El objetivo de este protocolo es realizar la hibridación en situ en adultos muestras de corales que han sido incrustadas en parafina y seccionadas en portaobjetos de vidrio. Se trata de un método cualitativo utilizado para visualizar la expresión espacial de una sonda de RNA anti sentida en tejidos embebidos en parafina.
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Artículo de método
In Situ Técnicas de hibridación para muestras de corales adultos parafinadas
En este artículo
Resumen
Resumen
Los corales son invertebrados océano importantes que son críticos para la salud general de los océanos y salud humana. Sin embargo, debido a los impactos humanos tales como el aumento de las temperaturas de océano y la acidificación del océano, los corales son cada vez más bajo amenaza. Para abordar estos desafíos, los avances en biología celular y molecular han demostrado para ser crucial para diagnosticar la salud de los corales. Modificar algunas de las técnicas utilizadas en medicina humana podría mejorar grandemente capacidad de los investigadores para tratar y salvar a los corales. Para hacer frente a esto, un protocolo para en situ hibridación utilizado principalmente en medicina humana y Biología del desarrollo evolutiva ha sido adaptado para su uso en adultos corales bajo estrés.
El propósito de este método es visualizar la expresión espacial de una sonda de RNA en tejido coral adulto que ha sido incluida en parafina y seccionadas en portaobjetos de vidrio. Este método se centra en la eliminación de la parafina y rehidratación de la muestra, tratamiento previo de la muestra para asegurar la permeabilidad de la muestra, pre-hibridación incubación, hibridación de la sonda de RNA y la visualización de la sonda de RNA. Este es un método eficaz al utilizar organismos no-modelo para descubrir donde se expresan genes específicos, y el protocolo puede ser fácilmente adaptado para otros organismos no-modelo. Sin embargo, el método es limitado en tanto que es principalmente cualitativo, porque la intensidad de la expresión puede variar dependiendo de la cantidad de tiempo utilizado durante la etapa de visualización y la concentración de la sonda. Además, la paciencia es necesaria, ya que este protocolo puede tomar hasta 5 días (y en muchos casos, más) dependiendo de la sonda se utiliza. Finalmente, la tinción de fondo inespecífica es común, pero esta limitación puede ser superada.
Introducción
Los corales son ecosistemas críticos e importantes para la biodiversidad en el océano y salud humana1,2,3. Están bajo amenaza debido al cambio climático y otros estresores antropogénicos, y muchas especies de coral se consideran en peligro crítico. Así, hay una necesidad importante de herramientas celulares y moleculares para diagnosticar los corales bajo estrés. Además, allí es poco entendido sobre que genes se expresan en el tejido adulto de coral y por lo tanto poca comprensión de las funciones de estos genes. Para solucionar este problema, nos hemos adaptado en situ
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Protocolo
1. eliminación de la parafina
PRECAUCIÓN: Realice los siguientes pasos bajo una campana de humos.
- Dewax seccionado fino parafina-encajado diapositivas con xileno 100% bajo el capó en frascos Coplin durante 10 minutos. No use plástico Coplin, como xileno derrite el plástico. Esterilizar los frascos Coplin en autoclave antes de su uso.
- Preparar cuatro frascos de Coplin de vidrio estéril con lo siguiente: 100% etanol, etanol al 80%, etanol al 70% y etanol al 60%. Diluir el etanol con agua libre de ARNasa.
- Transfiera los portaobjetos a la jarra de Coplin de vidrio estéril con 100% de etanol y remojar durante 10 minut....
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Resultados
Después de completar este protocolo, se logrará la identificación de células y tejidos que están expresando la sonda de RNA de interés. Resultados representativos de este protocolo están para AP-1, FosB y TNFR41. Estos resultados, publicados anteriormente por Traylor-Knowles et al. 11, Mostrar expresión espacial del RNA puntas de prueba en corales adultos que fueron expuestos a estrés por calor. Dos ejemplos de diferentes tipos de tinción se presentan en l.......
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Discusión
El método descrito en el presente Protocolo se ha modificado del anterior trabajo de investigación médica y evolutiva del desarrollo8,9,10,12,17. Este protocolo se centra en los matices de un hibridación en situ con sonda marcada con DIG RNA anti-sentido en corales adultos, que han sido preservados y embebidos en parafina. Este método se puede transfe.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el premio no. OCE-1323652 a través de la nacional Science Foundation océano ciencia Postdoctoral Fellowship y el premio no.1012629 del programa de enriquecimiento Postdoctoral de Burroughs Wellcome Fund.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de Denhardt | Affymetrix | 70468 50 ML | |
| Bioworld Tampón de fosfatasa alcalina | Fisher | 50-198-724 | |
| Sobres de diapositivas | Fisher | 12-587-17B | |
| Bioworld Tampón de fosfatasa alcalina | Fisher | 50-198-724 | |
| 50 mL Tubos Falcon Fisher | 14-959-49A | ||
| Solución de ADN de esperma de salmón ultrapura | Invitrogen | 15632-011 | |
| PBS - Solución salina tamponada con fosfato (10X) pH 7.4 | Invitrogen | AM9625 | |
| Agua destilada ultrapura de DNasa/sin ARNasa, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| Agua destilada ultrapura de DNasa/sin ARNasa, 10 x 500 mL | Invitrogen | 10977-023 | |
| Solución de ADN de esperma de salmón ultrapuro | Invitrogen | 15632-011 | |
| Portaobjetos adhesivo superior ápice blanco | Leica Biosystems | ||
| , pH 7.4 | Life Technologies | 10010072 | |
| Proteinasa K, grado molecular, 2 mL | New England Biolabs | P8107S | |
| Super Pap Pen Bloqueador de líquidos | Promega | 22309 | |
| DIG Anti-Digoxigenina-AP Fab fragmentos | Roche | 11093274910 | |
| BM Purple, 100 mL | Roche | 11442074001 | |
| DIG Wash and Block Buffer Set | Roche | 11585762001 | |
| NBT/BCIP | Roche | 11681451001 | |
| Solución de formaldehído, tamaño de 500 mL | Sigma-Aldrich | 252549-500ML | |
| SSC Buffer 20X concentración | Sigma-Aldrich | S6639-1L | |
| Anhídrido Acético | Sigma-Aldrich | 320102-100ML | |
| Formamida | Sigma-Aldrich | 47670-250ML-F | |
| Trietanolamina | Sigma-Aldrich | 90279-100ML | |
| Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| Xilenos, AR (ACS), para uso | histológicoEtanol de | MK866806 | |
| VWR | VWR EM-EX0276-4S | ||
| Tampón TE | PAV6232 | ||
| VWR | 97005-252, 97005-254 | ||
| Agitador orbital | VWR | 89032-088 |
Referencias
- Hughes, T. P., et al. Climate Change, Human Impacts, and the Resilience of Coral Reefs. Science. 301 (5635), 933(2003).
- Chen, P. -Y., Chen, C. -C., Chu, L., McCarl, B. Evaluating the economic damage of climate change on global coral reefs. Global Environmental Change. 30 (Supplement C), 12-20 (2015).
- Hoegh-Guldberg, O., et a....
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Reimpresiones y permisos
