Artículo de método

Producción y visualización de Esferoplastos bacterianos y protoplastos para caracterizar la localización de péptido antimicrobiano

DOI:

10.3791/57904

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11 de agosto de 2018

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1Biochemistry Program, Wellesley College, 2Department of Chemistry, Wellesley College, 3Department of Biological Sciences, Wellesley College

En este artículo

Resumen

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Aquí presentamos un protocolo para producir Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) Esferoplastos y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) protoplastos claramente visualizar y caracterizar rápidamente interacciones de péptido-bacterias. Esto proporciona un método sistemático para definir la localización de la membrana translocación de péptidos.

Resumen

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Comúnmente, el uso de microscopia confocal como un método para determinar patrones de localización de péptidos dentro de las bacterias es inhibido por los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales. Como la resolución de un microscopio dado no puede ser fácilmente mejorada, presentamos protocolos para transformar la pequeña barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) en formas esféricas más grandes, fácilmente reflejadas llaman esferoplastos o protoplastos. Esta transformación permite observadores a rápidamente y claramente determinar si péptidos se alojan en la membrana bacteriana (es decir, localización de membrana) o cruzan la membrana para entrar en la célula (es decir, translocación). Con este enfoque, también presentamos un método sistemático para caracterizar péptidos como membrana de localización o translocación. Si bien este método puede utilizarse para una variedad de péptidos activos de membrana y cepas bacterianas, demostramos la utilidad de este protocolo mediante la observación de la interacción de Buforin II P11A (BF2 P11A), un péptido antimicrobiano (AMP), con e. coli Esferoplastos y protoplastos B. megaterium .

Introducción

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Péptidos antimicrobianos (AMPs) han obtenido la atención debido a su uso potencial como alternativas a los antibióticos convencionales1,2,3,4,5. Amperios de matan bacterias por translocación a través de la membrana celular e interactuando con componentes intracelulares tales como ácidos nucleicos o por permeabilizing la membrana causando fugas de contenido de la célula6. Además de su uso como antibióticos, translocación amperios puede ser adaptado para solicitudes de entrega de medicamentos porque no disruptiva puede cruzar la membrana celular impermeable7,8. Por lo tanto, buscamos comprender los mecanismos fundamentales de la AMP de acción para sentar las bases para su uso en el diseño de fármacos.

La microscopia confocal ofrece una manera para determinar patrones de localización de fluorescencia etiquetadas amperios en células bacterianas proporcionando penetraciones en su mecanismo de acción9,10,11,12, 13 , 14. al etiquetado de la membrana de las bacterias, uno puede determinar si un péptido fluorescente etiquetado localiza a la membrana o en el espacio intracelular de una célula bacteriana. Sin embargo, esta técnica está limitada por el pequeño tamaño y barra de forma de bacterias, que puede hacer difícil debido a los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales y la orientación variable de las bacterias en la diapositiva15la proyección de imagen.

El objetivo del método presentado es mejorar la visualización de los patrones de localización de péptido fluorescente etiquetado usando microscopia confocal. Visualización se ha mejorado el pequeños, finos, barra-formado Gram-negativos Escherichia coli (e. coli) y gram-positivas Bacillus megaterium (B. megaterium) bacterias en formas de agrandamiento, esféricas conocido como Esferoplastos (para las cepas Gram negativas) y protoplastos (para cepas Gram-positivas)16,17,18,19,20,21. Esferoplastos y protoplastos son más fáciles de imagen debido a su mayor tamaño y su forma simétrica, lo que hace irrelevante para la proyección de imagen de la orientación de una bacteria sobre un portaobjetos. Además, presentamos un enfoque sistemático para analizar cuantitativamente datos de microscopia confocal para caracterizar amperios como cualquier membrana de localización o translocación. Aplicación de estos métodos resulta más fácil distinguir marcada fluorescencia patrones de localización de péptido. Los protocolos aquí presentados pueden utilizarse para evaluar la localización de una variedad de agentes activos de membrana distintos amplificadores, incluyendo péptidos de penetración celular.

Una clara ventaja de esta técnica es que proporciona penetraciones en el mecanismo de acción de amp a nivel unicelular, que puede revelar la heterogeneidad celular de la célula15, frente a otros ensayos de fluorescencia se utiliza comúnmente para identificar la mecanismos de acción de amperios, que sólo proporcionan a granel estimaciones9,22,23,24,25. El uso de Esferoplastos y protoplastos para evaluar la entrada de amplificador celular es útil particular26 porque son más fisiológico relevantes15 que otros modelos utilizados para evaluar la entrada de la célula, como lípido vesículas24.

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Protocolo

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1. preparación de la solución

Nota: Preparar soluciones que se describe en los pasos 1.1 – 1.9 y 1.8, 1.11 para la producción de Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos, respectivamente.

  1. Preparar 1 M Tris-Cl, pH 7.8 disolviendo 10,34 g Tris HCl y 4,17 g de Tris OH en 50 mL de dH2O en un matraz de 125 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  2. Preparar la solución A (20 mM MgCl2, 0.7 M sacarosa, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) disolver 0,10 g de MgCl2 (95.2 g/mol) y 11,98 g sacarosa (342.3 g/mol) en 25 mL dH2O en un matraz de mL 125. Añadir 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) y ajustar el volumen a 50 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  3. Preparar la solución B (10 mM de MgCl2, sacarosa de 0,8 M, 10 mM Tris-Cl, pH 7.8) disolviendo 0.05 g de MgCl2 (95.2 g/mol) y 13,69 g sacarosa (342.3 g/mol) en 25 mL dH2O en un matraz de mL 125. Añadir 500 μL 1 M Tris-Cl (pH 7.8) y ajustar el volumen a 50 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  4. Preparar 0,8 M sacarosa sacarosa g 13,69 (342.3 g/mol) en 50 mL dH2O en un matraz 125 de mL de disolución. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  5. Preparar desoxirribonucleasa de 5 mg/mL me (DNasa I) disolviendo 0,015 g DNasa I en 3 mL de dH2O en un matraz de 50 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2. Solución de alícuota en tubos de microcentrífuga y almacenar a-20 ° C.
  6. Preparar 0,125 M ácido etilendiaminotetracético (EDTA), pH 8.0 mediante la disolución de EDTA disódico 0,698 g deshidratar (372.2 g/mol) en 15 mL dH2O en un matraz de 125 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  7. Preparar 600 cefalexina μg/mL de disolución 0,03 g de hidrato de cefalexina (365.404 g/mol) en 50 mL de dH2O en un matraz de 125 mL. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a 4 ° C.
  8. Preparar la lisozima 5 mg/mL lisozima 0,015 g en 3 mL de dH2O en un matraz de 50 mL de disolución. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2. Solución de alícuota en tubos de microcentrífuga y almacenar a-20 ° C.
  9. Preparar 3% w/v caldo de soya tripticasa (TSB) disolviendo 30 g de TSB en 1 L de dH2O en un matraz de 2 L. Parte alícuota de la solución en frascos que contienen 25 mL o 100 mL TSB para ser utilizado en la preparación de e. coli esferoplastos o B. megaterium protoplastos, respectivamente. Frascos de autoclave para esterilizar el medio líquido. TSB estéril puede almacenarse a temperatura ambiente o a 4 ° C.
  10. Preparar la solución C (1 M sacarosa, maleato de 0,04 M, 0,04 M de MgCl2, pH 6,5) 34,23 g sacarosa (342.3 g/mol), 0,46 g ácido maleico (116.07 g/mol) y 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) en 100 mL de dH2O en un matraz de 250 mL de disolución. Ajustar el pH a 6.5. Esterilizar por filtración a través de un filtro de jeringa de 25 mm con una membrana μm 0.2 y guardar en un tubo cónico a temperatura ambiente.
  11. Preparar medio de protoplasto de 200 mL por 100 mL 3% w/v TSB y 100 mL de solución C en una botella de vidrio de 1 L de mezcla. Autoclave para esterilizar la solución y almacenar a temperatura ambiente.

2. preparación de la cultura durante la noche

Nota: Realice las secciones 2-4 utilizando técnicas estériles adecuadas. Si lo desea, una cepa bacteriana puede contener un plásmido de resistencia a los antibióticos reducir la contaminación potencial. Si se utiliza una cepa con resistencia a los antibióticos, añadir los antibióticos necesarios en los pasos 2.1, 3.1, 3.2 y 4.1-4.4.

  1. Preparar una cultura de la noche a la mañana escogiendo una sola Colonia de bacterias utilizando una pipeta estéril y colocar en un tubo de cultivo de 14 mL con 2 – 3 mL de 3% w/v TSB. Incubar a 37 ° C, agitando de 16 a 21 h.

3. preparación de bacterias Gram negativas e. coli Esferoplastos

  1. En un matraz de 250 mL, diluir la cultura durante la noche 1: 100 en volumen de 25 mL de 3% w/v TSB e incubar la solución bacteriana a 37 ° C, agitando durante aproximadamente 2,5 horas hasta que la solución ha alcanzado una densidad óptica de 0.5 – 0.8 a 600 nm. Medir la densidad óptica usando un espectrofotómetro.
  2. En un matraz de 250 mL, diluir esta cultura 1:10 en 30 mL de 3% w/v TSB e incubar a 37 ° C, agitando durante 2,5 h en presencia de 60 cefalexina μg/mL (347.4 g/mol) para producir filamentos unicelulares de unos 50-150 μm de longitud , que son observables bajo 1.000 aumentos utilizando un microscopio de luz (figura 1B).
  3. Recoger los filamentos por centrifugación de la solución bacteriana a 1.500 x g, 4 ° C por 4 minutos, decantar y desechar el sobrenadante, el sedimento para realizar.
  4. Lave los filamentos suavemente añadir 1 mL de sacarosa de 0,8 M, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Incubar durante 1 min y luego descartar el sobrenadante sin perturbar el pellet.
  5. Añadir 150 μL de 1 M Tris-Cl (pH 7.8), 120 μl de lisozima de 5 mg/mL, 30 μl de 5 mg/mL de DNasa I y 120 μl de EDTA de 0,125 M en sus respectivos fin el perdigón e incubar la solución a temperatura ambiente durante 10 minutos.
  6. Añadir 1 mL de solución A poco a poco más de 1 minuto a la solución preparada en 3.5 utilizando una micropipeta mientras que suavemente girando a mano la solución. Incubar la solución durante 4 min a temperatura ambiente.
  7. Colocar 7 mL de solución B de 4 º C en dos tubos cónicos de 15 mL. Añadir cantidades iguales de la solución preparada en 3.6 a cada uno de estos dos tubos. Centrifugue la solución a 1.500 x g, 4 ° C por 4 minutos.
  8. Con una pipeta serológica, retire con cuidado todo pero 1–2 mL de sobrenadante sin perturbar el pellet. Resuspender el precipitado mediante pipeteo suavemente arriba y abajo utilizando una micropipeta P1000. Visualmente Compruebe formación de Esferoplastos, observando la muestra a 1.000 aumentos utilizando un microscopio de luz (figura 1).
  9. Almacenar los Esferoplastos a-20 ° C hasta una semana o hasta que han pasado por 3 ciclos de congelación y descongelación.

4. preparación de protoplastos Gram-positiva B. megaterium

  1. En un matraz de 250 mL, diluir la noche cultura 1:1,000 en 100 mL de 3% w/v TSB e incubar la solución bacteriana a 37 ° C, agitando para aproximadamente 4.5 h hasta que la solución ha alcanzado una densidad óptica de 0.9–1.0 a 600 nm. Medir la densidad óptica usando un espectrofotómetro.
  2. Vierta el cultivo líquido en dos tubos cónicos de 50 mL y centrifugar a 2.000 x g, 4 º C durante 10 minutos.
  3. Con una pipeta serológica, deseche el sobrenadante de los tubos cónicos. Resuspender cada precipitado en medio del protoplasto de 2,5 mL y combinar las soluciones resuspendidas en un solo tubo cónico. Pipetear la solución combinada de resuspendidos en un matraz de 125 mL.
  4. Añadir 1 mL de lisozima de 5 mg/mL e incubar 1 h a 37 ° C, agitando.
  5. Vigilar el crecimiento de protoplastos bajo 1.000 aumentos utilizando un microscopio de luz, tomando nota de cualquier irregularidad, tales como bacterias que aparecen como hinchadas barras en lugar de esferas (figura 2). Mediante una pipeta serológica, transferir la solución a un tubo cónico de 15 mL y centrifugar a 2.000 x g, 4 º C durante 10 minutos.
  6. Decantar el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en medios del protoplasto de 5 mL. Almacenar protoplastos a-20 ° C hasta una semana o hasta que han pasado por 3 ciclos de congelación y descongelación.

5. preparación de la solución del péptido y tinte de membrana para la proyección de imagen

  1. Solución de péptido
    1. En un tubo de microcentrífuga envuelto en papel de aluminio, disolver 2 mg de FITC etiquetado BF2 P11A en 800 μl de dH2O. uso un péptido que contiene al menos un residuo de triptófano para llevar a cabo las mediciones de concentración de proteína.
    2. Espectrofotómetro, medir la absorbancia de la solución del péptido a 280 nm por triplicado. Calcular la concentración de péptido utilizando el coeficiente de extinción molar para el triptófano (5.700/Mcm).
    3. Diluir la concentración de péptido en dH2O a una concentración final de 100 – 200 μm. Almacene en un tubo de microcentrífuga a-20 ° C envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz.
  2. Tinte de membrana
    1. En un tubo de microcentrífuga, preparar un stock de 10 mM de di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) disolviendo 5 mg de di-8-ANEPPS en 843.3 μl de DMSO. Almacenar a 4 ° C envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz.
    2. En un tubo de microcentrífuga, preparar 1 mL de 0,03 mM di-8-ANEPPS por agregar 3 μl de 10 mM di-8-ANEPPS a 997 de μl DMSO. Almacenar en un tubo de microcentrífuga a 4 ° C envuelto en papel de aluminio para proteger de la luz.

6. visualización de Esferoplastos de e. coli y B. megaterium protoplastos usando microscopia Confocal

  1. Pipeta de 5 μl de esferoplastos o protoplastos en un portaobjetos de vidrio recubiertos de poli-l-lisina. Añadir 2 μl de FITC etiquetado AMP (100-200 μm) a la diapositiva e incubar 3 minutos protegido de la luz.
  2. Añadir 1 μl de la membrana tinte di-8-ANEPPS (0,03 mM) a la diapositiva e incubar 3 minutos protegido de la luz. Cubrir con un cubreobjetos de vidrio y sellarlo con el esmalte de uñas.
  3. Encienda el láser confocal microscopio y argón. Ajustar el láser de argón a la salida de energía de 20% y 20% de transmisión.
  4. Establecer rangos de longitud de onda de emisión de 499-532 nm y 670-745 nm para el canal de emisión del péptido marcado con FITC y membrana di 8-ANEPPS-marcado con tinte emisión canal, respectivamente.
  5. Protoplastos de imagen o Esferoplastos (figura 1 y figura 2) con el objetivo X 63. Utilizar software tratamiento de imágenes para obtener 8 bits, imágenes de 512 x 512 compuesto z-stack compuesto de 0,5 μm rebanadas de la totalidad del spheroplast o protoplasto.
    Nota: Tomar consideración cuidadosa para reducir la emisión de repintado y protoplastos y Esferoplastos. Véase para más detalles.

7. Caracterización de la localización de la AMP

  1. Abre la imagen compuesta z-stack en software de imágenes. Localizar el centro más segmento del spheroplast o protoplasto y coloque una región circular de interés (ROI) (0,3 μm de diámetro) en la membrana (ROI 1) uno en el centro del spheroplast o protoplasto (ROI 2) y uno del spheroplast o protoplasto a medida la fluorescencia del fondo (ROI 3) (figura 5). Evitar la inclusión de píxeles saturados. La intensidad de fluorescencia en cada retorno de la inversión puede ser calculada por el software de imágenes.
    Nota: En casos cuando el péptido no localizar a la totalidad de la membrana, dibujar 1 retorno de la inversión en un área de la membrana donde se localiza el péptido.
  2. Utilice la siguiente ecuación para determinar la relación entre intensidad de fluorescencia intracelular del péptido a la intensidad de fluorescencia de péptido de membrana:
    figure-protocol-1
    Nota: La intensidad de fluorescencia en retorno de la inversión 3 se resta de intensidades de fluorescencia en retorno de la inversión 2 y 1 de retorno de la inversión para explicar la fluorescencia de fondo.

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Resultados

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Por ampliación de bacterias y haciéndolos esférico, fácilmente podemos distinguir péptidos localización a la membrana bacteriana o translocan fácilmente a través de la membrana bacteriana. Los límites de resolución de los microscopios de luz convencionales hacen difícil para distinguir si el péptido señal se presenta de la membrana o espacio intracelular de las bacterias normales porque aparecerán las señales localizadas en la membrana se superponen a la espacio intracelular (

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Discusión

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Los protocolos aquí presentados hacen posible para los investigadores a obtener más rápidamente más grandes tamaños de muestra de imágenes bacterianas porque las bacterias ampliadas, esféricas son mucho más fáciles de ubicar, orientar y la imagen. Esta mayor capacidad para recopilar datos es valiosa en varios aspectos. En primer lugar, permite un análisis cuantitativo más sistemático de los patrones de localización de péptido. Mientras las tendencias cualitativas pueden demostrarse de pequeñas series de imágenes, muestra...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No se declaran conflictos de interés.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de alergias y enfermedades infecciosas (NIH-NIAID) Premio R15AI079685.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Hidrocloruro de Trizma (Tris HCl)SigmaT3253
Base de Trizma (Tris OH)SigmaT1503
Cloruro de magnesioSigmaM8266
SacarosaSigmaS7903
LisozimaSigmaL6876
Desoxirribonucleasa ISigmaD4527
Ácido etilendiaminotetraacéticoSigma 106361utilizó Sigma 106361 en el desarrollo del protocolo original; 106361 descontinuado con ED2SS como reemplazo
Hidrato de cefalexinaSigmaC4895
AmpicilinaFisher ScientificBP1760
BBL Caldo de soja tripticasaFisher ScientificB11768
BF2 P11A FITCNeoScientificPedido
di-8-ANEPPSBiotium61012
DMSOSigma34869Usado Sigma D8779 en el desarrollo del protocolo original; D8779 descontinuado con 34869 como reemplazo
Ácido maleicoSigmaM0375
Acrodisc 25 mm Filtro de jeringa con 0.2 μ m HT Tuffryn MembranePall Corporation4192
Microscopio confocal de barrido láserLeica MicrosystemsTCS SP5 IIPara la adquisición de imágenes
Leica Application Suite, fluorescencia avanzadaLeica MicrosystemsPara el procesamiento de imágenes
a medida

Referencias

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