Artículo de método

Coincidencia de contraste detergente en Small-Angle Neutron Scattering experimentos para el análisis estructural de la proteína de membrana y modelado Ab Initio

DOI:

10.3791/57901

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21 de octubre de 2018

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1Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory, 2School of Chemistry and Biochemistry, Georgia Institute of Technology

En este artículo

Resumen

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Este protocolo muestra cómo obtener un modelo de baja resolución ab initio y detalles estructurales de una proteína de membrana de detergente solubilizado en solución mediante dispersión de neutrones de ángulo pequeño con coincidencia de contraste del detergente.

Resumen

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El instrumento de dispersión biológica small-angle neutron en el alto flujo isótopo Reactor de Oak Ridge National Laboratory se dedica a la investigación de materiales biológicos, biocombustible procesado y materiales Bioinspirados cubriendo nanómetro a escalas de la longitud del micrómetro. Los métodos presentados aquí para investigar las propiedades físicas (es decir, tamaño y forma) de proteínas de membrana (aquí, MmIAP, una intramembranosas aspartil proteasa de Methanoculleus marisnigri) en soluciones de formación de micelas son detergentes adecuado de este instrumento de dispersión de ángulo pequeño neutrón, entre otros. Otras técnicas de caracterización biofísica se ven obstaculizados por su incapacidad para abordar las contribuciones detergentes en una estructura compleja de proteína-detergente. Además, el acceso al laboratorio Bio-grado de deuteración ofrece capacidades únicas para la preparación de cultivos a gran escala y expresión de proteínas marcado con deuterio para mayor dispersión de la señal de la proteína. Mientras que esta técnica no proporciona los detalles estructurales en alta resolución, la brecha de conocimiento estructural de proteínas de la membrana contiene muchas zonas direccionables de investigación sin necesidad de resolución atómica cerca. Por ejemplo, estas áreas incluyen la determinación de los Estados, formación de complejos, cambios conformacionales durante la perturbación y eventos plegar/desplegar. Estas investigaciones se pueden lograr fácilmente a través de aplicaciones de este método.

Introducción

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Proteínas de membrana están codificadas por aproximadamente el 30% de todos los genes1 y representan una gran mayoría de objetivos de medicamentos modernos. 2 estas proteínas realizan una amplia gama de funciones celulares vitales,3 pero a pesar de su abundancia e importancia — sólo representan alrededor del 1% de estructuras total depositado en la investigación Collaboratory para bioinformática estructural (RCSB) proteína Banco de datos. 4 debido a su naturaleza parcialmente hidrofóbica, determinación estructural de proteínas de membrana-limite ha sido sumamente difícil. <....

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Protocolo

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1. preparar y presentar una propuesta de instrumento y neutrones instalación haz tiempo

  1. Consultar recursos en línea para identificar servicios de dispersión de neutrones que acceso usuario general neutrón viga tiempo, como laboratorio nacional de Oak Ridge (ORNL). Mapa de neutrón instalaciones e información sobre la investigación del neutrón en todo el mundo está disponible en línea. 46 ten en cuenta que estas instalaciones tienen convocatorias periódicas de propuestas; determina cuándo estará disponible la próxima vez haz. Neutrones se utilizan para una variedad de aplicaciones; buscar instrumentos de small-angle neutron scattering (....

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Resultados

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Una propuesta de instrumento y tiempo de viga debe transmitir claramente toda la información necesaria al Comité de revisión para que se puede hacer una evaluación válida del experimento propuesto. Comunicación con un NSS es altamente sugerido para usuarios inexpertos. El SNA puede evaluar viabilidad inicial y presentación de propuesta de guía para enfatizar el potencial para la ciencia de alto impacto, viabilidad y seguridad. La información proporcionada en la propuesta debe incluir info.......

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Discusión

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Investigadores de biología estructural, aprovechando técnicas estructurales complementarias como dispersión de la solución para obtener los datos bioquímicos y estructurales (tales como tamaño y forma) de biomoléculas en solución. SANS es una técnica particularmente atractiva para determinar estructuras de proteínas de membrana de baja resolución, un centro de atención de la moderna biología estructural y bioquímica. SANS requiere cantidades de proteínas purificadas comparables a las de los ensayos cristalográficos (1 mg.......

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Divulgaciones

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Los autores Volker S. urbano, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss y Ryan C. Oliver son contratados a través de UT-Battelle con nosotros DOE para apoyar el programa de usuario de ciencia de neutrones y Bio-sin instrumentos en el laboratorio nacional de Oak Ridge en este artículo.

Este manuscrito ha sido co-escrito por UT-Battelle, LLC, bajo contrato DE-AC05-00OR22725 con el nosotros Departamento de energía (DOE). El gobierno estadounidense mantiene y el editor, al aceptar el artículo para su publicación, reconoce que el gobierno estadounidense mantiene una licencia no exclusiva, liberada, irrevocable, en todo el mundo para publicar o reproducir el formulario publicado de este manuscrito o permitir otros a hacerlo, para fines del gobierno de Estados Unidos. DOE proporcionará acceso público a estos resultados de la investigación patrocinada por el gobierno federal según el Plan de acceso público DOE. 82

Agradecimientos

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La oficina de biológicos y la investigación ambiental apoyan la investigación en el centro del ORNL para Biología Molecular estructural (CSMB) y Bio-SANS utilizando el apoyo de la división de instalaciones de usuario científica, oficina de ciencias básicas de energía, del Departamento de la energía. Trabajo estructural en las proteínas de membrana en el laboratorio de Lieberman ha sido apoyado por los NIH (DK091357, GM095638) y NSF (0845445).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Concentrador Amicon Ultra MWCO 50KDa EMD Millipore UFC905096material de laboratorio
Citrato de amonio dibásicoFisher ScientificA663componente medio
Sulfato de amonioEMD Millipore2150componente medio
Sistema de biorreactor Bioflo 310Equipo EppendorfM1287-2110
Cloruro de calcio dihidratadoAcros423525000componente medio
CarbenicillinaIBI ScientificIB02025antibiótico
CloranfenicolEMD Millipore3130antibiótico
Cloruro de cobalto (II)AcrosAC21413-0050componente medio
Sulfato de cobre (II)AcrosAC19771-1000 Componente medio
Óxido de deuterioSigma-Aldrich756822componente medio
Purificador de gas de drieritaW.A. Hammond Drierite Co. Ltd.27068
EDTA, disodio, dihidratoEMD Millipore4010componente medio
Emulsiflex-C3AvestinEF-C3equipo
Ä purificador kta UPC100GE Healthcare equipo
GlicerolSigma-AldrichG5516componente medio
HEPESSigma-AldrichH4034
HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR columnaGE Healthcare 
ImidazolVWR97064-622
IPTGTeknovaI3325
Cloruro de hierro (III) hexahidratadoMP BiochemicalsICN19404590componente medio
LB Agar MillerFisher ScientificBP1425-2
Sulfato de magnesio heptahidratadoVWR97062-134componente medio
Sulfato de manganeso (II) monohidratoAcrosAC20590-5000componente medio
MaxQ 6000 Agitador Incubado/RefrigeradoThermo ScientificSHKE6000-7 equipo
n-Dodecil-d25-β-D-maltopirranósidoAnatraceD310T
n-Dodecil-β-D-maltopirranósidoAnatraceD310A
Fosfato de potasio monobásicoVWR97062-346componente medio
Centrífuga RC 6 PlusEquipo Thermo Scientific Sorvall46910
Tabletas de cóctel de inhibidores de proteasa SIGMAFAST, Sin EDTASigma-AldrichS8830
Cloruro de sodioSigma-AldrichS3014
Hidróxido de sodioSigma-Aldrich795429
Fosfato de sodio dibásicoSigma-AldrichS7907componente medio
Filtro de jeringa estéril de 25 mm con 0.2µ m Membrana PESVWR28145-501 material delaboratorio
Filtro estéril desechable para botellas con 0.2µ m membrana PESThermo Scientific596-4520 Material de laboratorio
Superdex 200 10/300 GL GE Cuidado de la salud 
Columna Superose-12 10/300 GL GE Cuidado de la salud 
Ultrospec 10 Densímetro de celdas GEHealthcare 80211630equipo
Sulfato de zinc monohidratadoAcrosAC38980-2500 Componente medio
171167011751750117517301

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wallin, E., Heijne, G. V. Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms. Protein Science. 7 (4), 1029-1038 (1998).
  2. Tautermann, C. S. GPCR struc....

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