La purificación de los canales iónicos es a menudo difícil, pero una vez alcanzado, pueden permitir en vitro las investigaciones de las funciones y estructuras de los canales. Aquí, describimos los procedimientos paso a paso para la expresión y purificación de proteínas de mamíferos bestrophin, una familia de Ca2 +-activa los canales de Cl– .
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Artículo de método
Expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos Bestrophin
En este artículo
Resumen
Resumen
El genoma codifica cuatro paralogs de bestrophin, es decir, BEST1, BEST2, BEST3 y BEST4. BEST1, codificada por el gen BEST1 , es un Ca2 +-activa Cl– canal (CaCC) predominante expresado en epitelio retiniano del pigmento (RPE). La importancia fisiológica y patológica de BEST1 destaca por el hecho de que más de 200 mutaciones distintas en el gen BEST1 se han relacionado genéticamente con un espectro de por lo menos cinco trastornos degenerativos retinianos, como vitelliform mejor distrofia macular (enfermedad de Best). Por lo tanto, comprensión de la biofísica de canales de bestrophin a nivel de una sola molécula tiene gran importancia. Sin embargo, obtención de canales iónicos mamíferos purificada es a menudo una tarea difícil. Aquí, Divulgamos un protocolo para la expresión de proteínas de mamíferos bestrophin con el sistema de transferencia de genes de BacMam baculovirus y su purificación por afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. Las proteínas purificadas tienen el potencial para ser utilizados en posteriores análisis funcionales y estructurales, como la grabación electrofisiológica en bicapas lipídicas soportadas y Cristalografía. Lo importante, esta tubería puede ser adaptada para el estudio de las funciones y estructuras de otros canales iónicos.
Introducción
Bestrophins son una familia de canales iónicos, conservada a través de especies diferentes de bacterias a los seres humanos1. En los seres humanos, el gene BEST1 , situado en el cromosoma 11q12.3, codifica la proteína de membrana Bestrophin-1 (BEST1) que se expresa predominantemente en la membrana basolateral de las células del epitelio (RPE) pigmentario de la retina de los ojos2,3 ,4. Compuesta por 585 aminoácidos, el primer ~ 350 de los cuales están muy conservadas entre especies y contienen su región transmembrana, BEST1 actúa como un CaCC....
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Protocolo
1. producción de BacMam expresión baculovirus
- La secuencia de codificación de una proteína deseada bestrophin mamíferos Inserte la clavija BacMam vector18 con una secuencia de reconocimiento de proteasa tabaco Etch Virus (TEV), seguida por un GFP-10 x su etiqueta en el c-término de la proteína.
- Transfectar transitoriamente el plásmido de expresión en adhesivo HEK293 células19,20,21,22,23. Controlar la expresión de la proteína GFP-fusión bajo un microscopio fluores....
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Resultados
La intensidad de fluorescencia en transitorio transfected las células HEK293 adhesivo (figura 1A) es un buen indicador para el nivel de expresión de la proteína proyectada en células HEK293-F de suspensión (figura 1B). Si la proteína diana no se expresa bien o mal se encuentra localizada en las células HEK293 después de transfección transitoria, se recomienda considerar modificar la construcción de la expresión (por ej.,.......
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Discusión
Este protocolo describe un oleoducto útil para la expresión y purificación de los canales iónicos de mamíferos bestrophin a utilizarse para el análisis futuro de vitro . Mientras que el dispositivo FPLC es necesario para la cromatografía por exclusión de tamaño, una bomba de jeringa es suficiente para todos los pasos de cromatografía de afinidad como vinculante, lavado y liberador. Cuando se utiliza una bomba de jeringa para soluciones de push (en jeringa) a través de una columna, es esencial para el lado de la .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por subvenciones de NIH EY025290 y GM127652 de la Universidad de Rochester financiación de puesta en marcha.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HEPES | Fisher Scientific AC327265000 | ||
| NaCl | Fisher Scientific | AC446212500 | |
| Glicerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
| Imidazol | Fisher Scientific | AC301870010 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | AC197530010 | |
| TCEP | Fisher Scientific AA4058704 | ||
| Aprotinina | Fisher Scientific | AAJ63039MA | |
| Leupeptina | Fisher Scientific | AAJ61188MB | |
| Pepstatina A | Fisher Scientific AAJ20037MB | ||
| fluoruro de fenilmetilsulfonilo | Fisher Scientific | AC215740050 | |
| Anatrace | de grado sol | D310S | |
| DDM anágrado | Anatrace | D310 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher | 10902179 | |
| FreeStyle medio | Espectrofotómetro ThermoFisher | 12338018 | |
| NanoDrop | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Homogeneizador de alta presión | Avestin | Emulsiflex-C5 | |
| Columna HisTrap | GE | 17-5248-01 | |
| Columna Superdex-200 | GE | 28990944 | |
| AKTA Pure | GE | 29018224 | |
| Ultra-15 unidades de filtro centrífugo | Millipore | UFC910024 | |
| Ultra-4 unidades de filtro centrífugo | Millipore | UFC810024 | |
| Ultra-0.5 | Millipore | UFC505024 | |
| Optima XE-90 Ultracentrífuga | Beckman Coulter | A94471 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| Gel prefabricado Mini-PROTEAN | Bio-Rad | 4561084 | |
| T100 Termociclador | Bio-Rad | 1861096 | |
| Reactivo de transfección PolyJet | SignaGen | SL100688 | |
| pEG Vector | Obtenido del laboratorio de Gouaux en el Instituto Vollum |
Referencias
- Hartzell, H. C., Qu, Z., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T. Molecular physiology of bestrophins: multifunctional membrane proteins linked to best disease and other retinopathies. Physiological Review. 88 (2), 639-672 (2008).
- Marmorstein, A. D., et al.
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Reimpresiones y permisos
