la mutagénesis de la saturación más rápido, más simple y barato de sitios de unión de la proteína en el ARN.

Aquí, describimos un enfoque de un paso que permite la mutagénesis de saturación de un sitio de unión de la proteína en el ARN. Se trata de dopaje de la plantilla de la DNA con wild-type de nucleótidos dentro del sitio de Unión, síntesis de RNAs separados con cada nucleótido fosfotioato y el aislamiento de la fracción unida tras incubación con proteína. Interferencia de nucleótidos wild-type resulta en su exclusión preferencial de la fracción unida a las proteínas. Esto se controla por electroforesis del gel siguiendo la hendidura química selectiva con yodo de fosfodiéster que contiene fosforotioatos (mutagénesis fosfotioato o PTM). Este enfoque de mutagénesis de saturación solo paso es aplicable a la caracterización de cualquier sitio de unión de la proteína en el ARN.

Protocolo

Nota: Figura 1 ofrece una visión general del fosfotioato mutagénesis y resume los pasos clave en el proceso.

1. generación de una biblioteca de mutantes: dopaje en la plantilla de la DNA con nucleótidos no wild Type

1. Sintetizar T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') por síntesis química en un sintetizador de ADN.
2. Sintetizar un oligonucleótido dopado (filamento complementario) por síntesis química en un sintetizador de ADN correspondiente al sitio de unión de la proteína. Utilizar una mezcla apropiada de phosphoramidites durante la síntesis química para cada sitio de dopaje (X abajo) con una proporción de 90% A como el nucleótido de tipo salvaje y el 10% T como el tipo no salvaje nucleótido (ver resultados representativos para más detalles sobre esta relación).
   Nota: Aquí, la secuencia de los oligonucleótidos dopado es 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. La secuencia subrayada es el complemento reverso de sitio de unión de la proteína SXL, más nucleótidos adicionales fuera del sitio de enlace que proporcionan útiles controles confirma que no todos los cambios en el ARN afectan vinculante, así como controles de carga para comparación y la normalización de los nucleótidos en el sitio de Unión. La secuencia del sitio de SXL-enlace UUUUUGUUGUUUUUUUU, que está presente en el transformador de pre-mRNA^14,15,16,17, se utilizó para diseñar la metodología propuesta. La secuencia en cursiva es complementaria a la secuencia de primer T7 y es el promotor de T7 en vitro de la transcripción.

2. síntesis del ARN

1. Sintetizar el RNA en una reacción de transcripción de 20 μl, como se describió anteriormente¹⁸.
   1. Transcripción de T7 mezcla buffer y oligonucleótidos de T7 de 1 μm, 1 μm dopado oligonucleótidos, 10 mM Ditiotreitol (DTT), GTP, de 2 mM 1 mM ATP, CTP y UTP (trifosfato de guanosina, adenosina, citidina y uridina) y 2 U/μl T7 ARN polimerasa.
   2. Añadir en dos tubos de microcentrífuga separado, 0,167 mM α-thio ATP o 0,05 mM α-thio UTP incorporar fosforotioatos (ver esquemas en figura 2) de RNAs.
      Nota: Para protocolos alternativos, agregar 0,2 mM α-thio CTP o 0,2 mM α-thio GTP en una reacción adecuada transcripción que contiene un oligonucleótido dopado para probar las dos substituciones del nucleótido.
   3. Incubar la mezcla de reacción de síntesis de RNA por 2 h a 37 ° C.
2. Añadir 2,5 μl termolábil la fosfatasa alcalina y 2,5 μl de tampón de 10xphosphatase a la muestra de RNA. Incubar esta reacción 25 μl 10-30 min a 37 ° C para eliminar 5' fosfatos.
3. Inactivar la enzima fosfatasa alcalina por calentamiento a 80 ° C 2 – 5 minutos.
4. Radiolabel el extremo 5' del ARN desfosforilatado (5 pmole) usando 1 μl T4 Polinucleótido la cinasa y 1 μl γ -³²P ATP en un volumen de reacción de 10 μl. Incubar la mezcla de reacción durante 30 – 60 min a 37 ° C.
5. Inactivar la enzima de T4 Polinucleótido kinasa por calentamiento a 65 ° C durante 20-30 minutos.
6. Gel de purificar el RNA por electroforesis en un gel de poliacrilamida que desnaturaliza el 10%. Ubicar el RNA en el gel por autorradiografía. Suprimir el trozo de gel que contiene RNA radiactivo, machacar en un tubo de microcentrífuga presionando contra las paredes con una punta de pipeta y remoje en buffer de proteinasa K (PK) (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% dodecil sulfato de sodio). Gire el tubo a temperatura ambiente desde 2 h hasta toda la noche.
7. Centrifugar la mezcla de gel, deseche el gel y recoger la solución tampón.
8. Extraer la solución dos veces con un volumen igual de fenol-cloroformo y una vez con cloroformo y recoger la fase acuosa.
9. Añadir el volumen de fase acuosa 0.1 de 3M acetato de sodio, pH 5.2, portador de la tRNA o glucógeno y 2.5 volumen de etanol. Mantener la muestra a-80 ° C durante 1 h.
10. Centrifugar la muestra durante 5 – 10 minutos en una microcentrífuga de alta velocidad a 16.873 x g. Retire con cuidado la solución tampón y etanol sin perturbar el pellet de RNA.
11. Lavar el pellet con etanol 70% y centrifugar durante 2 – 5 minutos Retire etanol cuidadosamente. Secar el precipitado en el aire.
12. Resuspender el precipitado en 20 – 50 μl dietil pirocarbonato (DEPC)-agua tratada. Almacenar a-20 ° C hasta su uso.
    Nota: Realice todos los pasos con ARN radiactivo utilizando las precauciones apropiadas y una pantalla de plexiglás para proteger de la radiactividad. En la actualidad, columnas de spin son más utilizado y más conveniente para eliminar radioactividad no constituidas en sociedad, como alternativa a la purificación del gel del ARN.

3. proteína vinculante la reacción y la separación del ARN dependiente

1. Expresar la proteína recombinante y purificar de e. coli.
2. Estimar la concentración de la proteína recombinante por espectrofotometría o por separación en un gel de SDS-poliacrilamida junto a una conocida proteína bovina, estándar albúmina sérica (BSA). Visualizar la proteína de interés y del estándar de BSA por tinción del gel con azul brillante de Coomassie R-250. Cuantificar la proteína en comparación con cantidades conocidas de diluciones de BSA en el mismo gel.
   Nota: Almacenar proteína recombinante a - 80 ° C hasta su uso y diluir en 20 mM 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido el ácido (HEPES), pH 8.0, 1 mM Ditiotreitol (DTT), 0,2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 0.05% NP-40, 20% de glicerol. Uso de 0.5 – 1.0 el mM proteasa inhibidor fenilmetano sulfonil fluoruro (PMSF) es opcional.
3. Realizar la reacción de unión de ARN (20-100 μL) de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM TDT, 50 mM KCl, inhibidor de Rnasa de 0,5 unidades/μl 0.09 μg/μl acetilado albúmina de suero bovino, 1 mM EDTA, 0.15 μg/μl tRNA, RNA 5'-end radiactiva y 6 μl de concentración adecuada (un concentración en que ~ 50% de ARN se une a proteína) de la proteína.
   Nota: Este buffer de enlace trabaja para tres proteínas RNA-que atan (SXL, U2AF⁶⁵y PTB), pero debe ser estandarizado para una proteína de interés. Estimar la concentración de proteína empíricamente, utilizando varias diluciones para una preparación determinada proteína, que es necesaria para obtener aproximadamente el 50% obligatorio de RNA. Esta condición o K_d representa la parte más sensible de la curva de unión de ARN.
4. Incubar la reacción de unión de proteína para 20-30 min a 25 ° C (o hielo).
5. Separar la fracción proteína unida al RNA de la fracción no unida utilizando uno de dos enfoques:
   1. Atascamiento del filtro de nitrocelulosa
      1. Aplicar la reacción de unión (20-100 μL) sobre un filtro de nitrocelulosa conectado a un colector de vacío a temperatura ambiente.
         Nota: Sólo el complejo RNA-proteína se retiene en el filtro y desatado RNA fluye a través del filtro. El enfoque de atascamiento del filtro permite mayor recuperación del RNA encuadernado y es más rápido y más sencillo, en comparación con el ensayo de cambio de movilidad de gel. Colocando una membrana DEAE debajo del filtro de nitrocelulosa también es posible recoger la fracción no unida de RNA o libre de RNA para la comparación con la fracción unida.
      2. Cortar la parte del filtro de nitrocelulosa que contiene la retención RNA radiactivo en trozos más pequeños para caber en un tubo de microcentrífuga, remojar en suficiente buffer PK (300 – 500 μl conteniendo 10-20 μg/paq) para la inmersión de las piezas del filtro y eluir el RNA del filtro para 2-3 h o durante la noche.
      3. Extracción con fenol-cloroformo, cloroformo y recoger la fase acuosa. Agregue etanol y acetato de sodio y, después de incubación en el congelador, centrifugar, lavar, secar y resuspender el RNA en agua tratada con DEPC. Siga estos pasos como se indica en pasos 2.10 a 2.14 por encima.
   2. Cambio de movilidad de gel
      1. Preparar y polimerizar un gel de poliacrilamida nativo de 5% (60: 1 Acrylamide:bis-acrilamida) en 0.5 x TBE (tampón de borato-Tris-EDTA estándar) antes de iniciar la reacción de enlace, como una alternativa para el método de atascamiento del filtro.
      2. Funcionamiento previo el gel durante 15 min en 250 V en una cámara fría (4 ° C).
      3. Carga de cada reacción de enlace (arriba) en pocillos separados del gel la ejecución anterior.
         Nota: El buffer de almacenamiento de información de proteína proporciona suficiente glicerol para la carga de la muestra en los pocillos.
      4. Separar el ARN unida a las proteínas por electroforesis en gel en una cámara fría a 250 V para 1 a 2 h, dependiendo del tamaño de RNA y proteínas específicas.
      5. Localizar la posición del complejo RNA-proteína en el gel por autorradiografía. Suprimir el trozo de gel que contiene el complejo ARN-proteína. Eluir el RNA de la rebanada de gel por aplastar la rebanada de gel y sumergirse en el búfer de PK.
      6. Extracción con fenol-cloroformo, cloroformo y recoger la fase acuosa. Añadir etanol y acetato de sodio, después de incubación en el congelador, centrífuga, lave, seque y vuelva a suspender el RNA en agua tratada con DEPC. Siga estos pasos como se indica en pasos 2.10 a 2.14 por encima.

4. Análisis de productos fosfotioato troceados de yodo para la detección de las posiciones del nucleótido mutado

1. Añadir yodo de 1 mM en una 20 μl de agua tratada con DEPC hasta 10 μg portador tRNA que hiende RNAs (RNAs del consolidados y total) en los sitios del fosfotioato incorporación. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
   Nota: Más detalles sobre el escote de yodo con condiciones ligeramente diferentes, iodoethanol del 7% (v/v), calentamiento a 95 ° C por 3 min, puede encontrarse en Gish y Eckstein 1988¹⁹.
2. Precipitar la RNA exfoliado mediante la adición de acetato de sodio y etanol, como se describe anteriormente. Resuspender en un tinte de carga para geles de desnaturalización. Calor y la muestra para separar fragmentos de ARN por electroforesis en un gel de poliacrilamida desnaturalización de 15 – 20% de la carga.
3. Exponer el gel de poliacrilamida a una película de rayos x.
4. Detectar bandas en la fracción unida frente piscina total mediante autorradiografía.
   Nota: Realice todos los pasos con yodo en versión aspirante. Para la separación de RNA que se muestra a continuación, se emplea un gel en forma de cuña, que se consigue duplicando el espesor de los espaciadores de ambos en la parte inferior de las placas de gel insertando un espaciador extra largo en la parte inferior del gel. Esta forma permite más uniforme o más espaciado entre fragmentos de ARN más cortas. Alternativamente, puede utilizarse un phosphorimager en lugar de las películas de radiografía para la detección y cuantificación de la radiactividad.

Resultados

Principio de mutagénesis de saturación con el dopaje:

Si sólo una posición debe ser analizado para una adecuada relación molar de tipo salvaje y otros nucleótidos, use una mezcla de los cuatro nucleótidos. Sin embargo, si varias posiciones son analizadas al mismo tiempo, debe ajustarse la relación de tipo no salvaje a tipo salvaje nucleótidos, es decir, reducido. De lo contrario, además de simple sustitución, que se desea,...

Discusión

Mutagénesis durante mucho tiempo se ha utilizado para caracterizar sitios de unión de la proteína. En primer lugar, una serie de mutantes puede y de prueba individualmente en ensayos para analizar sus efectos sobre la afinidad de enlace de enlace. Mientras que un enfoque de mutagénesis estándar ofrece una forma de analizar varias secuencias, varios pasos involucrados en el enfoque estándar, tales como construcción de mutantes y realizar una serie de reacciones para cada mutante de atar, es laborioso y consume tiempo y pu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Uridina 5' a-tio trifosfato	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-017
Adenosina 5' a-tio trifosfato	NEN (Boston, Massachusetts)	NLP-016
Colector de vacío	Fisher Scientific	XX1002500	Millipore  25  mm Microanálisis de vidrio Filtro de vacío
Colector de vacío	Millipore	XX2702552	1225 Colector de vacío de muestreo
Nitrocelulosa	Millipore	HAWP
Nitrocelulosa	Schleicher & Kit	PROTRAN
	NEB	M0508
T4 Polinucleótido quinasa	NEB	M0201S
Proteinasa K	NEB	P8107S
T7 ARN polimerasa	NEB	M0251S
RNasin	Promega		Inhibidor de ARNasa
Placas de vidrio Estándar
Equipo de electroforesis en gel	Estándar	Estándar
Películas de rayos X	Estándar Estándar
de gel de poliacrilamida	Estándar Estándar