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Artículo de método

Coincidencia de contraste detergente en Small-Angle Neutron Scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado Ab Initio

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DOI:

10.3791/57901

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21 de octubre de 2018

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1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

En este artículo

Resumen

Este protocolo muestra cómo obtener un modelo de baja resolución ab initio y detalles estructurales de una proteína de membrana de detergente solubilizado en solución mediante dispersión de neutrones de ángulo pequeño con coincidencia de contraste del detergente.

Resumen

El instrumento de dispersión biológica small-angle neutron en el alto flujo isótopo Reactor de Oak Ridge National Laboratory se dedica a la investigación de materiales biológicos, biocombustible procesado y materiales Bioinspirados cubriendo nanómetro a escalas de la longitud del micrómetro. Los métodos presentados aquí para investigar las propiedades físicas (es decir, tamaño y forma) de proteínas de membrana (aquí, MmIAP, una intramembranosas aspartil proteasa de Methanoculleus marisnigri) en soluciones de formación de micelas son detergentes adecuado de este instrumento de dispersión de ángulo pequeño neutrón, entre otros. Otras técnicas de caracterización biofísica se ven obstaculizados por su incapacidad para abordar las contribuciones detergentes en una estructura compleja de proteína-detergente. Además, el acceso al laboratorio Bio-grado de deuteración ofrece capacidades únicas para la preparación de cultivos a gran escala y expresión de proteínas marcado con deuterio para mayor dispersión de la señal de la proteína. Mientras que esta técnica no proporciona los detalles estructurales en alta resolución, la brecha de conocimiento estructural de proteínas de la membrana contiene muchas zonas direccionables de investigación sin necesidad de resolución atómica cerca. Por ejemplo, estas áreas incluyen la determinación de los Estados, formación de complejos, cambios conformacionales durante la perturbación y eventos plegar/desplegar. Estas investigaciones se pueden lograr fácilmente a través de aplicaciones de este método.

Introducción

Proteínas de membrana están codificadas por aproximadamente el 30% de todos los genes1 y representan una gran mayoría de objetivos de medicamentos modernos. 2 estas proteínas realizan una amplia gama de funciones celulares vitales,3 pero a pesar de su abundancia e importancia — sólo representan alrededor del 1% de estructuras total depositado en la investigación Collaboratory para bioinformática estructural (RCSB) proteína Banco de datos. 4 debido a su naturaleza parcialmente hidrofóbica, determinación estructural de proteínas de membrana-limite ha sido sumamente difícil. 5 , 6 , 7

Como muchas técnicas biofísicas requieren monodispersa partículas en solución para la medición, aislamiento de proteínas de la membrana de las membranas nativas y estabilización de estas proteínas en un imitador soluble de las membranas nativas ha sido un área activa de investigación en los últimos décadas. 8 , 9 , 10 estas investigaciones han llevado al desarrollo de muchas asambleas de novela anfifílicos para solubilizar proteínas de membrana, tales como nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 y amphipols. 16 , 17 sin embargo, el uso de micelas de detergente sigue siendo uno de los enfoques más comunes y sencillos para satisfacer los requisitos de la solubilidad de una proteína determinada. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 por desgracia, no solo detergente mágica mezcla de detergentes actualmente existe o que cumpla con todas las proteínas de la membrana; así, estas condiciones deben ser defendidas empíricamente para los requerimientos únicos de cada proteína. 26 , 27

Detergentes uno mismo-montan en la solución por encima de su concentración micelar crítica para formar estructuras de agregados llamadas micelas. Micelas están compuestas de muchos monómeros detergentes (típicamente entre 20-200) con cadenas alkyl hidrofóbica formando un núcleo micelar e hidrofílicos grupos cabeza dispuestos en una capa de cáscara de micela hacia el disolvente acuoso. El comportamiento de la formación de la micela y los detergentes ha sido clásicamente descrito por Charles Tanford en El efecto hidrofóbico,28 y tamaños y formas de micelas de los detergentes comúnmente usados en estudios de proteínas de membrana han sido caracteriza usando dispersión de ángulo pequeño. 29 , 30 organización de detergente sobre las proteínas de la membrana también se ha estudiado, y se espera la formación de complejos de proteína-detergente (PDC) con las moléculas de detergente que rodean la proteína en un arreglo que se asemeja al detergente limpio micelas. 31

Añade una ventaja en el uso de detergentes es que las propiedades resultantes de la micela pueden manipularse mediante la incorporación de otros detergentes. Muchos detergentes exhiben mezcla ideal, y seleccione Propiedades de micelas mixtas se pueden incluso predecir de los componentes y la relación de la mezcla. 22 sin embargo, la presencia de detergente puede todavía presentar desafíos para caracterizaciones biofísicas contribuyendo a la señal total. Por ejemplo, con rayos x y técnicas de dispersión de la luz, la señal de detergente en el PDC es prácticamente indistinguible de la proteína. 32 investigaciones con microscopia del cryo-electrón de solo-partícula (cryo-EM) normalmente dependen de atrapadas partículas (congeladas); detalles estructurales de la proteína son todavía oscurecidos por ciertos detergentes o una alta concentración de detergente que se añade a un segundo plano. 33 enfoques alternativos para interpretar la estructura PDC completa (incluyendo el detergente) se han hecho a través de métodos computacionales que pretenden reconstruir el detergente alrededor de una proteína de membrana dada. 34

Para el caso de dispersión de neutrones, el arreglo de core-shell de detergente en la micela produce un factor de forma que contribuye a la dispersión observada. Afortunadamente, se pueden alterar componentes de la solución tal que no contribuyen a la dispersión observada neta. Este proceso de "coincidencia de contraste" se consigue sustituyendo el deuterio por hidrógeno alcanzar una densidad de longitud de dispersión que coincide con el del fondo (buffer). Deben considerarse una elección juiciosa del detergente (con contrapartes deuterados disponibles) y su proporción de la mezcla. De micelas de detergente, esta sustitución puede realizarse usando un detergente con el mismo grupo de cabeza pero con una cadena alquil deuterados (d-cola en lugar de h-cola). Puesto que los detergentes están bien mezclados,35 los agregados tendrán una densidad de longitud de dispersión que es la fracción molar ponderada promedio de los dos componentes (h-colas y colas de d). Cuando este contraste promedio es consistente con el grupo de cabeza, las estructuras agregadas uniforme pueden combinarse completamente para quitar todas las contribuciones a la dispersión observada.

Presentamos aquí un protocolo para manipular el contraste de neutrón de micelas de detergente mediante la incorporación de moléculas detergentes químicamente idénticas con cadenas alkyl marcado con deuterio. 19 , 36 , 37 esto permite completo contraste simultáneo que empareja del núcleo micelar y la cáscara, que es una capacidad única de dispersión de neutrones. 35 , 38 este significativamente refinado nivel de detalle, coincidencia de contraste permiten lo contrario inviables estudios de estructuras de proteínas de membrana. Además, este enfoque de contraste de coincidencia se podría extender a otros sistemas con detergente, como intercambio de polímero reacciones39 y aceite-agua dispersantes,40 o incluso otros agentes solubilizantes, como bicelles,41 nanodiscs,42 o bloque copolímeros. Enfoque similar 43 A como se describe en este manuscrito, pero empleando una sola especie de detergente con sustituciones parciales del deuterio en el grupo alquil de cadena o cabeza, se publicó recientemente. 37 mientras que esto puede ser para mejorar la distribución aleatoria de hidrógeno y deuterio en el detergente en comparación con el enfoque presentado aquí, el número limitado de posiciones disponibles en el detergente para sustitución y dos etapas síntesis de detergente necesaria plantea retos adicionales para su consideración.

Pasos 1 y 2 del protocolo que se detallan a continuación a menudo se superponen puesto que el experimento inicial planificación debe hacerse para presentar una propuesta de calidad. Sin embargo, la presentación de propuesta se considera aquí como el primer paso para destacar que este proceso debe comenzar antes de un experimento de neutrones. Cabe señalar que un paso necesario, que debe ser demostrado por la propuesta, es que la caracterización bioquímica y física (incluyendo la pureza y estabilidad) de la muestra apoya la necesidad de estudios de neutrones. Una discusión general de ángulo pequeño neutrón dispersión (SANS) está fuera del alcance de este artículo. Una introducción breve pero exhaustiva está disponible en la obra de referencia de Caracterización de materiales por Kaufmann,44 y una solución integral de libros de texto enfocada en biológico ángulo pequeño dispersión ha sido publicado recientemente. 45 más lectura recomendada es dada en la sección de discusión. Dispersión de ángulo pequeño utiliza el llamado vector de dispersión Q como la cantidad central que describe el proceso de dispersión. Este artículo utiliza la definición ampliamente aceptada Q = 4π pecado (θ) / λ, donde θ es la mitad el ángulo entre la viga entrante y dispersa y λ es la longitud de onda de la radiación de neutrón en Angstroms. Existen otras definiciones que uso diferentes símbolos tales como ' por el vector de dispersión y que puede variar por un factor 2π o mediante nanómetros en lugar de Angstrom (véase también discusión de la figura 10).

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Protocolo

1. preparar y presentar una propuesta de instrumento y neutrones instalación haz tiempo

  1. Consultar recursos en línea para identificar servicios de dispersión de neutrones que acceso usuario general neutrón viga tiempo, como laboratorio nacional de Oak Ridge (ORNL). Mapa de neutrón instalaciones e información sobre la investigación del neutrón en todo el mundo está disponible en línea. 46 ten en cuenta que estas instalaciones tienen convocatorias periódicas de propuestas; determina cuándo estará disponible la próxima vez haz. Neutrones se utilizan para una variedad de aplicaciones; buscar instrumentos de small-angle neutron scattering (SANS), particularmente ésos con capacidades para muestras biológicas.
  2. Utilizar recursos proporcionados por las instalaciones del neutrón para ayudarlo a navegar el proceso de presentación de propuesta de neutrón viga tiempo. Consulte con un neutrón dispersión científico (NSS) que está asociado con el instrumento que se aplicará. Revisar la información actual de la instalación de neutrones sobre llamadas de propuesta, los plazos y asesoramiento para la presentación; para Oak Ridge está disponible en línea. 47 presentar la propuesta de tiempo Haz todas las pautas para una presentación exitosa.
  3. Si la proteína deuterada es (véase 2.2), servicios de dispersión de neutrones a menudo cuentan con laboratorios y experiencia dedicada a la producción de materiales deuterados. Para solicitar acceso a laboratorio Bio-grado de deuteración (BDL) en ORNL, seleccione el BDL como segundo instrumento en el sistema de propuesta. Mientras que la propuesta de SANS se repasa para la viabilidad y por un Comité de revisión científica, BDL solicitudes sólo se defienden para viabilidad. Para ayudar con la revisión de factibilidad BDL, presentar una información completa solicitud formulario48 que describe el protocolo de expresión de la proteína y el rendimiento estimado (disponible en línea).
  4. Después de la revisión exitosa de la propuesta de tiempo de la viga, confirmar la fecha adjudicada de tiempo Haz antes del experimento. Asegúrese de que todos los datos de muestra y tampón y fórmulas aparecen correctamente en la propuesta para la revisión adecuada. Cualquier cambio en el plan experimental propuesto, incluyendo cambios en la composición de la muestra y tampón, exigir la comunicación de la instalación.
    Nota: Discuten cambios con el NSS asignado tan pronto como sea posible.

2. determinar el neutrón contraste puntos de partido y el contraste necesario para la medición de la proteína

  1. Recopilar información (a partir de información de producto del proveedor, las bases de datos en línea, valores publicados, etc.) relacionados con composiciones atómicos y volúmenes de los componentes del sistema detergente ser comparados en contraste. Esta información se utiliza para determinar densidades de longitud de dispersión de neutrones (SLDs) y así contrastar puntos de partido (CMP) en solución, que es fundamental para obtener calidad sin datos y estructural la información para la proteína de membrana de interés en el contexto de una PDC. Una tabla que resume los puntos coincidencia físicos propiedades y contraste para detergentes comúnmente usados en estudios de biofísicos de proteínas de membrana es incluido (tabla 1).
  2. Determinar SLDs neutrón usando la aplicación web pajote: módulos para el análisis de contraste variación datos49 (en línea disponible50 libre de cargo). Un enlace al manual del usuario se encuentra en la página de inicio. Acceder al sitio web y leer la documentación que lo acompaña. Figura 1 y figura 2 brindar un panorama de contraste módulo entrada y salida para dos ejemplos relacionados.
    Nota: Otros sitios web para calcular SLDs está disponible, como el mantenido por el Instituto Nacional de estándares y tecnología (NIST) centro para la investigación del neutrón. 51
    1. Abra el módulo de contraste haciendo clic en 'Contraste' en el panel de navegación izquierdo. Proporciona texto para un proyecto de título y entrar en detalles a continuación para dos componentes (por ejemplo, detergente grupo cabeza y cola) como ' subunidad 1' y ' subunidad 2'.
    2. Escriba la fórmula molecular de cada componente en el cuadro de texto 'Fórmula'.
      Nota: el botón de radio am' debe seleccionarse bajo 'Tipo de sustancia' para escribir una fórmula molecular. Además, utilizar la letra 'X' en la fórmula para indicar los átomos de hidrógeno fácilmente intercambiables. Secuencias de proteínas, RNA o DNA pueden introducirse si la correspondiente 'P', 'R', o había ' botones de radio seleccionados. Existan múltiples copias de un componente dentro de la subunidad, el valor de 'Nmolecules' puede cambiar en consecuencia. Un ejemplo práctico aquí se refiere a lípido-como detergentes que contengan dos colas idénticas, permitiendo que la fórmula de una cola entrar con Nmolecules igual a 2.
    3. Ingrese el volumen en Angstroms cúbicos para cada componente en el cuadro debajo de "Volumen (Å3)". Utilizar la fórmula de Tanford28 para cadenas de longitud n, Vcola de alkyl = 27,4 + n * 26,9, calcular el volumen aproximado de la cola, u obtener volúmenes moleculares de información proporcionado o publicado valores en la literatura.
    4. Ingrese datos para los componentes del tampón. Cambiar «número disuelto especie en el solvente utilizando el menú desplegable para agregar o quitar filas para cada componente de amortiguamiento. En el caso de formación de micela detergentes, incluyen los monómeros detergentes gratis como componentes buffer separado en concentración micelar crítica del detergente (CMC).
    5. Haga clic en 'Enviar' para realizar los cálculos de contraste de neutrones y generar una página de resultados que proporciona una tabla de puntos de fósforo de dispersión longitud densidad y contraste, así como fórmulas para la determinación de estos parámetros en cualquier porcentaje de D2O en el búfer. Revisión de los parámetros de dispersión con especial atención a la CMP de componente. Si los puntos de fósforo son similares (dentro del 10% D2O) y la concentración micelar libre es baja, entonces la media CMP puede ser utilizado para emparejar contraste las contribuciones detergentes. En la mayoría de los casos, la CMP del detergente grupo cabeza y cola es diferente por más de 10-15%, produciendo un factor de forma de core-shell de los datos SANS que ofusca la recogida directa de la señal de dispersión de la proteína solamente.
  3. Evaluar el contraste entre detergente grupo cabeza y cola. Cuando el detergente principal grupo alkyl cadena cola y CMP no están bien emparejados, la disponibilidad y la incorporación de un detergente sustituidas a deuterio pueden permitir dispersión densidades de longitud de seleccionarlos componentes para ser manipulado. En la mayoría de los casos, esto requerirá formación de una micela mixta a través de la incorporación de un detergente idéntico con cadenas alquil sustituidos por deuterio. La adición de deuterio aumenta la densidad de longitud de dispersión del núcleo formado por las colas de cadena alkyl. El punto final deseado, en este caso, es tal que la cabeza del grupo shell CMP y núcleo de cadena alkyl CMP tienen aproximadamente valores iguales.
    1. Levante el CMP del núcleo micelar detergente para ser aproximadamente igual a la CMP de la cáscara de la cabeza del grupo mediante la determinación de la proporción adecuada de la mezcla entre h-colas y colas d que logra el contraste completo con los grupos de cabeza. Un requisito previo para esta determinación es de conocimiento de la CP/RP para una cola de cadena alquil sustituidos por deuterio. Una contraparte comercialmente disponible para n-Dodecyl β-D-maltoside (DDM) está disponible con todo hidrógeno de cadena alquil sustituido por deuterio (d25-DDM). Repita los cálculos de contraste se indica en el paso 2.1 para una cola había ' en lugar de la h-cola.
    2. Calcular el ratio molar de h-cola a cola d requerida para emparejar en contraste con el grupo de cabeza CMP. La siguiente fórmula puede ayudar con esta determinación:
      CMPcabeza = CMPh-cola * χh-cola + CMPd cola * χd cola
      donde CMP es la densidad de longitud de dispersión y χ es la fracción de volumen para el componente detergente cabeza, h-cola, o cola de d. Soluciones tampón de DDM, incorporación de 44% en peso (43% por topo) del detergente total como d25-DDM con cadenas alquil sustituidos por deuterio produce un solo CMP en 48,5% D2O para los componentes de la cabeza y cola.
  4. Considerar el grado de sustitución de deuterio para la proteína de la membrana. Para medir la señal de dispersión suficiente de la proteína, la CMP para la proteína debe ser al menos 15% D2O en la solución de detergente CMP y condiciones de medición. La señal aumenta con el cuadrado de esta diferencia de %. Desde el CMP de una proteína se produce típicamente ~ 42% D2O en solución (CMP similar a muchos grupos cabeza detergentes), etiquetado de deuterio de la proteína es casi siempre una necesidad. 52

3. expresar y purificar la proteína de membrana de interés

  1. Preparar medio LB (caldo de lisogenia) y crecer Escherichia coli (e. coli) células que un vector de expresión inducible de la secuencia de la proteína objetivo.
    1. Preparar los medios de comunicación mínima. En H2O o D2O, disolver tan 7.0 g/L (NH4)24, 5,25 g/L de Na2HPO4, 1,6 g/L de KH2PO4, 0.50 g/L del diamonio hidrógeno citrato, glicerol 5,0 g/L, 1,0 mL/L de 20% p/v MgSO 4·7H2O y 1,0 mL/L de metales traza de Holme (0.50 g/L CaCl2·2H2O, 0,098 contabilidad CoCl2, 0,102 g/L CuSO4, 16,7 g/L FECLAS3·6H2O, 0,114 g/L MnSO4· H2O, 22,3 g/L Na2EDTA·2H2O y 0,112 g/L ZnSO4· H2O). 53 , 54
    2. Preparar soluciones madre antibióticas apropiadas H2O o D2O.
    3. Prepare una solución Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido H2O o D2O.
    4. Estériles de filtro de todas las soluciones en secan, recipientes estériles con tapa de la botella de vacío y filtros con un tamaño de poro de 0,22 micras de la jeringuilla.
  2. Adaptar las células de e. coli antes medio marcado con deuterio de escalado para la sobreexpresión de una proteína deuterada.
    1. Inocular 3 mL de medio LB con una colonia aislada de una placa de agar caldo de lisogenia (LB) o células de un stock de glicerol congelados. Crecen las células a 37 ° C en un incubador de agitación a 250 RPM o reducir la temperatura a 30 ° C o por debajo para evitar el crecimiento excesivo de la cultura al incubar durante la noche.
      Nota: Se puede variar el procedimiento de adaptación. 55 , 56 , 57
    2. Una vez que la cultura LB ha crecido a una densidad óptica a 600 nm (OD600) de ~ 1, diluirlo 1:20 en 3 mL de medio mínimo de H2O y crecer a un OD600 de ~ 1. Repetir a la 1:20 las diluciones con medio mínimo con 50, 75 y 100% D2O (o hasta el porcentaje deseado de2O de D).
      Nota: se incrementa el contenido de2O como la D, las tasas de crecimiento disminuirán. La relación entre el porcentaje de2O de D en el crecimiento los medios de comunicación y deuterio la sustitución en la proteína se ha divulgado en la literatura. 58 , 59 , 60
    3. Seguir creciendo el cultivo en un biorreactor para aumentar el rendimiento de la masa celular deuterados (figura 3).
      Nota: Procedimientos para la operación del biorreactor han sido revisados en otros lugares. 61 , 62 , 63 , 64
  3. Cosecha y lyse las células de e. coli para la purificación de extracción y de la proteína de membrana
    1. Sedimenten las células por centrifugación a ~ 6.000 x g durante 30-45 min a 4 ° C.
    2. Suavizar el precipitado de células sumergiéndolos en buffer en hielo durante 30 minutos. Luego, suavemente Resuspender el precipitado de células en buffer transfiriendo suavemente con una pipeta serológica o suave balanceo en una mecedora 2D, para una concentración final de 1 ~ g líquido masa/10 mL de tampón.
      Nota: un búfer ejemplo es 50 mM HEPES (ácido de-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido 4), pH 7,5, 200 mM NaCl suplementado con una tableta de inhibidor de la proteasa.
    3. Lyse células resuspendidas con tres pasa por un homogeneizador de alta presión a 10.000 psi mientras se enfría el flujo de salida.
      Nota: Según la escala requerida, otros métodos de lisis pueden ser utilizado (por ejemplo, prensa francesa o sonicación).
    4. Pelotilla restos celulares por centrifugación a 5.000 ~ 4.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Repita este paso hasta que el sobrenadante se clarifica.
    5. Ultracentrífuga (~ 150.000 x g durante 30-45 min) al sobrenadante del paso anterior, que contiene el soluble y fracciones de la membrana. El pellet después de la ultracentrifugación contiene la fracción de membrana.
    6. Resuspender el precipitado de la membrana en un gran homogeneizador Dounce y aislar la fracción de membrana otra vez por ultracentrifugación (paso 3.3.5). Repita este paso por lo menos una vez para eliminar proteínas límite.
    7. Solubilizar las membranas por suave balanceo ~ 30 min a 4 ° C en un tampón que contiene detergente adecuado para la purificación. Solubilización es evidente cuando la suspensión se convierte de nublado en transparente. Eliminar el material insoluble por ultracentrifugación (~ 150.000 x g durante 30-45 min).
      Nota: Un búfer de ejemplo es de 50 mM HEPES, pH 7,5, 500 mM NaCl, imidazol de 20 mM y 4% (w/v) DDM para purificación por cromatografía de afinidad de Ni2 + .
  4. Purificar la proteína siguiendo un protocolo previamente desarrollado para las formas protonada.
    Nota: Véase Naing et al. , de un protocolo de purificación de ejemplo para un hexahistidine con la etiqueta M. marisnigri jumpers JR1 intramembranosas aspartil proteasa (d-MmIAP). El rendimiento final fue de 65 ~ 1 mg de deuterados de crecimiento 5 L deuterado de cultura celular, todo lo cual se utilizó en el experimento SANS (figura 4).
  5. Intercambio de la proteína purificada en el "Buffer Final de intercambio" para emparejar el contraste.
    1. Preparar 200 mL de "Buffer de intercambio Final" que contiene la mezcla correcta para contraste de coincidencia, por ejemplo,20 mM HEPES, pH 7,5, 250 mM de NaCl y 0.05% del total de DDM (0,028% DDM y 0.022% d25-DDM) en 49% D2O.
    2. Equilibrar una columna de exclusión de tamaño con > 2 columna volúmenes (CV) de "Buffer Final de intercambio" en 3.5.1 mediante un sistema rápido proteína líquida cromatografía (FPLC).
    3. Después de la inyección de la muestra, ejecute la columna y aislar fracciones correspondientes a la proteína de interés.
    4. Concentrado de la proteína a la concentración final deseada (2-5 mg/mL).
      Nota: Un volumen de ~ 300 μL es necesaria para llenar una cubeta de cuarzo cilíndricos de 1 mm utilizada para SANS.
    5. Una alícuota de búfer emparejado para SANS fondo de reserva.
      Nota: La alícuota puede tomarse directamente del buffer preparado, o idealmente de una fracción de elución limpio al final de la carrera FPLC.

4. hacer los preparativos finales para Haz tiempo y recoger sin datos

  1. Después de que la propuesta ha sido aceptada y ha sido aprobado el acceso al sitio, completar los entrenamiento antes de tiempo asignado de la viga. Esto incluye prearrival, así como laboratorio radiológico, in situ y formación específica para el instrumento de formación basada en web.
    Nota: Requisitos de formación puede dictar llegada de avance para los usuarios de primera vez. Más información está disponible en línea. 66
  2. Carga de muestras y buffer para recolección de datos.
    Nota: Un resumen de la dispersión de neutrones de ángulo pequeño biológica (Bio-SANS) área de medio ambiente muestra instrumento se muestra en la figura 5.
    1. Cargar las muestras y tampones en células del cuarzo. Celdas de cuarzo contáctese con el instrumento científico o instalación. Utilizar puntas de carga de gel a la abertura estrecha de la mayoría de las células de la muestra.
    2. Asegurarse de que se cierra el obturador de la viga, luego acercar al área de medio ambiente de la muestra y colocar las celdas de cuarzo en el cambiador de muestras. Registro de la posición del cambiador de muestra para cada celda de la muestra.
    3. Revise el área esté libre de obstrucción, la trayectoria de la viga entonces abandone el área de medio ambiente de la muestra y abra el obturador del haz.
      Nota: Cuidadosamente siga todas las normas de instalación regulaciones obedecer todos los posteos y escuchar consejos del científico del instrumento. Las muestras no pueden quitarse la viga y manipuladas después de la exposición a la viga sin precauciones especiales. Consulte con un técnico de Control radiológico (ECA) antes de estos procedimientos.
  3. Ejecutar escaneo de tabla para la recogida automatizada de datos
    1. Operar el instrumento a través del control personalizado software basado en LabVIEW, entorno de Control de instrumento espectrómetro (especia). Siga las instrucciones para la operación del equipo suministrado por el científico de la dispersión de neutrones. Un resumen de las ventanas de operación de exploración de tabla se proporciona en la figura 6.
    2. Después de ingresar la información requerida en las áreas apropiadas, escanear la tabla y se iniciará un proceso de recolección de datos. Monitorear el avance a través de la pestaña 'Table Scan Status'.

5. reducir sin datos de imagen 2D a 1D parcela

  1. Identificar cada archivo de datos de muestra y tampón de los números de exploración del grabado. Cada medición se asignará a un número único de exploración. Esta información es útil durante la reducción de datos para identificar cada muestra correspondiente y par de buffer.
  2. Software de MantidPlot y script en Python para la reducción de
    1. Los usuarios de dispersión de neutrones cuentan con información de la cuenta para acceder a sus datos en el clúster análisis remoto. 67 sesión en el clúster análisis remoto y ejecutar "MantidPlot" de la línea de comandos. Figura 7 y figura 8 se proporcionan para ayudar a estos pasos.
    2. Obtener una secuencia de comandos de usuario reducción de la dispersión de neutrones científico (esto ocurrirá normalmente durante el experimento); Este script está basado en Python y contiene la necesaria calibración y ajustes de escalas para reducir la imagen de dispersión 2D en una parcela de 1D de intensidades dispersas en función del ángulo de dispersión, I(Q).
    3. Abrir el Script de reducción proporcionada de usuario en MantidPlot y los correspondientes números de exploración o identificación de los pares de muestras y buffer en la lista correspondiente.
    4. Ejecutar el script para generar datos reducidos como un archivo de texto de cuatro columnas (columna orden es Q, I(Q), I(Q) error, Q error) en la ubicación especificada. Haga clic derecho en el espacio de trabajo adecuado en MantidPlot y seleccione "Parcela con errores..." para un examen inicial de los perfiles de dispersión.

6. analizar los datos para los parámetros estructurales de la partícula de la dispersión

  1. Transferir el archivo de datos reducidos de analysis server en un equipo local mediante la transferencia de archivos FTP seguro. Esto puede realizarse con el uso de software como FileZilla o CyberDuck. Instrucciones y los datos de conexión al sistema de archivos del servidor de análisis se proporcionan en la página de inicio de sesión de analysis.sns.gov.
  2. Descargar ATSAS software suite65,68 (suite ATSAS todo). 69 programas individuales70 también están disponibles en línea para el análisis de los datos SANS, es decir, determinación de parámetros estructurales y modelos ab initio .
    Nota: Muchas opciones están disponibles para SANS análisis de biomacromoléculas. 45
  3. Uso de PRIMUS71 para trazar datos, tampón escalamiento y resta y el análisis de Guinier.
    1. Lanzar el ATSAS 'Análisis de datos de SAS' aplicación y carga los datos reducidos los archivos correspondientes al par de la muestra y tampón.
      1. Para escalar el tampón correctamente, seleccione un rango de datos en alto Q (Q > 0.5 Å-1) donde ambos perfiles son similares y plana y pulse el botón de 'Escala' situado bajo las 'operaciones' ficha. Se aplicará un factor de escala en el búfer que estas dos regiones planas deben superponerse. PRECAUCIÓN: debe haber una razón física plausible que justifique la escala de la intensidad de amortiguación para que coincida con la muestra. Si la discrepancia es grande, consulte a un científico del instrumento para acercamientos válidos a fondo. 44 , 45 , 72
      2. Aumentar el rango de datos para ver todos los puntos. Haga clic en 'Restar' para realizar esta operación. Haga clic con el botón derecho el archivo de datos resta de búfer en la leyenda y guardar este archivo para posterior análisis. Figura 9 describe el uso de la pestaña de 'Operaciones'.
    2. Realizar un análisis de Guinier de los datos de la muestra resta buffer usando la pestaña de 'Análisis' de la aplicación de 'Análisis de datos de SAS'.
      1. Asegúrese de que el archivo correcto está seleccionado en la lista y haga clic en 'Radio de giro'. Intento automatizado para realizar un ajuste de Guinier se prestará haciendo clic en el botón 'Autorg'.
      2. Ampliar la gama de los datos utilizados incluyen todos los datos Q bajo y comenzar a reducir el rango de datos eliminando puntos de alta Q hasta el Qmáx * límite deg R está por debajo de 1.3. Utilice el diagrama de residuales para verificar que los datos son lineales en el rango de ajuste. Guinier ajuste produce un aproximado de Rg y0 para las partículas de dispersión.
      3. Hacer pequeños ajustes en la región de ajuste y monitoreo de sensibilidad de estos valores en el rango de datos utilizados en el ajuste. Figura 10A muestra el uso de la herramienta de 'Radio de giro'.
  4. Obtener la función de distribución de probabilidad (P(r)) en GNOM. 73 el archivo de salida generado aquí se utilizará como insumo para el ab initio modelado de proceso.
    1. Iniciar el Asistente de distribución de distancia dentro de la ficha de 'Análisis', obteniendo un buen ajuste a los datos es esencial para la obtención de un modelo de calidad. Para obtener más información sobre cómo obtener ajustes precisos, por favor vea el informe74 por Putnam, et al.
      Nota: programa el GNOM proporciona información adicional sobre el ajuste más allá del asistente de distribución de la distancia. Figura 10B se muestra el uso correcto de la herramienta de 'Distribución de distancia', y figura 11 ilustra algunos de los errores comunes encontrados.
    2. Determinar Dmax, la máxima distancia interatómicos dentro de la molécula.
      1. Estimar un valor para Dmax desmarcando la casilla de forzar Rmáx = 0 y entrar en un valor grande para Dmax (150 Å, por ejemplo). El primer x-intercepción en la parcela de reinicio rinde esta estimación.
      2. Realizar cambios incrementales en este valor Dmax y el rango de datos utilizados o el número de puntos utilizados en el ajuste para optimizar el GNOM ajuste a los datos y la curva resultante de reinicio.
    3. Seguir afinar el ajuste GNOM y guardar los archivos de salida GNOM con buen ajuste parámetros posterior ab initio pasos de modelado.
  5. Simular SANS perfiles desde modelos PDB de alta resolución utilizando el programa CRYSON. 75
    1. Abrir el programa y seleccione la opción '0'. Seleccione el nombre del archivo PDB en el explorador de archivos del popup. Pulse enter para aceptar la configuración predeterminada, excepto especificación cadena grado de deuteración fracciones y la fracción de D2O en el disolvente para alcanzar los parámetros de contraste adecuado.
    2. Ajustar el modelo a un conjunto de datos experimental por entrar en 'Y' y seleccionar el archivo de datos en el explorador de archivos del popup. Acepte los valores predeterminados restantes, y archivos de salida se escribirá en la ubicación del archivo de PDB. El archivo '.fit' contiene información para el perfil de dispersión predicha desde el modelo 3D de alta resolución.

7. crear los modelos Ab Initio de la SANS datos.

Nota: DAMMIF76 y77 dentro de la suite de software ATSAS de DAMMIN se utiliza para reconstruir modelos de átomo ficticio (presas) mediante un proceso de recocido simulado de lo GNOM de salida, que contiene datos de reinicio, o información acerca de la probabilidad o frecuencia de interatómicos distancias dentro de la partícula de la dispersión. Estos programas se pueden ejecutar en modo batch o en el servidor de web en línea ATSAS.

  1. Iniciar al asistente de forma PRIMUS desde el botón 'Dammif' en la pestaña de 'Análisis' de 'Análisis de datos de SAS' y utilizar una selección manual de los parámetros. La entrada para el asistente se ilustra en la figura 12.
    1. Definir el rango de Guinier de ajuste (paso 6.3.2) y proceder al paso siguiente utilizando los botones de navegación. Definir valores de ajuste de la parcela de reinicio (paso 6.4) y proceder al siguiente paso.
    2. Proporcionan parámetros para los ab initio modelado de proceso. Introduzca un prefijo para los nombres de salida modelo (por ejemplo, SANSEnvelope), seleccione cualquiera de los dos modelos de modo 'rápido' o 'slow', introduzca un valor para el número de modelos (17 recomendada para significación estadística), seleccione de las opciones disponibles para la simetría de la partícula, anisometry y escala angular (si se conoce). Asegúrese de que las cajas se comprueban a los modelos promedio con DAMAVER y refinan el modelo final con DAMMIN.
    3. Iniciar el proceso utilizando el botón 'confirmar'. Una vez finalizado el proceso, ver y guardar el directorio de trabajo.
      Nota: el proceso de modelado típico para una sola, pequeña proteína puede tomar hasta un par de horas con un ordenador personal típico. Los archivos se almacenan en directorios temporales hasta que guarda.
  2. Superposición y superponer la final sin envoltura con un modelo de alta resolución relacionado con SUPCOMB en ATSAS. Coloque una copia de la alta resolución modelo PDB para estar en forma a la envolvente SANS en el directorio de trabajo. Ejecute SUPCOMB desde la línea de comandos utilizando los nombres de archivo PDB como dos argumentos con la estructura de plantilla muestra en primer lugar: $ supcomb HiRes.pdb SANSEnvelope.pdb
    Nota: El segundo nombre de archivo enumerado se reescribe como un archivo nuevo con una "r" a las final y tener nuevas coordenadas para la superposición sobre la estructura de la plantilla.
  3. Visualizar los resultados del ab initio modelo con PyMOL (pymol.org), un programa de visualización de gráficos moleculares en 3D. Figura 13 proporciona una visión general de las operaciones de PyMOL.
    Nota: Existen pautas de publicación para modelado estructural de los datos de dispersión de ángulo pequeño de biomoléculas en solución. 78
    1. Lanzamiento de la aplicación de PyMOL y abrir los archivos .pdb correspondientes a 3D sin envolvente y la estructura de alta resolución SUPCOMB-alineado para ser visto.
    2. Visualizar la envoltura SANS al representar este modelo como una superficie. Haga clic en el ' botón situado junto a la modelo y seleccione ' Mostrar: como: superficie '.
    3. Visualizar la estructura de la columna vertebral de proteína alta resolución al representar este modelo como una caricatura. Seleccione el ' botón al lado de este modelo y seleccione ' Mostrar: como: dibujos animados '. Mostrar la cadena como un arco iris de N - al c-terminal seleccionando el botón 'C' y ' por la cadena: 'Chainbows.
    4. Modificar la transparencia de la representación superficial para mayor claridad. En la barra de menú de 'Configuración', seleccione ' transparencia» superficie» 40% '.
    5. Hacer el fondo blanco y no opaco. En la barra de menú 'Display', seleccione ' fondo»' y seleccione 'Opaco' que desmarcar esta opción y 'White' con motivo de este color para el fondo.
      Nota: operaciones adicionales y usos de PyMOL pueden encontrarse en PyMolWiki.org.

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Resultados

Una propuesta de instrumento y tiempo de viga debe transmitir claramente toda la información necesaria al Comité de revisión para que se puede hacer una evaluación válida del experimento propuesto. Comunicación con un NSS es altamente sugerido para usuarios inexpertos. El SNA puede evaluar viabilidad inicial y presentación de propuesta de guía para enfatizar el potencial para la ciencia de alto impacto, viabilidad y seguridad. La información proporcionada en la propuesta debe incluir info...

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Discusión

Investigadores de biología estructural, aprovechando técnicas estructurales complementarias como dispersión de la solución para obtener los datos bioquímicos y estructurales (tales como tamaño y forma) de biomoléculas en solución. SANS es una técnica particularmente atractiva para determinar estructuras de proteínas de membrana de baja resolución, un centro de atención de la moderna biología estructural y bioquímica. SANS requiere cantidades de proteínas purificadas comparables a las de los ensayos cristalográficos (1 mg...

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Divulgaciones

Los autores Volker S. urbano, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss y Ryan C. Oliver son contratados a través de UT-Battelle con nosotros DOE para apoyar el programa de usuario de ciencia de neutrones y Bio-sin instrumentos en el laboratorio nacional de Oak Ridge en este artículo.

Este manuscrito ha sido co-escrito por UT-Battelle, LLC, bajo contrato DE-AC05-00OR22725 con el nosotros Departamento de energía (DOE). El gobierno estadounidense mantiene y el editor, al aceptar el artículo para su publicación, reconoce que el gobierno estadounidense mantiene una licencia no exclusiva, liberada, irrevocable, en todo el mundo para publicar o reproducir el formulario publicado de este manuscrito o permitir otros a hacerlo, para fines del gobierno de Estados Unidos. DOE proporcionará acceso público a estos resultados de la investigación patrocinada por el gobierno federal según el Plan de acceso público DOE. 82

Agradecimientos

La oficina de biológicos y la investigación ambiental apoyan la investigación en el centro del ORNL para Biología Molecular estructural (CSMB) y Bio-SANS utilizando el apoyo de la división de instalaciones de usuario científica, oficina de ciencias básicas de energía, del Departamento de la energía. Trabajo estructural en las proteínas de membrana en el laboratorio de Lieberman ha sido apoyado por los NIH (DK091357, GM095638) y NSF (0845445).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Concentrador Amicon Ultra MWCO 50KDa EMD Millipore UFC905096material de laboratorio
Citrato de amonio dibásicoFisher ScientificA663componente medio
Sulfato de amonioEMD Millipore2150componente medio
Sistema de biorreactor Bioflo 310Equipo EppendorfM1287-2110
Cloruro de calcio dihidratadoAcros423525000componente medio
CarbenicillinaIBI ScientificIB02025antibiótico
CloranfenicolEMD Millipore3130antibiótico
Cloruro de cobalto (II)AcrosAC21413-0050componente medio
Sulfato de cobre (II)AcrosAC19771-1000 Componente medio
Óxido de deuterioSigma-Aldrich756822componente medio
Purificador de gas de drieritaW.A. Hammond Drierite Co. Ltd.27068
EDTA, disodio, dihidratoEMD Millipore4010componente medio
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3equipo
Ä purificador kta UPC100GE Healthcare equipo
GlicerolSigma-AldrichG5516componente medio
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR columnaGE Healthcare 
ImidazolVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Cloruro de hierro (III) hexahidratadoMP BiochemicalsICN19404590componente medio
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Sulfato de magnesio heptahidratadoVWR97062-134componente medio
Sulfato de manganeso (II) monohidratoAcrosAC20590-5000componente medio
MaxQ 6000 Agitador Incubado/RefrigeradoThermo ScientificSHKE6000-7 equipo
n-Dodecil-d25-β-D-maltopirranósidoAnatraceD310T
n-Dodecil-β-D-maltopirranósidoAnatraceD310A
Fosfato de potasio monobásicoVWR97062-346componente medio
Centrífuga RC 6 PlusEquipo Thermo Scientific Sorvall46910
Tabletas de cóctel de inhibidores de proteasa SIGMAFAST, Sin EDTASigma-AldrichS8830
Cloruro de sodioSigma-AldrichS3014
Hidróxido de sodioSigma-Aldrich795429
Fosfato de sodio dibásicoSigma-AldrichS7907componente medio
Filtro de jeringa estéril de 25 mm con 0.2µ m Membrana PESVWR28145-501 material delaboratorio
Filtro estéril desechable para botellas con 0.2µ m membrana PESThermo Scientific596-4520 Material de laboratorio
Superdex 200 10/300 GL GE Cuidado de la salud 
Columna Superose-12 10/300 GL GE Cuidado de la salud 
Ultrospec 10 Densímetro de celdas GEHealthcare 80211630equipo
Sulfato de zinc monohidratadoAcrosAC38980-2500 Componente medio
171167011751750117517301

Referencias

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