Una medida cuantitativa de especies reactivas de oxígeno y senescencia asociada a fenotipo secretor en fibroblastos humanos normales durante la senescencia inducida por el oncogén

Resumen

ROS intracelular se ha demostrado para desempeñar un papel importante en la inducción de senescencia celular. Aquí, describimos un análisis sensible para cuantificar los niveles ROS durante la senescencia celular. También ofrecemos protocolos para evaluar el fenotipo secretor asociados a senescencia, que supuestamente contribuye a diferentes disfunciones relacionadas con la edad.

Resumen

Senescencia celular se ha considerado un estado de detención del crecimiento irreversible sobre agotamiento de la capacidad proliferativa o la exposición a tensiones diferentes. Estudios recientes han ampliado el papel de la senescencia celular a varios procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo, la cicatrización de heridas, vigilancia inmune y la disfunción relacionada con la edad del tejido. Aunque la detención del ciclo celular es una característica crítica de senescencia celular, una producción de aumento intracelular de oxígeno reactivo (ROS) las especies también se ha demostrado que juegan un papel importante en la inducción de senescencia celular. Además, estudios recientes revelaron que las células senescentes exhiben actividades potente paracrina sobre vecinos células y tejidos a través de un fenotipo secretorio asociada a la senescencia (spas). Fuerte aumento de interés sobre estrategias terapéuticas contra la senescencia celular hace hincapié en la necesidad de un entendimiento preciso de los mecanismos de la senescencia, incluyendo ROS intracelular y el SASP. Aquí, describimos protocolos para evaluar cuantitativamente los niveles ROS intracelulares durante la senescencia celular inducida por el H-Ras utilizando colorante fluorescente sensible al ROS y citometría de flujo. Además, presentamos las técnicas sensibles para el análisis de la inducción de la expresión del mRNA y la secreción de factores de spas. Estos protocolos pueden aplicarse a diversos modelos de senescencia celular.

Introducción

Más de 50 años, Hayflick y Moorhead revelaron que las células normales entren la detención de crecimiento irreversible sobre el agotamiento de su potencial proliferativo después de un cierto número de divisiones celulares¹. Este fenómeno se conoce como senescencia replicativa y se cree que correlaciona fuertemente con la envejecimiento². Aunque la erosión progresiva de los telómeros es considerada una de las principales causas de la senescencia replicativa, varias tensiones celulares, tales como daño del ADN, activación oncogénica y estrés oxidativo, se han divulgado para inducir a otro tipo de senescencia celular se lla....

Protocolo

1. induce senectud Oncogene-inducida

1. Preparación de un H-RasV12 retrovirus
   1. Capa de la placa de cultivo de 100 mm, añadir 2 mL de 0.001% poly-L-lisina/fosfato tampón salino (PBS) por 5 min a temperatura ambiente.
   2. Retirar la solución de poli-l-lisina, mediante una pipeta de vidrio conectada a una aspiradora y lavar la placa de cultivo, añadir 2 mL de 1 x PBS.
   3. Placa de 3 x 10⁶ ecotropic BOSC-23 empaquetado sobre la cultura cubierta plato con de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) que contiene 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina/estreptomicina y cultivo a 37 ° C en un cultivo de teji....

Resultados

En la figura 1se muestra un ejemplo de la senescencia inducida por el H-Ras. Una infección de fibroblastos humanos normales de WI-38 con el retrovirus de H-RasV12 indujo dramáticos cambios morfológicos (figura 1B). Además, como se muestra en la figura 1, actividad tinción de β-gal SA se incrementó notablemente al H-RasV12 expresión. Más del 70% de las células demostraron SA β-gal tinción actividad 6 .......

Discusión

Aquí, hemos presentado para el monitoreo de los niveles ROS intracelulares durante la senescencia inducida por el H-Ras en fibroblastos humanos normales WI-38. Niveles ROS intracelulares en células vivas pueden medirse cuantitativamente utilizando el reactivo permeable a la célula DCF-DA y citometría de flujo. Absorción celular, DCF-DA es desacetilado por esterasas intracelulares y, posteriormente, oxidado por ROS para formar altamente fluorescente 2', 7'-Diclorofluoresceína (DCF). La fluorescencia DCF puede detectarse m.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
FUERTE
poli-lisina	fuerte Sigma-Aldrich	P2636
BOSC 23	ATCC	CRL-11269
FBS	GIBCO	16000-044
penicilina/estreptomicina	wellgen	LS202-02
PBS	Hyclone	SH30013.02
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
pBabe puro-H-RasV12	Addgene	1768
pGAG/pol	Addgene	14887
pVSVG	Addgene	1733
Turbofect	Thermo Fisher Scientific	R0531
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/mL
puromicina	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/mL
formaldehído	Sigma-Aldrich	F8775
5-bromo-4-cloro-3-indolil y beta; D-galactopiranósido (X-gal)	Sigma-Aldrich	B4252
ferrocianuro de potasio	Sigma-Aldrich	B4252
ferricianuro de potasio	Sigma-Aldrich	P9387
tripsina-EDTA	pozo	LS015-01
DCF-DA	Sigma-Aldrich	D6883	10 mM
Trizol	Thermo Fisher Scientific	15596026
MMLV Transcriptasa inversa	Promega	M1701
SYBR Verde PCR master 2x mezcla	Takara	PR820A
Imprimación aleatoria	Promega	C118A
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
Agua destilada ultrapura	Invitrogen	10977015
Ensayo ELISA IL-6 humano	PeproTech	#900-TM16
Ensayo ELISA IL-8 humano	PeproTech	#900_TM18
EQUIPOS
0.45 μ m filtro de jeringa	sartorius	16555
Parafilm	BEMIS	Microscopio PM-996
	NIKON	TS100
Citómetro de flujo	BD Bioscience	LSR Fortessa
Amicon Ultra-4ml	Merk Millipore	UFC800324
Espectrofotómetro NanoDrop	BioDrop	80-3006-61
Sistema de PCR en tiempo real	Applied Biosystems	ABI Prism 7500
ELISA Lector	Molecular Devices		microplacas EMax

Lector de