Artículo de método

El método de conjunto de réplica: Un enfoque de alto rendimiento para cuantitativamente medida Caenorhabditis elegans vida útil

DOI:

10.3791/57819

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29 de junio de 2018

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1Department of Biomedical Genetics, University of Rochester Medical Center, 2Department of Biostatistics and Computational Biology, University of Rochester Medical Center, 3Non-Clinical Statistics, Bristol-Myers Squibb, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí describimos el método Replica Set, un enfoque cuantitativo medida vida útil/supervivencia de C. elegans y healthspan en forma robusta y de alto rendimiento, permitiendo la proyección de muchas condiciones sin sacrificar la calidad de los datos. Este protocolo detalla la estrategia y proporciona una herramienta de software para análisis de datos de conjunto de réplica.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El método de conjunto de réplica es un enfoque para medir cuantitativamente vida útil o la supervivencia de los nematodos Caenorhabditis elegans en un modo de alto rendimiento, permitiendo que un solo investigador para más tratamientos o condiciones sobre la misma cantidad de tiempo sin pérdida de calidad de los datos. El método requiere equipos comunes en la mayoría de los laboratorios trabajando con C. elegans y así es fácil de adoptar. El enfoque se centra en análisis de muestras independientes de una población en cada punto de observación, en lugar de una sola muestra en el tiempo como con métodos tradicionales y longitudinales. Que implica la adición de líquido en los pocillos de una placa multi-bien, que estimula la C. elegans para mover y facilita la cuantificación de cambios en healthspan. Otros importantes beneficios del método Replica Set incluyen la exposición reducida de la superficie del agar a contaminantes en el aire (e.g. moho u hongo), manejo de animales y robustez a esporádicos mal anotar (como llamar a un animal como muerto cuando aún es mínima viva). Para adecuadamente, analizar y visualizar los datos de un experimento de estilo de conjunto de réplica, también se desarrolló una herramienta de software a la medida. Capacidades actuales del software incluyen ploteo de curvas de supervivencia para tanto réplica establecido y tradicional (Kaplan-Meier) experimentos, así como el análisis estadístico de conjunto de réplica. Los protocolos que aquí describen el enfoque experimental tradicional y el método Replica Set, así como un resumen de los análisis de datos correspondientes.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno de los avances tecnológicos más transformadoras hacia la comprensión de la base genética del envejecimiento era el desarrollo de alimentación basado en RNAi en la C. elegans1; antes del uso experimental de RNAi, muchos fenotipos de envejecimiento no eran genéticamente manejables. Alimentación basado en RNAi se logra a través de la producción de dsRNA dentro de e. coli que coincide con un endógeno mRNA de C. elegans : IPTG induce la transcripción bidireccional a través de una inserción del cDNA de C. elegans u o una porción de un marco de lectura abierto dentro de un plásmido2. Cuando C. elegans se alimentan intacto dsRNA de e. coli, producida por bacterias es transportado de la luz en las células intestinales a través de la proteína transmembrana de SID-23y luego distribuido por el resto de los animales a través de SID-14. Dentro de cada célula, dsRNA exógeno es procesado por el complejo Dicer en siRNA, que interactúan con un mRNA maduro por apareamiento complementario de la base para crear un nuevo dúplex siRNA-mRNA. Este dúplex es reconocido por el complejo RISC y troceado, así degradando el mRNA endógeno5. Así, cambiando sólo la inserción de plásmidos, puede desactivar la función de casi cualquier gen dentro del genoma de C. elegans . Este descubrimiento conducido a la creación de varios grandes RNAi basada en alimentación transforman de colecciones de las bibliotecas de poblaciones de e. coli que pueden combinarse para lograr una cobertura de aproximadamente el 86% de conocidos genes de C. elegans 6, 7.

Desde el avance de alimentación basado en RNAi, pantallas completa en C. elegans han llevado al descubrimiento de más de 900 genes que alteran la vida cuando inactivado (según lo evidenciado por las asociaciones de ARNi-fenotipo curadas en WormBase), que llamamos a como gerogenes. Un papel para la mayoría de gerogenes en el control de la longevidad fue descubierto a través de la alimentación basado en RNAi en pocos informes seminales (ver figura 1A y 1 archivo suplementario para más detalles). En algunos casos, estos gerogenes han sido identificados basados en medir la viabilidad en un solo o unos pocos puntos del tiempo, que no proporciona una medida cuantificable del cambio en la esperanza de vida con tratamiento de RNAi. En otros casos, estos genes han sido evaluados cuantitativamente los cambios en vida útil, así como los fenotipos adicionales asociados con la edad. Por ejemplo, anteriormente se identificaron 159 genes que eran necesarios para la normal y mayor vida útil de los animales con disminución de la señalización de insulina/IGF-1 y cuantificaron cambios en healthspan. De estos, 103 inactivations gene causar un fenotipo progeric, como dio lugar la pérdida de uno o más signos de envejecimiento prematuro8.

Mientras que algunos gerogenes se han asociado con 100 o más estudios (e.g. daf-16, daf-2, sir-2.1), gerogenes más de 400 tienen 10 o menos referencias (figura 1By 2 archivo suplementario). Por lo tanto, si bien completa basada en alimentación ARNi pantallas han descubierto y caracterizado someramente cientos de supuestos gerogenes, cómo la función de estos genes en el control de la longevidad y las correlaciones genéticas entre estos productos génicos siguen mal estudió. Análisis completo longitudinal de fenotipos asociados con la edad es un requisito previo para la identificación de las interacciones genéticas entre gerogenes (p. ej. las interacciones epistáticas, interacciones asynthetic, etcetera). Aumentar la comprensión más profunda en las interrelaciones genéticas entre gerogenes requiere de un método cuantitativo de alto rendimiento, que también aprovecha las ventajas de la alimentación basado en RNAi.

La medida más común del sustituto del envejecimiento es vida. El enfoque tradicional para medir la mortalidad de C. elegans pistas de la muerte de animales individuales con el tiempo dentro de una muestra pequeña de la población. Un número relativamente pequeño de animales se sigue en el tiempo y periódicamente es empujado suavemente con un alambre de platino o con pestañas, con movimiento como indicador de viabilidad (figura 2A). Este método ha sido ampliamente utilizado, ya que proporciona mediciones directas, directas de la media y la máxima vida útil. Sin embargo, este método tradicional es desperdiciador de tiempo y relativamente de bajo rendimiento, que limita el número de animales y de las condiciones que se pueden medir simultáneamente de forma controlada. Un estudio de simulación reciente encontró que muchos estudios de vida de C. elegans no ensayo un número suficientemente grande de animales para poder detectar de manera fiable pequeños cambios entre condiciones9. Además, este método tradicional incluye repetidamente una misma cohorte de animales con el tiempo, que a su vez puede introducir contaminación y puede dañar o matar animales cada vez más frágiles, envejecidos.

Hemos desarrollado una metodología alternativa "Replica Set" para medir la vida de C. elegans . Para ello, una gran población de edad-que sincronizados, isogénicas animales se dividen en un número de pequeñas poblaciones (o réplicas). Suficientes muestras de réplica se generan para cubrir cada punto del tiempo en el experimento planeado. En cada momento de observación, una de las réplicas se anotó el número de la vida, muertos y animales censurados y animales dentro de esa repetición se descartan. Por lo tanto, sobre la vida útil esperada de la población en su conjunto, una serie de subpoblaciones independientes son periódicamente muestreadas (figura 2B). En el uso de conjuntos de réplicas no hay ninguna insistencia repetida de los animales y no la exposición repetida a la potencial contaminación ambiental. La viabilidad en el único punto es totalmente independiente de cada otra observación, que minimiza el manejo y aumenta el rendimiento en al menos un orden de magnitud. Esto nos ha permitido cuantificar cambios en la vida, por centenares de RNAi clones simultáneamente8,10.

Aquí presentamos protocolos detallados para la realización de la vida de C. elegans mediante la réplica establecer tanto los métodos tradicionales de recuento de longevidad de C. elegans . Nos demuestran que se obtienen similares resultados entre los métodos. Contamos con software desarrollado para ayudar en el análisis gráfico de datos de vida útil generados a través de cualquiera de los dos, que ofrecemos libremente bajo licencia GPL V3 (véase tabla de materiales). "WormLife" está escrito en R11e incluye una interfaz gráfica de usuario (GUI) para el trazado de los datos, que se ha probado en Mac OS y Linux. Por último, comparar y contrastar las limitaciones de cada método y resaltar otras consideraciones al elegir entre los enfoques para medir los cambios cuantitativos en la vida de C. elegans .

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Protocolo

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1. tradicional método Scoring C. elegans longevidad

  1. Preparación de los reactivos
    1. Identificar los genes para ser inactivado mediante RNAi basado en la alimentación. Comprar acciones transformadas de HT115 e. coli2 con el clon de ARNi de interés. Por otra parte, subclone del cDNA del gen de interés en el sitio multicloning del plásmido L4440.
      Nota: HT115 es una ARNasa III-deficientes e. coli cepa con actividad polimerasa T7 IPTG inducible, que se utiliza para prevenir la degradación de dsRNA dentro de las bacterias. Para estudios de vida útil que no usan ARNi basado en alimentación, HT115 o OP50 e. coli en placas NGM estándar puede ser usados.
    2. Preparar 3 – 6 (o más) 6 cm ARNi placas por condición de prueba (3 archivo suplementario para la receta). Almacenar las placas ARNi a 4 ° C antes de sembrar con bacterias de hasta varios meses.
    3. Crecer transformadas de e. coli durante la noche (16-20 h, 37 º C agitando incubadora a 180 – 220 RPM).
      Nota: HT115 e. coli crece en LB con ampicilina (50 mg/mL). OP50 estándar e. coli no es resistente al antibiótico y se cultiva sin ampicilina. Volumen de cultivo depende del # de placas, pero suele ser entre 8 y 100 mL de LB, dependiendo del diseño experimental.
      1. Concentrar las bacterias por centrifugación a 3.000 x g durante 15-20 min en una centrífuga de sobremesa. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1/10 a partir de volumen (es decir, 10 x) en LB con ampicilina para HT115 (o sin ampicilina para OP50 estándar).
      2. Alícuotas de 200 μL del había concentrado 10 bacterias x cada placa de 6 cm. Preparar 3-4 repeticiones por condición de prueba, con 2 placas extra backup, en caso de contaminación. Durante la preparación de las placas, etiquetarlos para que el experimentador anota el ensayo es ciego a las condiciones experimentales, utilizando un código de color o esquema de codificación similar. Asegúrese de que el código se registra.
      3. Deje abiertas placas secas en un ambiente limpio como un banco de flujo laminar hasta que todo el líquido ha sido absorbido o permitir placas cubiertas secar toda la noche en el Banco. Placas de monitor al mismo tiempo de secado para asegurar que el agar seco sin exceso de secado.
        Nota: Las placas de sequía demasiado conduce a agrietarse del agar que C. elegans a madriguera en el agar. Húmeda que la superficie del agar también promueven la madriguera.
    4. Almacenar las placas secas dentro de una caja de gusano durante la noche (hasta las 24 horas) a temperatura ambiente para permitir la inducción de la producción de dsRNA. Después de 1 día a temperatura ambiente, almacenar las placas a 4 ° C hasta por 2 semanas en una bolsa zip-lock sellado (para evitar que las placas de sequía). Antes de su uso, devolver las placas a temperatura ambiente dentro de la bolsa hermética para evitar la condensación de la introducción de hongos contaminantes en el aire.
  2. Sincronización de C. elegans con tratamiento de hipoclorito
    Nota: Ver archivo suplementario 3 recetas de solución M9 e hipoclorito.
    1. Recoger animales adultos grávidos con M9. Utilice una pipeta de vidrio conectado a tubos de 2 x 15 mL.
    2. Girar los tubos para 30"~ 2.000 rpm. Si hay una piscina de nemátodos en la parte inferior del tubo. Aspirar el sobrenadante. Lavar dos veces con solución de M9, repitiendo la vuelta y la aspiración.
    3. Vuelva a suspender C. elegans en 4 mL de M9. Añadir 2 mL de solución de hipoclorito. Inmediatamente vortex por 3 min, con vigoroso periódica. Después de 3 minutos, busque una nube de huevos con un microscopio de disección. Vórtice un adicional de 10 a 20 s si los huevos no han sido liberados después de 3 minutos.
      Nota: El tratamiento de hipoclorito la sincronización es esencial. Huevos en los adultos grávidos son lo que sobreviven el tratamiento. Después de ~ 3 min los adultos grávidos rompen y derramarse los huevos. Sin embargo, si los huevos son en solución de hipoclorito durante mucho tiempo después de la liberación se mueren. Por el contrario, si adultos grávidos no quedan en solución de hipoclorito el tiempo suficiente, no se liberará huevos.
    4. Rápidamente lavar con solución de M9 dos veces como en el paso 2.1.2.
    5. Vuelva a suspender los pellets de huevo de C. elegans en 3 mL M9 y traslado a un nuevo tubo de 15 mL. Permitir que los embriones empollar toda la noche en 3 mL de solución de M9 con rotación a 20 ° C.
    6. Calcular la densidad de animales de L1 (o embriones) por μl cayendo 10 μl de solución de L1 3 x en una placa de 6 cm y cuenta el número de animales de la L1 para calcular el número promedio de L1s/μl.
      Nota: L1 animales resolverá con el tiempo. Por lo tanto, se deben mezclar periódicamente soluciones L1.
    7. Semilla de 50 animales de L1 por placa. Invertir las placas y sellado con una banda elástica. Coloque las placas en una caja de gusano plástico. Caja de sello en una bolsa zip-lock grande. Mover a una incubadora de 20 ° C.
  3. Prevenir la producción de progenie por la adición de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR)
    1. Crecen los animales hasta la etapa de L4 a 20 ° C. Compruebe si sincronizan animales han desarrollado a L4 aproximadamente 40 h después de la siembra (paso 2.1.7).
      Nota: Tiempo de desarrollo deC. elegans varía a diferentes temperaturas, tasas de animales mutantes para que no se han caracterizado los tipos12 y crecimiento deben ser probadas empíricamente.
      1. Añadir 160 μl de 50 x FUdR a cada placa de 6 cm con animales de L4.
        Nota: Es fundamental añadir FUdR en la etapa de L4. Para mayor comodidad, hacer 1.000 acciones de x de FUdR FUdR de 1 g en 10 mL de la disolución stock de2O. filtro esterilizar ultrapura H FUdR con filtro 0.2 μm y una jeringa de cc 10. Alícuota ~ 1 mL de caldo en tubos de 1,5 mL estéril. Congelar y almacenar a-20 ° C.
    2. Inspeccione las placas de la presencia del hombre C. elegans. Sacar todos los hombres.
      Nota: vida útil se mide típicamente en hermafroditas y no los machos. Hermafroditas que mate viven menos de precópula animales, incluso en presencia de FUdR13. Los machos más pequeño y más delgado entonces son hermafroditas y pueden identificarse fácilmente por una distintiva cola enganchada14.
    3. Vuelva a colocar la caja en el bolso de la cerradura del cierre relámpago. Volver a 20 ° C la incubadora.
  4. Calificación de viabilidad
    1. Puntuación de viabilidad diariamente tocando suavemente al animal en la cabeza con un alambre de platino o pestañas. Puntuación de animales que no actúe como muerto y quitarlos de la placa (figura 2A). Anote el número de muertos para cada condición por cada punto de tiempo de observación.
      Nota: Para reducir el riesgo del sesgo que anota, el experimentador debe permanecer ciego a las condiciones experimentales y asimismo debe no hacer referencia a los resultados de anteriores momentos durante la puntuación.
    2. Animales censor que ruptura, mueren de otros defectos de desarrollo evidente, o arrastrarse para arriba en el lado del plato: quitar estos animales y registro el número en cada una observa tiempo punto de consideración en el análisis estadístico. Además, si los hombres se encuentran, retirar y registrar el número observado.
    3. Repita del paso 1.4.1 diariamente hasta que los animales no siguen vivos.
      Nota: Debe disminuir significativamente el césped de e. coli u hongo comienza a crecer sobre la placa, transferencia de todos los animales restantes a una placa nueva con el ARNi apropiado y FUdR.
  5. Análisis - ploteo de datos y estadísticas
    1. Prueba de entrada o datos de observación registrados abierta en software de apoyo análisis de supervivencia con la no paramétrica de estimador de Kaplan-Meier15 y log-rank16 (ver archivo suplementario 3). Asegúrese de incluir animales censurados. No incluyen los machos que fueron observados, si cualquier.
      Nota: formatos de datos pueden variar entre el software, pero es un formato común para grabar cada animal individual observada en una línea separada. El punto experimental en el cual un animal se observó como muerta es la hora del "evento". Si censurados, el tiempo de «evento» es el punto en que el animal fue censurado. Generalmente es un campo o una casilla de verificación para indicar que observaciones censuradas.
    2. Trazar las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier. Seleccione menos seis condiciones para una sola parcela si se ensayaron muchas condiciones para mejorar la legibilidad.
      1. Busque temas de datos visualmente aparente falta observaciones, resultados de control inesperado, etc. — y antes del análisis estadístico.
    3. Utilice la función de log-rank test en su software para realizar pairwise comparación estadística. Asegúrese de que las opciones disponibles para el tratamiento de resultados censurados son apropiadamente para datos censurados por la derecha.

2. réplica método Set para Scoring C. elegans longevidad

Nota: mientras que el método tradicional requiere 3 – 6 placas por condición (ver 1.1.2. arriba), el método Replica Set requiere muchos más (ver paso siguiente 2.2.2). El método tradicional sigue los animales en el mismo plato a lo largo de un experimento (figura 2A). En cambio, con réplica de animales son sólo anotó una vez: muchas repeticiones idénticas se fijan al principio del experimento que se anotó una repetición en cada momento (por prueba) (figura 2B).

  1. Configuración de la biblioteca.
    Nota: Detalles adicionales sobre entrega de clones de ARNi está cubierta aquí, como el conjunto de réplica protocolo es sensible al marcador simultáneo de muchos clones de ARNi, y pueden escalarse a más de 100 clones en un momento. Colecciones de clones de ARNi se conservan como stocks de glicerol en una placa de formato de 96 pozos. Replica de experimentos sistema utilizan placas de 24 pocillos. Bueno cada uno es una condición de prueba diferentes, que puede corresponder a una colección de clones de ARNi, diferentes tratamientos químicos, cepas animales y así sucesivamente.
    1. Armar el diseño de la sublibrary de colecciones de clones de ARNi, tal que se cumplan las siguientes condiciones:
      1. Asegurar que dentro de una colección de 96 pocillos A1 bien es un control negativo de vector vacío.
      2. Insertar un control vector vacío adicional al azar dentro de cada 24 pozos.
      3. Divide la placa de 96 pocillos en bloques de 24 pozos, tales que cada placa de 24 pozos se en uno insertado al azar control negativo (figura 2).
      4. Insertar un control positivo al azar dentro de cada grupo de 24 pozos (figura 2).
        Nota: El control positivo depende de la pregunta experimental. Por ejemplo, cuando mirando una colección de RNAi clones de ese aumento de vida, daf-2(RNAi) se incluye con frecuencia. Por el contrario, cuando se observa vida útil acortada, daf-16(RNAi) se utiliza con frecuencia.
  2. Preparación de conjuntos de réplicas
    Nota: el número de repeticiones necesitada es igual al número mínimo de puntos del tiempo (figura 2B). Uno debe saber a posteriori cuánto tiempo para medir la vida útil antes de iniciar el experimento, así como anotar la frecuencia (por ejemplo, un experimento conjunto de réplica ejecutando 40 días con día cada puntuación requiere preparar un mínimo de 20 réplicas de conjuntos para cada condición al inicio del experimento). Es recomendable hacer ~ 5 backup adicional establece (ver 2.2.2 y 2.2.2.3 abajo).
    1. Para crear un sello fresco de la sublibrary de RNAi, inocular 200 μL LB + Amp bien en un formato de 96 pocillos (placas de 600 μL) con un duplicador de placa de 96 pines por los siguientes pasos:
      1. Esterilizar 96 replicator de placa pin sumergiendo secuencialmente las clavijas de la lejía 50% ultrapura H2O y etanol. Mantenga los pernos inmersos durante al menos 30 s de los pasos de bleach y el etanol.  Después de la inmersión en etanol, las puntas de la llama brevemente. Repetir.
        Nota: Asegúrese de enjuagar todo bleach y no deje los pernos expuestos para blanquear por períodos prolongados, como blanqueador puede corroer los pasadores de acero inoxidable.
      2. Retire con cuidado la cubierta de aluminio adhesivo de la placa de biblioteca stock congelado de 96 pocillos de glicerol y suavemente pero firmemente moler consejos del replicador de placa esterilizada en los pozos de las poblaciones de glicerol congelados. Inocular 200 μL LB + culturas Amp y sellar la placa inoculada con una membrana permeable. Permiten cultivos a crecer durante la noche en el Banco.
      3. Esterilizar el replicador de placa como en el paso 2.1.1, cuidadosamente Quite el sello de la placa de cultivo líquido después de crecimiento durante la noche y sumerja las puntas de los pasadores de replicator. Aplicar los consejos con incluso la presión a un amplificador de libras rectangular + placa de agar de tet y bacterias de transferencia de los pernos a la placa suavemente con un pequeño movimiento circular, asegurándose de dejar un espacio adecuado entre puntos adyacentes. Permitir que las colonias que crecen durante la noche en la placa de agar a 37 ° C. Ver 3 archivos suplementarios para la preparación de LB + Amp/Tet placas.
      4. Antes de usar, almacenar la placa de agar a 4 ° C invertida (lado de la tapa hacia abajo), envuelto en película de parafina.
        Nota: Almacenar lado tapa de las colonias hasta permitirá condensación Cruz-contaminar ARNi clones! Colonias de e. coli pueden almacenarse para 2 a 8 semanas a 4 ° C, dependiendo de la particular ARNi clones, clones de ARNi conservar eficacia en la inducción de dsARN después de la inducción de IPTG durante periodos variables de tiempo. Para colecciones pequeñas de RNAi clones, ARNi eficiencia debe determinarse empíricamente por RT-qPCR para confirmar la caída.
    2. Calcular el número mínimo de las placas de 24 pocillos necesarios para un ensayo del experimento: (placas # por conjunto de réplicas) x (puntos de tiempo de espera #). Asegurar que algunos conjuntos de réplicas adicionales para el manejo de temas como la contaminación (figura 2B).
      Nota: El número total de clones de ARNi determina el número de placas de 24 pocillos para hacer un conjunto de réplicas para cada punto del tiempo (figura 2).
      1. Preparar las placas de 24 pocillos, como paso 1.1.2 (3 archivo suplementario para la receta). Etiqueta las placas cuando se prepara para el experimentador anota el ensayo ciego a las condiciones experimentales, utilizando un código de color o esquema de codificación similar.
      2. Inocular un conjunto de 1,5 mL LB + culturas Amp para cada 10 réplicas (ver 2.2.2). Inocule los cultivos en 96 placas bien profunda-bien mediante el replicador de la placa (como en 2.1.3) y colonias bacterianas de 2.1.4 (figura 2, izquierda). Sello con membrana transpirable, crecer 20 h (37 ° C) con agitación.
      3. La semilla 120 μl de un cultivo durante la noche a cada placa con una pipeta multicanal de 6 pozos con punta ajustable espaciamiento (figura 2, derecha). Secar las placas descubiertas en campana de flujo laminar hasta que todo el líquido ha sido absorbido. No demasiado seco. Almacenar las placas durante la noche a temperatura ambiente.
  3. Sincronización de C. elegans mediante tratamiento de hipoclorito
    1. Calcular el número mínimo de animales necesario para el experimento: mínimo # de L1s necesitada = (15-20 animales/bien) (24 pozos/placa) (juego de placas/réplica X)(Y replica sets).
      Nota: el método Replica Set requiere más animales que el método tradicional. Una placa de 10 cm llena de gusanos grávidos puede proporcionar animales de L1 de 20.000-50.000 dependiendo de la densidad de adultos grávidas. Asimismo, veinte placas 6 cm rendimiento ~ 30.000 animales de L1. Plan para elaborar un preparado de huevo que se duplica el número mínimo de animales necesitada. Si la población de preparación ha muerto de hambre, vuelva a introducir o pedazo a una placa nueva y permiten por lo menos tres generaciones de alimentos antes de proceder17,18. Asegúrese de que se congele nuevamente sobra L1s.
    2. Siga los pasos 1.2 a 1.2.6 como en el método tradicional para obtener sincronizan L1 animales. La semilla L1 de 15-20 animales en cada pocillo con un pozo de 6 espaciamiento ajustable pipeta y reactivo embalse, similar a 1.2.7. Mezclar periódicamente L1 solución evitar el asentamiento de los animales.
  4. Prevención de la producción de progenie por la adición de 5-Fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR)
    1. Siga el paso 1.3.1.  Preparación estéril 50 x stock de FUdR (ver paso 1.3.1.1).
    2. Cuando alcance los animales L4, añadir 25 μl de 50 x FUDR en cada pocillo de un pozo de 24 placa con una pipeta ajustable espaciamiento de 6 canales.
  5. Calificación de viabilidad
    1. Eliminar un juego de placas replicadas e inundación de pozos con la solución de la M9, registro animales total por pozo y luego suavemente animales que no se mueve en la cabeza con un pico de gusano (figura 2B). Animales incapaces de moverse son anotados como muertos. Desechar las placas anotadas. Viabilidad de registro diario.
      Nota: Animales que ruptura, Mostrar defectos morfológicos bruto, se ha podido desarrollar, o se arrastró para arriba en el lado del bien están censurados por excluirlos de los valores muertos y total.
      1. Anotar el número de animales que son censurados dentro de cada bien en cada momento por separado de los otros valores.
      2. No puntuación de pozos que no tienen comida o están contaminados (por ejemplo hongos o limo); estos pozos se consideran censurados. Además, censurar un pozo si todos los animales Mostrar defectos morfológicos o de desarrollo. Grabar el evento censura esta ARNi clon/bien en este momento.
      3. Después de marcar una placa de replicar, deséchela. Seguir anotando una nueva réplica establece cada día hasta que todos los animales a través de todos los pozos están muertos. Para reducir el riesgo del sesgo que anota, el experimentador debe permanecer ciego a las condiciones experimentales y asimismo debe no hacer referencia a los resultados de anteriores momentos durante la puntuación.
      4. Si todos los animales dentro de un pozo fueron muertos en un momento dado, entonces después de ese día, examinar si todos los animales han sido marcados como muerto para dos puntos de tiempo consecutivos para un dado bien. Si es así, anota viabilidad ya no es necesario para que bien en momentos posteriores.
      5. Realizar estudios clínicos adicionales experimento independiente. Pista por separado los resultados de ensayos sucesivos de los ensayos anteriores, con el número del ensayo señalado.

3. el gráfico de datos

Nota: Con el conjunto de réplica se aplica método de ajuste de una curva para aproximar la media y la máxima vida útil. Los parámetros para evaluar la mortalidad de C. elegans caben una curva logit del19.  Como la mayoría de herramientas de supervivencia no es compatibles con ajuste de la curva logit, se desarrolló un programa nuevo para el trazado de las curvas logit (para réplica); También se admiten curvas de Kaplan-Meier (por el método tradicional).

  1. Empezar con el software. Descargar el archivo zip para la versión actual (ver Sección materiales). Extraiga el archivo zip en una carpeta. Consulte el archivo "readme" en la carpeta extraída para obtener instrucciones de instalación adicionales.
  1. Inicie la interfaz de trazado. Encontrar la ubicación del directorio de "código" en la carpeta extraída del archivo zip (p. ej.  "/ Usuarios/nombre de usuario /Desktop/WormLife/código").
    1. Escriba los siguientes comandos en la consola de R, sustituyendo a la ruta de carpeta sólo identificada. Presione entrar o retorno después de cada línea: 1) setwd("/Users/UserName/Desktop/WormLife/code"), 2) source("plotGUI.R"), openMain() 3).
    2. Permita que la interfaz cargar en una ventana nueva, que trae para arriba la pantalla por defecto como se muestra en la Figura 3A. Deje la R en el fondo.
  2. Formato de datos como archivos de valores separados de ficha (TSV) o valores separados por comas (CSV). Especificar columnas y nombres, depende del tipo de análisis. Ver suplemento 4 de archivo (conjunto de réplicas) y 5 archivo suplementario (tradicional/Kaplan-Meier) para datos de ejemplo formateado previamente.
    Nota: datos deben especificarse en un formato "largo", es decir, una fila por cepa/tratamiento por el momento por ensayo. Archivos CSV se recomiendan para mejor compatibilidad entre plataformas.
    1. Quitar filas correspondientes a las observaciones que hayan sido omitidos o censurados. Comprobar la ausencia de valores que faltan o no numéricos, ya que puede causar un error cuando importe los datos.
    2. Para el análisis de estilo tradicional de Kaplan-Meier no agrupar datos de parcelas de ensayos independientes ellos por separado. Para el análisis de conjunto de réplica, agrupar datos de múltiples ensayos y luego investigar utilizando la función "TrialView" (véase 6.3.3.4).
  3. Mediante la interfaz de trazado
    1. Cargar un archivo de datos ("importar" en el menú "Archivo") utilizando el cuadro de diálogo. Para abrir archivos ".csv", cambiar el tipo de archivo en la bajada hasta ".csv" (el valor predeterminado es ".txt/.tsv"), vaya a la carpeta con el archivo de datos. Aquí el archivo es los datos de ejemplo Replica Set (4 archivo suplementario).
      Nota: Importar un archivo cuando un conjunto de datos ya está abierto reemplazará el actual conjunto de datos.
    2. Seleccione un archivo para importar para iniciar al asistente de importación, que camina a través de la identificación de las columnas del archivo seleccionado (S1A figura para conjunto de réplica). Si los datos de entrada corresponden a un experimento conjunto de réplicas, elija "Logit" para el tipo de estudio.
      Nota: El flujo de trabajo de importación es diferente entre el conjunto de réplicas (Figura S1A) y tradicional (Kaplan-Meier) (Figura S1B).
    3. "Trama de datos". Seleccione "Añadir línea" para comenzar a trazar los datos. (Una línea corresponde a un conjunto de condiciones. Hay funciones para ayudar con experimentos donde se probaron muchas condiciones).
      1. Parcela las condiciones de control-en el caso de los datos de ejemplo N2 (WT) con L4440 (vector vacío) RNAi son apropiados. Seleccione "Añadir línea" en el menú "Gráficos" para iniciar el Asistente para agregar la línea: seleccione la condición a la parcela y los parámetros gráficos para la representación de la línea.
        1. Para agregar manualmente una curva para una condición diferente, repita los pasos 3.3.3.1
        2. Para cambiar de color o símbolo para una línea de trama, seleccione "Modificar línea" bajo el menú de"gráfico".
        3. Para quitar una línea sin borrar todas las líneas, seleccione "Borrar línea" bajo el menú de"gráfico".
        4. Para borrar todas las líneas en la trama actual, seleccione "Línea clara" en el "menú de gráfico".
        5. Para reemplazar el valor de eje x máximo seleccionado automáticamente (el tiempo), utilice "Set X escala" bajo el menú de"gráfico".
          Nota: el eje y (fracción sobreviviente) siempre muestra (arriba) del 100% a 0% (abajo) en incrementos de 20%. El eje x se muestra siempre en incrementos de 5. Rótulos de los ejes no se trazan para permitir flexibilidad en el etiquetado después de guardar las imágenes de trama.
      2. Para guardar imágenes en formato JPEG de la trama se muestra actualmente, utilice la opción "Guardar conjura" en el "menú archivo"; se guarda sólo el diagrama actual.
      3. Para la creación de parcelas individuales para muchas condiciones diferentes en un experimento, el software permite definir y trazar una "serie".
        Nota: La aplicación del concepto de serie mejora la eficiencia al trabajar con grandes experimentos.
        1. Si a partir de un espacio de trabajo de trama en blanco, añadir las líneas correspondientes a las condiciones de control que deben ser consistentes a través de todas las parcelas de la serie (véase 3.3.3.1).
        2. Definir la serie con la serie de"definir" en el menú de gráficos. Seleccione una condición correspondiente a la línea de mostrar primero en la serie; se puede seleccionar solamente uno. Elegir parámetros gráficos (línea color y trama del símbolo) de la línea, como en 3.3.3.1.
        3. Revisión de las parcelas para las condiciones de prueba diferentes. Cambiar la visualización de la "línea de la serie" entre condiciones utilizando los botones de flecha izquierda/derecha encuentran a los lados de la ventana principal de la trama, así como en el menú superior de la barra (Figura 3A-C).
          Nota: Si la línea de las series es la misma condición como una de las líneas de referencia de control anteriormente agregado, la nueva línea puede aparecer superpuesta.
        4. Definir la serie para hacer ciertas otras funciones disponibles (excepto serie parcelas y Trialview-véase 3.3.3.4 para este último). Después de definir una serie, utilice la opción de "Guardar la serie parcelas" en el menú "Archivo" para guardar archivos de imagen de trama individuales para cada parcela en la serie en una nueva carpeta.
      4. Trialview: visualización de resultados de ensayos independientes de un experimento conjunto de réplica. Si múltiples ensayos se ejecutan por uno o más de los grupos de la muestra, trazar los datos de los ensayos individuales y de los datos agrupados de los ensayos por separado para evaluar la concordancia entre ensayos independientes (ver figura 3D).
        1. Establecer una serie como se describe en 3.3.3.3. Se trazarán los diferentes ensayos para cada uno de los grupos "diferentes" muestra una imagen diferente en los ensayos respectivos para las muestras de control de referencia especificado.
        2. Para guardar las imágenes de TrialView, ir a "Imprimir TrialViews" en el menú de datos; una imagen JPEG se emitirá para cada trama de la serie.
          Nota: Los resultados de ejemplo en la figura 3D es para un caso con dos ensayos.
    4. Vida útil media tabla del Resumen de datos de conjunto de réplica. Visualmente inspeccione las curvas para asegurar ajuste razonable de los datos, a continuación, seleccione la ''cuadro resumen "opción en el menú de datos para guardar una tabla de valores de vida media (tiempo en el 50% de supervivencia en curva logit) para cada tipo de muestra.
  4. Evaluación estadística de los datos generados mediante el método de conjunto de réplica
    1. Para el análisis estadístico entre dos grupos de un experimento réplica establecer, modificar y ejecutar un script de R, en el archivo zip (vea "comandos de plantilla de análisis estadístico WormLife. R").
      Nota: No se requiere dominio en R para ejecutar el script. Documentación adicional es en comentarios en el archivo. El script está listo para el análisis del ejemplo Replica Set data. Datos generados por el usuario en el formato adecuado (ver 4 archivo suplementario) pueden también analizarse.
      1. Abra el archivo de secuencia de comandos en R (R GUI o RStudio).
        Nota: Esto mostrará la secuencia de comandos sin ejecutarlo.
      2. Modificar la ubicación de los archivos necesarios para que coincida con la ubicación en tu computadora.
        Nota: Estas rutas de archivo deben ser "completos" (es decir, debe incluir la ubicación del archivo completo, incluidas las carpetas).
        1. Modificar los trazados (ubicaciones de archivos o carpetas) para "wlDir" (localización del directorio), "dataFile" (la réplica establecer archivo de datos a analizar), "compFile" (especificación de comparaciones para que funcione, si es aplicable) y "outputPath" (lugar donde se escribirán los archivos de resultados a.)
      3. Establezca los nombres de columna en la sección "Especificar las columnas en el archivo de datos" si nombres de columna en el archivo a ser analizado son diferentes desde el archivo de ejemplo. Especificar una columna para cada parámetro. Si un estudio tiene múltiples cepas, pero no RNAi (u otro tratamiento) incluye una columna en el archivo de datos con las entradas en blanco, o el mismo para todas las filas (por ejemplo, "no_treatment", etc.).
      4. Establezca el parámetro "compFile". Si el parámetro "compFile" se establece en NA, se ejecutarán todas las comparaciones posibles pares de grupos.
        Nota: Un grupo se define por la combinación de tensión/genotipo y tratamiento, que se concatenan y se muestran como "strain_treatment". Para estudios más amplios con muchos grupos, se puede proporcionar un archivo CSV especifica las comparaciones. Consulte el archivo de ejemplo "comps_rsm_example.csv".
      5. Establecer el número de iteraciones para remuestreo de Monte Carlo ("k.resamp", el valor predeterminado es 1.000).
        Nota: Los valores de P de 0 pueden ser devueltos cuando se realizan muy pocas iteraciones; en tales casos es apropiado al informe "p < 0.01" (si k.resamp = 100), o "p < 0,001" (si k.resamp = 1.000), etc.
      6. Ejecutar el script: botón "fuente" en RStudio (arriba a la derecha de la ventana de edición) o "documento original" en el menú "Editar" en el GUI de R. (Ejecución puede tardar algún tiempo).
      7. Cuando el indicador de "ocupado" R ya no aparece abrir la salida de directorio-habrá una tabla con los resultados de cada comparación (mediana de la supervivencia, los valores de p, % vida útil media de cambio).

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Resultados

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En el desarrollo de cualquier nueva metodología, es imperativo que el nuevo método recapitula los resultados aceptados de los enfoques anteriores y cumple con el estándar dentro de un campo. Previamente hemos demostrado empíricamente que el conjunto de réplica y los métodos tradicionales de análisis de la vida de C. elegans producen similares resultados20. Tipo C. elegans (N2) mantenidos a 20 ° C por lo general viven entre 20 y 25 días, que observ...

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Discusión

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Los métodos sets tradicionales y réplica requieren la sincronización de animales cronológicamente envejecidas. Se incluye un método que sincroniza animales con tratamiento de hipoclorito de adultos grávidos, donde sólo los huevos fertilizados con el adulto grávido sobreviven el tratamiento. Los embriones eclosionan en suspensión líquida y detención de desarrollo en el primer estadio larval (L1). Después de la siembra L1 animales en alimentos (por ejemplo e. coli expresando dsARN a un gen de interés), an...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La financiación para este trabajo se describe en este manuscrito fue proporcionada por: la oficina de la Universidad de Rochester del rector y la Facultad de medicina y odontología Decanato mediante el centro de Ciencias de la salud innovación computacional (HSCCI); el Ellison médico nuevo de becados de Fundación en Aging Fellowship (AG-NS-0681-10) los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IPTG (isopropil beta-D-1-tigalactopiranósido)Gold Bio12481C100
FuDR (5-Fluoro-2'-desoxiuridina)Alfa AesarL16497
Placas de cultivo de 24 pocillosGreiner Bio-One#662102
Placa retangular de un solo pocillo sin tratar, 128x86mmThermo-Fisher242811
600 y micro; L Placas de 96 pocillosGreiner Bio-One#786261
2 ml Placas de 96 pocillosGreiner Bio-One#780286
Junta de placa permeable al aireVWR60941-086
replicador de placas de 96 pinesNunc250520
bactopeptonaVWR90000-368
agar bacteriológicoAffymetrix/USB10906
Biblioteca de clones de ARNi de C. elegans en bacterias HT115- Ahringer Fuente:Bioscience Colecciónde ARNi de C. elegans (Ahringer)Véase también Kamath et. al, Nature 2003.
Biblioteca de clones de ARNi de C. elegans en bacterias HT115- Fuente VidalBioscienceC. elegans ORF-RNAi Resource (Vidal)Véase también Rual et. al, Genome Research 2004. Esta biblioteca también está disponible en Dharmacon.
WormLife- Software para el análisis de supervivencia de conjuntos de réplicasSamuelson LabN/Ahttps://github.com/samuelsonlab-urmc/wormlife
L4440 Plásmido de vector vacíoAddgene1654https://www.addgene.org/1654/
Wormbasehttp://www.wormbase.org/ 
OASIShttps://sbi.postech.ac.kr/oasis2/ 
Prismahttps://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ 
Graphpad

Referencias

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