Aquí, presentamos un protocolo para diseñar y fabricar un embrión de pez cebra colocar plantilla, seguido de un procedimiento detallado sobre el uso de dicha plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra colocar en una placa de 96 pocillos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
3 dimensiones (3D)-impreso la plantilla para alto rendimiento embrión de pez cebra matriz
En este artículo
Resumen
Resumen
El pez cebra es que un organismo reconocido a nivel mundial de agua dulce utilizadas en Biología del desarrollo, toxicología ambiental y enfermedades humanas campos de investigación relacionados. Gracias a sus características únicas, incluyendo gran fecundidad, translucidez del embrión, desarrollo rápido y simultáneo, etc., embriones de pez cebra se suelen utilizar para la evaluación de la toxicidad de gran escala de sustancias químicas y drogas/compuesto proyección. Un procedimiento típico de proyección implica el desove del pez cebra adulto, la selección de embriones y colocar los embriones en placas de varios pocillos. A partir de ahí, los embriones son sometidos a la exposición y la toxicidad del producto químico, o puede evaluar la eficacia de los compuestos de drogas relativamente rápidamente en base a observaciones fenotípicas. Entre estos procesos, colocar los embriones es uno de los pasos más desperdiciador de tiempo y mano de obra intensiva que limita el nivel de rendimiento. En este protocolo, presentamos un enfoque innovador que hace uso de una plantilla de arraying impreso en 3D junto con vacío manipulación para acelerar este paso laborioso. El protocolo en el presente documento describe el diseño general de la plantilla arraying, una configuración experimental detallada y paso a paso, procedimiento por resultados representativos. Cuando se implementa, este enfoque resulta beneficioso en una variedad de aplicaciones de la investigación con embriones de pez cebra como sujetos de prueba.
Introducción
Como un organismo modelo popular, el pez cebra es ampliamente utilizado en los campos de la medicina y toxicología1,2,3,4. Comparado con plataformas en vitro , pez cebra ofrecen mucho mayor complejidad biológica que uno o dos tipos de la célula no podrían ofrecer. Además de ser un organismo modelo de pez cebra gran fecundidad, desarrollo embrionario rápido y simultáneo y órgano alta translucidez han dado este ventajas únicas del modelo a utilizar para toxicidad de gran escala o detección de5drogas/compuesto. Los cientos de embriones producidos por un par de pez cebra adulto cada semana superan otros modelos todo animales y han hecho conveniente para el cribado de alto rendimiento.
Un procedimiento típico de proyección utilizando el pez cebra implica una cantidad significativa de trabajo manual, como el pez cebra adulto desove, selección de embriones y colocar los embriones en recipientes adecuados donde son sometidos a la exposición a través de la inmersión en agua. Se monitorea el desarrollo de los embriones y extremos observables como anormalidad, incubabilidad y mortalidad a menudo son evaluados manualmente y utilizados como la identificación preliminar de la toxicidad de productos químicos o las indicaciones de la efectividad de drogas o compuestos. Para acelerar el procedimiento de investigación, enfoques como la proyección de imagen automatizada y análisis de imagen asistida por computador han sido explorados previamente. Por ejemplo, microscopios con alto contenido de capacidades de la proyección de imagen han sido adaptados para realizar automatizado campo brillante o proyección de imagen de fluorescencia en embriones de pez cebra en las distintas etapas del desarrollo de placas de 96/384 pozos6. Dispositivos microfluídicos juntados con microscopios fueron utilizados para colocar las larvas de pez cebra a través de la manipulación actual de proyección de imagen de cerebro neuronas7. Estos enfoques podrían mejorar significativamente la eficiencia de adquisición de imagen en comparación con la tradicional operación manual. Por otra parte, con gran cantidad de imágenes generadas, herramientas de análisis de imagen también se han desarrollado para acelerar el procesamiento de datos, según lo demostrado por Liu et al. y Tu et al. 8 , 9.
A medida que aumenta el nivel de rendimiento de análisis de imagen y proyección de imagen, se hizo evidente que el paso de limitación de velocidad para la investigación se encuentra en el proceso de preparación de embriones de pez cebra para la exposición, que por lo general significa colocar en placas de 96 o 384 pocillos. Para resolver este paso cuello de botella, guiada por la visión robótica fueron desarrollados por Mandrell et al. 10 y nos11 anteriormente para reemplazar la manipulación manual pero los instrumentos eran bastante sofisticados y hay una profunda curva de aprendizaje para implementar dichas técnicas. Por lo tanto, para proporcionar un enfoque de fácil uso se convierte en un factor importante para mejorar el nivel de rendimiento de la detección de pez cebra y es el principal objetivo de este trabajo.
En este trabajo, hemos diseñado y había fabricado un embrión colocar plantilla de impresión 3D. Una plantilla así de arraying fue diseñada para atrapar el embrión de pez cebra en pozos que se ajustan a una estándar placa de 96 pocillos. En lugar de embriones para seleccionar y colocar en cada pozo uno por uno, uno podría realizar matriz y atrapamiento de embrión 96 todos los embriones en una placa multicapa a la vez. Utilizando esta plantilla y el protocolo siguiente, uno podría aumentar significativamente la eficacia de colocar los embriones en placas multicapa, que en término de impulso por lo menos diez veces, la capacidad de detección en comparación con operación manual. El protocolo que se describe a continuación incluye un diseño global para colocar la plantilla, el desove del pez cebra, colección embrionaria y matriz. La figura 1 muestra el diseño general de la plantilla arraying. La figura 2 muestra un resumen del protocolo paso a paso sobre el uso de la plantilla descrita en las partes 3 y 4.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
1. diseño y fabricación de un embriones de pez cebra colocar plantilla
-
Diseño de la plantilla de arraying con un 12 por 8, diseño de 96 pocillos que se ajusta a una estándar placa de 96 pocillos. Uso las dimensiones listadas en la figura 1A para la cámara de captura superior del embrión (véase también el archivo suplementario).
- Utilice las dimensiones que se muestra en la figura 1B y 1D para la captura del bien.
- Utilice las dimensiones en la figura 1 para la cámara de vacío de fondo.
- Utilizar las dimensiones en la figura 1B para el aire / salida.
- Utilice una impresora 3D (con precisión de 0,1 mm) para imprimir la plantilla; Véase Tabla de materiales para resina recomendada para ser utilizado para la impresión.
Nota: las impresoras 3D con una precisión de 0,1 mm se recomiendan para la fabricación de la plantilla arraying (véase Tabla de materiales). El color sugerido para la superficie de la plantilla es gris oscuro o negro.
2. pez cebra embrión de desove
- Colocar dos pares de peces machos y hembras por apareamiento caja un día antes del desove. Separados machos y hembras por un divisor de plástico transparente.
- Sacar los separadores en la mañana para mezclar peces macho y hembra.
- Quite los pescados masculinos y femeninos y recolectar embriones de pez cebra con un colador de malla fina. Lave los embriones con huevo 250 mL de agua (véase Tabla de materiales).
- Transferencia de los embriones colectados a cajas Petri (90 mm de diámetro) con solución de Holtfreter (véase Tabla de materiales) y eliminar embriones muertos y no fecundados con un estereomicroscopio.
- Coloque los embriones en una incubadora de 28,5 ° C. A las 4 h post fertilización (hpf), observar los embriones y eliminar cualquier embriones muertos e insalubres. Los embriones están listos para el siguiente paso.
3. preparación de colocar plantilla
- Lave la plantilla de 2 a 3 veces con 500 mL de agua desionizada y ponerlo en el horno de secado (45 ° C) durante 5 minutos.
- Cinta de la cámara inferior con un trozo de película (figura 2paso 1).
- Conecte una bomba de vacío a través de la salida de aire en la parte inferior de la plantilla.
Nota: El vacío máximo recomendado para la bomba de vacío es de 0,1 Mpa. Ser conscientes de la fuerza del vacío utilizado. Si la presión negativa es demasiado fuerte, cortar un agujero en forma de Cruz en la película para bajar la presión.
4. colocar embriones de pez cebra en una placa de 96 pocillos
- Usando una pipeta de transferencia plástica, coloque aproximadamente 150 embriones en la plantilla, como se muestra en la figura 2, paso 2.
- Conecte la bomba de vacío a la salida de aire para generar presión negativa en la cámara de sellado de la película en el paso 3.3.
- Agite horizontalmente toda la plantilla hasta que cada uno tiene bien atrapado de un embrión (figura 2, paso 3).
Nota: Si solución de Holtfreter se agota antes de que los embriones se encuentran atrapados en cada pocillo, añadir solución de Holtfreter adicional en la cámara de captura y repita este paso. - Deseche la solución extra Holtfreter y embriones que no son atrapados en los pozos (figura 2, paso 4).
- Apague y desconecte la bomba de vacío.
- Coloque una placa estándar de 96 pocillos boca abajo contra la plantilla (figura 2, paso 5) y gire a ambos al mismo tiempo (figura 2, paso 6).
- Toque en la parte inferior de la plantilla o conectar el aire toma a una cantidad de gas comprimido puede para transferir embriones todos atrapados de la plantilla a la placa de 96 pocillos (figura 2, paso 6).
- Repita los pasos 4.1 a 4.8 para preparar placas de múltiples pozos adicionales.
- Quitar la película y lavar la plantilla 3 veces de arriba a abajo con 500 mL de agua desionizada para uso futuro.
Nota: No utilice solventes orgánicos como etanol, para limpiar la plantilla.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La figura 3 muestra una plantilla típica de arraying impreso en 3D. Esta plantilla utiliza resina fotosensible como materia prima y fue hecha por una impresora 3D; se aplicó una capa de pintura negra para proporcionar un mejor contraste con el color de los embriones. La posición de 96 pocillos (12 por 8) fue diseñada para encajar con una placa estándar de 96 pocillos. Del mismo modo, una plantilla bien de 384 (24 por 16) también podría ser diseñado y había fa...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Hay dos pasos críticos en este protocolo que requieren especial atención para una exitosa implementación de plantilla 3D impresa para colocar los embriones de pez cebra.
El factor más importante en el diseño de la plantilla arraying es la captura. A hace que hay solamente un embrión en cada pocillo, uno debe prestar mucha atención al diámetro y la profundidad del pozo de atrapamiento y el diámetro del agujero a través. El diámetro recomendado es de 1.5 a 2 veces del diámetro de un embrión típi...
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores han llenado una patente sobre la plantilla impresa en 3D descrita.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el programa "1000plan", los fondos de puesta en marcha de la Universidad de Tongji y NSFC concesión # 21607115 y 21777116 (Lin).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Instalación de pez cebra | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | Z-A-S5 | |
| Caja de acoplamiento | Shanghai Haisheng Biotech Co., Ltd. | ||
| Botella de lavado, 500 ml | Sangon Biotech | F505001-0001 | |
| Cloruro de sodio | Vetec | V900058-500G | |
| Cloruro de potasio | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10016318 | |
| Cloruro de calcio | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 20011160 | |
| Bicarbonato de sodio | Vetec | v900182-500G | |
| Azul de metileno hidrato | TCI | M0501 | |
| Ácido clorhídrico | Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd | 10011008 | |
| Sales Marinas | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Pipeta | Fisherbrand | 13-675M | |
| Pipeta Pasteur de Gota Controlada Fisherbrand | 13-678-30 | ||
| Microscopio | OLYMPUS | SZ61 | |
| Incubadora bioquímica | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | LRH-250 | |
| UnionTech | Lite600 | ||
| Resina fotosensible | UnionTech | UTR9000 | |
| Bomba de vacío | Shanghai Yukang Scientific Instrument Co., Ltd. | SHB-IIIA | |
| Adhesivo PCR Placas Seals | Solarbio | YA0245 | |
| Placa de 96 pocillos | Costar | 3599 | |
| Multi Pipeta de 8 canales 30 - 300 μ l | Eppendorf | 3122000.051 | |
| Plumero de gas comprimido | Shanghai Zhantu Chemical Co., Ltd. | ST1005 | |
| DI Agua | Thermo | GenPure Pro UV/UF | |
| Horno de secado | Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd. | BPG-9106A Agua | |
| del sistema Agua fuera de la instalación' s sistema de agua | |||
| Agua | diluida 60mg " Océano instantáneo" sales marinas y 0,25 mg/L de azul de metileno en 1 L de agua | ||
| DI Holtfreter' | Disuelva 7,0 g de cloruro de sodio (NaCl), 0,4 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3), 0,1 g de cloruro de potasio (KCl), 0,235 g de cloruro de calcio (CaCl2,2H2O) en 1,9 L de agua desionizada. Ajuste el pH a 7 usando HCl y ajuste el volumen a 2 L usando agua Di |
Referencias
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Leslie, M. Zebrafish larvae could help to personalize cancer treatments. Science. 357 (6353), 745-745 (2017).
- Lin, S., et al. Understanding the Transformation, Speciation, and Hazard Potential of Copper Particles in a Model Septic Tank System Using Zebrafish to Monitor the Effluent. ACS Nano. 9 (2), 2038-2048 (2015).
- Lin, S., et al. Aspect ratio plays a role in the hazard potential of ceo2 nanoparticles in mouse lung and zebrafish gastrointestinal tract. ACS Nano. 8 (5), 4450-4464 (2014).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nature Communications. 4, (2013).
- Lin, S., et al. High content screening in zebrafish speeds up hazard ranking of transition metal oxide nanoparticles. ACS Nano. 5 (9), 7284-7295 (2011).
- Kuipers, J., Kalicharan, R. D., Wolters, A. H. G., van Ham, T. J., Giepmans, B. N. G. Large-scale Scanning Transmission electron microscopy (nanotomy) of healthy and injured zebrafish brain. Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).
- Liu, R., et al. Automated Phenotype Recognition for Zebrafish Embryo Based In vivo High Throughput Toxicity Screening of Engineered Nano-Materials. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Tu, X., et al. Automatic Categorization and Scoring of Solid, Part-Solid and Non-Solid Pulmonary Nodules. in CT Images with Convolutional Neural Network. Scientific Reports. 7, 8533(2017).
- Mandrell, D., et al. Automated zebrafish chorion removal and single embryo placement: optimizing throughput of zebrafish developmental toxicity screens. Journal of Laboratory Automation. 17 (1), 66-74 (2012).
- Lin, S., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9 (9-10), 1608-1618 (2013).
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
