Artículo de método

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

DOI:

10.3791/57843

⸱

7 de septiembre de 2018

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology, Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience, Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anticuerpos, también llamados como distinguen de inmunoglobulinas (Ig), secretadas por los linfocitos B, células de plasma plasmablasts, en la inmunidad humoral proporcionan una formidable defensa contra la invasión de patógenos a través de diversos mecanismos. Un objetivo importante de la vacunación es inducir anticuerpos protectores específicos de antígeno para prevenir las infecciones mortales. Tanto timo dependiente (TD) y antígenos de timo-independientes (TI) pueden provocar respuestas de IgM específica de antígeno sólidas y también pueden inducir la producción de anticuerpos de isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) así como la generación de células de memoria B con la ayuda proporcionado por el antígeno que presenta las células (APCs). Aquí, describimos un protocolo para caracterizar las respuestas del TD y TI Ig isotipo en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). En este protocolo, TD y TI Ig respuestas son sacadas en ratones por inmunización intraperitoneal (i.p.) con antígenos conjugado hapteno-modelo PNT-KLH (en alumbre) y PNT-polisacárido (PBS), respectivamente. Para inducir la respuesta de memoria TD, una inmunización de refuerzo de PNT-KLH en alumbre se da en 3 semanas después de la primera vacunación con el mismo antígeno/adyuvante. Suero de ratón es cosechada en diferentes puntos temporales antes y después de la inmunización. Total niveles de Ig y anticuerpos específicos a la PNT posteriormente se cuantifican utilizando Ig isotipo específica Sandwich y ELISA indirecto, respectivamente. Para cuantificar correctamente la concentración de suero de cada isotipo de Ig, las muestras deben diluirse adecuadamente para encajar dentro de la gama linear de las curvas estándar. Usando este protocolo, siempre hemos obtenido resultados confiables con sensibilidad y alta especificidad. Cuando se utiliza en combinación con otros métodos complementarios como la citometría de flujo, en vitro cultura de esplénico de células B e immunohistochemical tinción (IHC), este protocolo permitirá a los investigadores obtener una comprensión completa del anticuerpo respuestas en un entorno experimental dado.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los linfocitos B son el jugador principal en la inmunidad humoral y el único tipo de célula en mamíferos que son capaces de producir anticuerpos, denominados también como inmunoglobulinas (Ig)1,2. Anticuerpos secretados por las células de B proporcionan una defensa formidable contra los invasores patógenos a través de diversos mecanismos incluyendo la opsonización, neutralización y activación del complemento, conduciendo a inmunidad protectora3. Secreción de anticuerpos por las células B se logra después de la completa activación de células B específicas, que normalmente requiere que dos distintas señales3. Señal 1 es retransmitida por atascamiento directo del antígeno (Ag) al receptor de células B (BCR) expresado en la superficie de ingenuo específico B células3. Dependiendo de la fuente de señal 2, activación de la célula de B puede dividirse en timo dependiente (TD) o timo-independientes (TI)3,4. En una respuesta de antígeno TD, 2 señal es proporcionada por cognado T CD4 helper (TH) las células activadas, que expresan CD154, el ligando para el receptor coestimuladoras CD40 expresado en las células de B1,2,3. En una respuesta antígeno TI señal 2 viene de cualquier participación de receptores Toll-like (TLRs en el caso del tipo 1 TI Ag) o Cross-linking extenso de las BCRs (en el caso del tipo 2 TI Ag) en la B células3,4. Antígenos de TI (TI-1) de tipo 1 son ligandos microbianos de TLRs, incluyendo lipopolisacáridos bacterianos (LPS), RNAs virales y CpG de ADN microbiano4,5. Tipo 2 TI (TI-2) antígenos tienen estructura altamente repetitiva y son capaces de entregar prolongada y persistente de señalización a la célula de B por varios Cross-linking de la BCRs4,6. Típicos los antígenos TI-2 ejemplos de polisacáridos de neumococos y polisacárido conjugado hapteno-6,7. Antígenos de TD y TI pueden provocar respuestas de IgM específica de antígeno sólidas y también pueden inducir la producción de anticuerpos de isotipo-switched (IgG, IgA e IgE) con la ayuda brindada por el antígeno que presenta las células (APCs), como las células dendríticas (DCs)1 ,2,3. Además, TD y TI antígenos son capaces de inducir respuestas de memoria con la ayuda de APC, pero TD antígenos son más eficientes en la inducción de memoria células B generación3,8.

En este protocolo, TD y TI Ig respuestas son sacadas en ratones por la inmunización intraperitoneal (i.p.) con hemocianina de Lapa 2,4,6-trinitrophenyl-cerradura modelo hapteno conjugado antígenos (PNT-KLH) y PNT-polisacárido (neutro, muy ramificado y la Misa), respectivamente9,10,11. Antígenos de TD se utilizan generalmente con un adyuvante para mejorar la producción de anticuerpos12. Aquí en nuestro protocolo, PNT-KLH se inyecta con el alumbre, un coadyuvante utilizado en estudios de inmunización12. Otros ejemplos de aditivos que pueden utilizarse son completo o incompleto adyuvante de Freund (CFA o IFA), monophosphoryl-lípido A / dicorynomycolate de trehalosa (adyuvante de "Ribi del") y oligodeoxynucleotides de CpG, etc.13, 14. después de la inmunización, sueros de ratón son cosechados en diferentes puntos temporales y anticuerpos de PNT específicos en el suero se cuantifican utilizando Ig isotipo específica enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) de ensayo9,10, 11.

ELISA es un ensayo basado en la placa que es ampliamente utilizado como una herramienta de diagnóstico en medicina y también como una herramienta de análisis en investigación biomédica15,16. Se utiliza para detectar y cuantificar analitos como anticuerpos, hormonas, citoquinas, quimiocinas y varios antígenos, etcetera. ELISA se puede realizar en varios formatos diferentes, incluyendo directo, indirecto, sandwich y competitivo ELISA15,16. En general, implica la inmovilización del antígeno en una superficie sólida, generalmente una placa de microtitulación de 96 pocillos, que se incuba con un anticuerpo primario. Después de la incubación, el anticuerpo no Unido se lava lejos. En un ELISA directo, el anticuerpo primario directamente se conjuga a una enzima (generalmente la peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina), que puede unirse un sustrato cromogénico para producir un cambio de color visible detectado por un instrumento de detección de señal como un Espectrofotómetro15,16. Por el contrario, si un anticuerpo enzima-ligado del secundario se utiliza para enlazar el anticuerpo primario, entonces esto se considera como un indirecto ELISA15,16. ELISA directo es más rápido mientras que ELISA indirecta es más sensible15,16. En un sandwich ELISA, las placas están recubiertas con un anticuerpo de la «captura» utilizado para inmovilizar el antígeno de interés en las muestras, y luego puede detectarse el antígeno capturado por otro anticuerpo de la "detección" de una manera directa o indirecta15, 16. ELISA Sandwich ofrece alta especificidad ya que el antígeno es detectado por dos diversos anticuerpos del antígeno. En un ELISA competitivo, la competencia se establece entre el antígeno de la muestra y el antígeno de limite de placa de unión del anticuerpo primario, y entonces la concentración de antígeno en la muestra se cuantifica midiendo la reducción de señal del substrato 15 , 16. ELISA competitivo puede realizarse utilizando el formato mencionado directo o indirecto y es útil para la detección de antígenos pequeños con un único epitopo15,16.

Técnicas alternativas para la medición de anticuerpos incluyen radio-inmunoanálisis (RIA), electrochemiluminescence (ECL) ensayo y superficie de resonancia de plasmon (SPR) ensayo17. RIA fue el primer inmunoensayo desarrollado que medidas la presencia de un antígeno (o anticuerpos) de alta especificidad y sensibilidad usando reactivos radiactivos18,19. Sin embargo, debido a las preocupaciones de toxicidad radioactiva, sus costes de eliminación, vida útil y licencias especiales para trabajar con materiales radioactivos, ELISA es la mejor y más conveniente técnica común utiliza20,21. ECL es un ensayo altamente sensible que reacciones de quimioluminiscencia se inician usando electricidad para generar especies altamente reactivas a partir de precursores estables en la superficie de un electrodo y pueden ser utilizadas para medir la cantidad de analitos (como antígenos o anticuerpos)22. Sin embargo, ECL requiere un instrumento especial y por lo tanto no es tan ampliamente usado como ELISA23. SPR es un ensayo directo que puede utilizarse para medir la Unión de ligandos (por ej., anticuerpos) para inmovilizar moléculas (e.g., antígenos) en un sensor chip superficial24. SPR detecta las interacciones en tiempo real muy concreto y no requiere el uso de reactivos etiquetados como ELISA. Sin embargo, el SPR también requiere un equipo especial y tiene menor sensibilidad que el ELISA17. Dadas las limitaciones de los métodos alternativos, ELISA es la técnica más adecuada y conveniente para nuestro propósito en este protocolo. Aquí, describimos el uso de sandwich ELISA para el análisis de los niveles totales de isotipo de Ig y los procedimientos de ELISA indirecto para el análisis de los isotipos de Ig específica de antígeno.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo sigue las directrices del Comité de ética institucional de investigación animal de la Universidad de Rutgers. Todos los ratones se utilizan con arreglo a las directrices de los NIH y bajo un protocolo animal aprobado por la institucional Animal cuidado y uso.

1. preparación de ratones y recogida de sueros de ingenuo ratón

  1. Mantenga todos los ratones para los experimentos de inmunización en un específico Animalario libre de patógenos.
  2. Nocaut de sexo-emparejado, joven adulto (8-12 semanas) de uso y littermate control de ratones que comparten los mismos padres y jaulas para los estudios de inmunización.
  3. Plan de vacunación los horarios de recogida de suero como se muestra en la figura 1.
  4. La cosecha ingenuo suero de cada ratón en 7 días (-7 días) antes de la vacunación. Seguir los retro-orbitales sangrado suero preparación procedimientos y como se detalla a continuación en el paso 4.

2. elaboración de PNT-polisacárido (un antígeno de TI) y PNT-KLH (un antígeno de TD)

  1. Disolver los polvos de antígeno en PBS estéril (pH 7,4) a hacer 0,5 mg/mL 1 mg/mL de las soluciones madre PNT-KLH y PNT-polisacárido. Alícuota cada antígeno común solución en tubos estériles de microcentrífuga a 0,5 mL/tubo y mantener las alícuotas a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Evitar congelar y descongelar las alícuotas de antígeno múltiples.
  2. En el día de la inyección, calcular el volumen de PNT-polisacárido (50 μg/100 μl/ratón) o PNT-KLH (100 μg/100 μl/ratón) necesarios según el número de ratones que se inyecta. Descongelar el número apropiado de PNT-polisacárido o PNT-KLH alícuotas a temperatura ambiente (RT).
  3. Para la inyección de PNT-KLH, primero diluir el coadyuvante de alumbre (40 mg/mL) y 3 volúmenes de PBS estéril a una concentración final de 10 mg/mL. Asegúrese de que la mezcla de coadyuvante de alumbre es bien suspendida antes de la dilución.
  4. Combinar un volumen igual de 10 mg/mL alumbre coadyuvante de la mezcla del paso 2.3 y la solución de PNT-KLH descongelada (1 mg/mL) en un tubo de polipropileno de 5 mL y mezclar bien, incubar a 37 ° C durante 30 minutos preparar este PNT-KLH/alumbre la mezcla recién antes de la inyección.

3. inmunización de ratones

  1. Realizar la inyección intraperitoneal (i.p.) de PNT-polisacárido o PNT-KLH/alumbre para inmunizar los ratones con jeringas de insulina de 1 mL en un gabinete de bioseguridad. Inserte la aguja en ángulo de aproximadamente 30° preferentemente en el cuadrante inferior derecho de cada ratón para evitar la inyección en los órganos internos.
  2. Inyección i.p. 100 μl de PNT-polisacárido por ratón en el día 0 para la inmunización de TI Ag (figura 1A).
  3. En el día 0 para la vacunación de TD Ag inyectar la i.p. 200 μL de la mezcla de PNT-KLH/alumbre (recién preparada en el paso 2.4) por ratón. Repita la misma inyección el día 21 como una vacunación de refuerzo para estudios de memoria (figura 1B).
  4. Después de la inyección, retomar cada ratón de su jaula y mantener todos los ratones inyectados en condiciones libres de patógenos específicos.

4. retro-orbital sangrado y preparación de suero

  1. Suero de ratón en diferentes momentos de la cosecha: para la inmunización de PNT-polisacárido, recoger suero de ratón en el día -7 y 7 (figura 1A); para la inmunización de PNT-KLH/alum, recoger suero de ratón día -7, 7, 14 y 28 (figura 1B).
  2. Para retro-orbital sangrado, anestesiar cada ratón con isoflurano 5% 1-2 min en un gabinete de bioseguridad25. Realizar el reflejo pedal para asegurar adecuada anestesia de cada ratón.
  3. Sostenga el ratón anestesiado en una mano con el índice y el pulgar tirando la piel que rodea el globo ocular para que el globo ocular sobresale de la toma25. Inserte un tubo capilar o pipeta Pasteur no heparinizada en un ángulo de 45° en el ángulo interno de la cavidad del ojo debajo del globo ocular25.
  4. Aplique presión suave hacia abajo y gire el tubo suavemente para romper en la vena y recoge 150 – 200 μL de sangre en la pipeta o tubo o pipeta. Inmediatamente transferir la sangre a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril y retomar el ratón de su jaula para recuperar.
  5. Deje que la sangre muestras sentarse a temperatura ambiente durante 1-2 h para coagular.
  6. Centrifugar las muestras de sangre coagulada a 13.000 x g por 10 min a 4 ° C. Transferir el suero claro sobre el coágulo de sangre a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril.
  7. Repita el paso 4.6 una vez más para eliminar el coágulo de sangre residual y recoger el suero claro.
  8. Alícuota del suero en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL estéril en 50 μl/tubo y almacenar los sueros a-80 ° C.
  9. Alternan el ojo para el sangrado en diferentes puntos temporales para que cada ojo es purgar a lo más dos veces para el experimento entero. En la terminal del sangrado, recoger a 1 mL de sangre de cada ratón antes de eutanasia. Eutanasia el ratón con 5% CO2 seguido por dislocación cervical.
    Nota: Las células de B esplénico pueden ser cosechadas en vitro cultura estudios y análisis de citometría de flujo. También preparamos el ADN genómico de esplenocitos verificar el genotipo de cada ratón.

5. ratón Ig isotipo específica ELISA

  1. Preparar los buffers y soluciones antes de ELISA.
    1. Preparar 500 mL de tampón de acoplamiento (PBS, pH 7,4).
    2. Preparar 500 mL de solución de lavado (PBS-T (0,05% Tween 20), pH 7,4).
    3. Preparar 100 mL de tampón de bloqueo (1% de BSA en PBS, pH 7,4, almacenado a 4 ° C).
    4. Preparar 1 L de tampón de sustrato (dietanolamina de 1 M, pH 9.8 (97 mL de dietanolamina en 1 L de H2O, pH ajustado con 10 M de HCl) y 0,5 mM de MgCl2). Proteger el tampón de sustrato de luz envolviendo la botella con papel de aluminio. Almacenar a 4 ° C.
    5. Preparar 100 mL de solución de parada (3 M NaOH).
  2. Cubrir las placas de ELISA:
    1. Para el isotipo de Ig del suero total ELISA, capa de placas de 96 pocillos inmuno con 10 μg/mL de isotipo-específicos de captura del anti-ratón policlonal de cabra Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs en acoplamiento Buffer (PBS) a 100 μL/pocillo.
    2. Para PNT específicos Ig isotipo ELISA, capa de placas de 96 pocillos inmuno con 10 μg/mL de PNT(38)-BSA en PBS en 100 μL/pocillo.
    3. Para el isotipo de Ig PNT específicos de alta afinidad ELISA, capa de placas de 96 pocillos inmuno con 10 μg/mL de PNT(3)-BSA en PBS con 100 μL/pocillo26. Incubar las placas a 4 ° C durante la noche.
  3. Después de la incubación de la capa, lavar los platos 2 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T. Desechar el tampón de lavado y la mancha blanca /negra seco las placas (pulse cada plato boca abajo sobre una pila de toallas de papel) después de cada lavado.
  4. Bloquear las placas: agregar 200 μL/pocillo de bloqueo (1% de BSA en PBS) en las placas de recubrimientos e incubar las placas durante 1 h a TA.
  5. Mientras que las placas están bloqueando, preparar las diluciones de Ig isotipo estándares y las muestras de suero en Buffer de bloqueo en una placa de 96 pocillos separada, no tratada en 150 μL/pocillo.
    1. Preparar 250 estándares de isotipo de Ig ng/mL la concentración estándar inicial (St01) y hacer de 7 a 10 de diluciones seriadas 1:2 de las normas de Ig (St02 St07 o St10, figura 2A).
    2. Preparar suero de ratón muestras a una dilución 1: 100 o 1: 500 del factor como la dilución partida y hacen 3 o 4 de 1:10 diluciones seriadas para el isotipo de Ig total o diluciones seriadas de 1:5 para el isotipo de Ig PNT específico de cada muestra de suero (figura 2A). Para IgE ELISA, preparar las muestras de suero de ratón en un factor de dilución 1:2 como la dilución partida y hacer 3 de diluciones seriadas de 1:5 de cada muestra de suero.
  6. Después de bloquear, lavar los platos en el paso 5.4 tres veces con 200 μL/pocillo de PBS-T y blot seque las placas después de cada lavado.
  7. Transferir 100 μL/pocillo de diluido normas de isotipo de Ig (apropiadas para la captura y detección Abs) y las muestras de suero diluido de paso 5.5 a los platos preparados en el paso 5.6. Incubar las placas con los estándares y las muestras a 4 ° C durante la noche.
  8. Lavar los platos 3 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T y la mancha blanca /negra seco las placas después de cada lavado.
  9. En cada plato, añadir 100 μL/pocillo de 10 μg/mL de una apropiado fosfatasa alcalina (AP)-conjugados de isotipo-específicos de cabra anti-ratón Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A o E) Abs diluido en Buffer de bloqueo.
  10. Incubar las placas con Abs AP conjugado para el 1-2 h a TA. Para la detección de IgE, incubar las placas durante 1 – 2 h a 37 ° C.
  11. Preparar 1 mg/mL de solución de sustrato mediante la disolución de dos tabletas de sustrato de la fosfatasa de 5 mg en 10 mL de Buffer sustrato.
  12. Lavar la placa 5 veces con 200 μL/pocillo de PBS-T y la mancha blanca /negra seco las placas después de cada lavado.
  13. Añadir 100 μL/pocillo de solución sustrato a cada plato. Permite la reacción a desarrollar en el RT, que generalmente toma sólo unos minutos.
  14. Leer cada placa a 405 nm usando un lector de microplacas con su software asociado.
    1. Haga clic en "configuración" para establecer las longitudes de onda "Lm1" en "405 nm" y haga clic en "OK".
    2. Haga clic en "plantilla" para asignar wells "en blanco", "normas" pozos y pozos "desconocida" según la configuración de la placa de 96 pocillos.
    3. Para los pozos de "normas", haga clic en "serie" para establecer la "Primera muestra"como"St01", seleccione "Comenzar desde" en el "Top" y establecer "Replica" como "2". Compruebe"Muestra Descriptor" y "Valor estándar": seleccione "unidades"como"ng/mL", "valor inicial" como "250", sistema "paso a" como "2". Haga clic en "OK".
    4. Haga clic en "Leer" para leer la placa cuando más concentraron estándar alcanza una densidad óptica (OD) de ~ 1.
    5. Haga clic en el menú "archivo" y haga clic en "Guardar" para guardar el archivo.
    6. Haga clic en "leer" para leer la placa otra vez cuando el estándar de mayor concentración acerca a OD405 de ~ 1,5, 2 y 2.5, respectivamente.
  15. Detener la reacción añadiendo 25 μL/pocillo de 3 M NaOH. Realice los pasos 5.12 a 5.15 para una placa a la vez.
  16. Analizar los datos de ELISA utilizando el software asociado con el lector de microplaca:
    1. Compruebe los valores de OD405 de las normas de isotipo de Ig de leerlas archivos y seleccione una lectura apropiada con buen alcance lineal de las normas para el análisis de datos detallados.
    2. Seleccione el programa de instalación de 4 parámetros para trazar curvas estándar. Compruebe el coeficiente de la curva estándar (R2), que se necesitan para ser > 0.98 para asegurar datos buena calidad.
    3. Compruebe si los valores de OD405 de cada muestra de disminuyen con el aumento de factores de dilución. Clic en "Desconocidos" para recuperar la concentración de todos los pozos de muestra diluida.
    4. Seleccione un bien apropiado de cada muestra con OD405 en el rango lineal de la curva estándar del isotipo de Ig para el cálculo de la concentración.
    5. Calcular el suero la concentración de isotipo Ig de cada muestra utilizando la fórmula: suero la concentración de Ig = concentración bien seleccionado x factor de dilución.
  17. Trazar gráficos y realizar análisis estadísticos utilizando un software apropiado9,10,11. Hacer diagramas de dispersión vertical de suero niveles de isotipo de Ig para comparar las respuestas de Ig en el mismo punto de tiempo. Estudios de respuesta de memoria TD, hacer las curvas de respuesta del curso del tiempo a examinar las respuestas de isotipo de Ig antes y después de la vacunación del aumentador de presión. Usar barras de error para mostrar la desviación estándar (SD) de cada grupo de muestras. Para comparar las respuestas de isotipo de Ig entre los dos genotipos de ratones, use la prueba t para dos colas de datos para determinar la significación estadística. Establezca el valor de p < 0.05 como significativamente diferentes.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos utilizado este protocolo para investigar las funciones de un regulador crítico del sistema inmune, TRAF3, TI y TD Ig isotipo respuestas9,10,11. TRAF3 directa o indirectamente regula la transducción de la señal de un número de receptores inmunes innatos y adaptativos, incluyendo la superfamilia de receptores TNF, receptores Toll-like y T de la célula del receptor/CD28, entre otros

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, describimos el protocolo para la caracterización de las respuestas del TD y TI Ig isotipo en ratones usando ELISA. Exitosa implementación de este protocolo requiere el uso de materiales especificados en la tabla 1, incluyendo placas de ensayo ELISA, inmunización Ags, anticuerpos de isotipo-específicos de Ig de ratón y las normas. Debe tener cuidado de evitar el uso de las placas de cultivo de tejidos tratado para ELISA. Diluciones de los estándares y las muestras de suero deben ser en placas separa...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por los institutos nacionales de becas en salud CA158402 R01 (P. Xie) y R21 AI128264 (P. Xie), el Ministerio de defensa conceder W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), un premio de piloto del cáncer Institute de New Jersey a través de la concesión número P30CA072720 del Instituto Nacional del cáncer (P. Xie), una subvención Biomédica de Busch (P. Xie), una beca Stollar Victor (Lalani a.) y Anne B. y James B. Leathem beca (S. Zhu).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Lector de microplacas sintonizable VersaMaxMDS Analytical TechnologiesVERSAMAXEquipo para la lectura de placas
SOFTmax PRO 5.3MDS Analytical TechnologiesSOFTmax PRO 5.3Software para el lector de placas
Prisma GraphPad PrismaGraphPadSoftware para gráficos y estadísticas
TNP-AECM-polisacárido (FICOLL)Biosearch TechnologiesF-1300-10A TI Ag para inmunización
TNP-KLHBiosearch TechnologiesT-5060-5A TD Ag para inmunización
TNP(38)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (relación de conjugación: 38)Recubrimiento Ag para ELISA específico
TNP TNP(3)-BSABiosearch TechnologiesT-5050-10 (relación de conjugación: 3)Recubrimiento Ag para alta afinidad Ig Imject
Fisher Scientific PI-77161Alumbre adyuvante para la inmunización
Falcon Tubos de polipropilenoFisher Scientific 14-959-11APara la incubación de la jeringa de insulina BD TNP-KLH/alumbre
Fisher Scientific 14-829-1BPara inyección i.p. de ratones
inmunológicas de 96 pocillos, fondo planoFisher Scientific 14-245-61Para ELISA
Microplacas de 96 pocillos sin tratar, fondo redondoVWR82050-622Para diluciones en serie de patrones y muestras
Sustrato de fosfatasa, 5 mg Comprimidos SigmaS0942-200TABSustrato AP
DietanolaminaVWRIC15251690Un componente del tampón de sustrato AP
IgM antiratón de cabra SouthernBiotech1020-01Captura Ab para ratón IgM
Cabra anti-ratón IgG1SouthernBiotech1070-01Captura Ab para ratón IgG1
Cabra anti-ratón IgG2aSouthernBiotech1080-01Captura Ab para ratón IgG2a
Cabra anti-ratón IgG2bSouthernBiotech1090-01Captura Ab para ratón IgG2b
Cabra anti-ratón IgG3SouthernBiotech1100-01Captura Ab para ratón IgG3
Cabra anti-ratón IgASouthernBiotech1040-01Capture Ab para ratón
IgA cabra anti-ratón IgESouthernBiotech1110-01Capture Ab para ratón IgE
AP-Cabra anti-ratón IgMSouthernBiotech1020-04Detección Ab para ratón
IgM AP-Cabra anti-ratón IgG1SouthernBiotech1070-04Detección Ab para ratón IgG1
AP-Cabra anti-ratón IgG2aSouthernBiotech1080-04Detección Ab para ratón IgG2a
AP-Cabra anti-ratón IgG2bSouthernBiotech1090-04Detección Ab para ratón IgG2b
AP-Cabra anti-ratón IgG3SouthernBiotech1100-04Detección Ab para ratón IgG3
AP-Cabra anti-ratón IgASouthernBiotech1040-04Detección Ab para ratón IgA
AP-Goat anti-ratón IgESouthernBiotech1110-04Detección Ab para ratón IgE
ratón IgM estándarBD Biosciences553472TNP-específico IgM, Clon  G155-228
Estándar de IgG1 de ratónBD Biosciences554054IgG1 específico de TNP, clon  107.3
Estándar de IgG2a de ratónBD Biosciences556651IgG2a específico de TNP, clon  G155-178
Estándar de IgG2b de ratónBD Biosciences554055IgG2b específico de TNP, clon  49.2
Estándar de IgG3 de ratónBD Biosciences553486IgG3 específico de KLH, clon  A112-3
IgA de ratón estándarBD Biosciences550924IgA inducida por aceite mineral, clon   MOPC-320
Estándar de IgE de ratónBD Biosciences557079IgE específica de TNP, clon   C38-2
de Alumbre específico de TNPPlacas

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. Janeway's Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors--sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O'Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12(2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, Suppl 1 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7(2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research--issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719(2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997(2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O'Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Inmunoglobulina dependiente del timoAn lisis de suero de rat nELISA isotipo espec ficoInmunizaci n con TNP KLHInmunizaci n con TNP polisac ridoSangrado retroorbitarioLector de microplacasCitometr a de flujo

Artículos relacionados