Protocolo fácil para la síntesis de uno mismo-montaje base poliamina péptido Anfífilos (PPAs) y relacionados con biomateriales

Summary

La síntesis del péptido base poliamina Anfífilos (PPA) es un reto importante debido a la presencia de múltiples nitrógenos de Amina, que requiere un uso juicioso de la protección de los grupos para enmascarar estas funcionalidades reactivas. En este papel, describimos un método fácil para la preparación de estas nueva clase de moléculas de uno mismo-montaje.

Abstract

Base poliamina péptido Anfífilos (PPA) son una nueva clase de uno mismo-montaje anfifílicas biomateriales relacionadas con el péptido Anfífilos (PAs). Tradicionales PAs poseen aminoácidos cargados como grupos (lisina, arginina), que están conectados directamente a un segmento de lípidos o pueden contener una región vinculador de los aminoácidos neutros de solubilización. Ajuste de la secuencia del péptido de PAs puede producir diversas morfologías. Asimismo, los PPA poseen un segmento hidrofóbico y aminoácidos neutros, pero también contienen poliamina moléculas como el agua (hidrofílicos) grupos de solubilización. Como es el caso de PAs, PPA también pueden uno mismo-montar en diversas morfologías, incluyendo barras pequeñas, trenzados cintas de nano y fundidas hojas de nano, cuando está disuelto en agua. Sin embargo, la presencia de aminas primarias y secundarias en una molécula de poliamina solo plantea un desafío significativo al sintetizar los PPA. En este documento, se muestra un protocolo simple, basado en precedentes de la literatura, para lograr una síntesis fácil de PPA usando síntesis peptídica en fase sólida (SPPS). Este protocolo puede ampliarse a la síntesis de PAs y otros sistemas similares. También ilustran los pasos que son necesarios para el escote de la resina, la identificación y la purificación.

Introduction

Anfífilos peptide uno mismo-montaje (PAs) son una clase de biomateriales, normalmente conformada de los siguientes segmentos: jefe (a) hidrofílico, (b) vinculador región y cola (c) hidrofóbica. PAs la mayoría descritos en la literatura poseen una cabeza hidrofílica compuesta por aminoácidos cargados o polares residuos^1,2,3,4. PAs han encontrado una amplia gama de aplicaciones en biomedicina, incluyendo el suministro de medicamentos, diagnóstico de la enfermedad, medicina regenerativa, etc.⁵. De acuerdo con su secuencia de aminoácidos, PAs puede formar una variedad amplia de nanoestructuras como micelas esféricas, nano-filamentos. Recientemente hemos reportado una clase de híbrido péptido base poliamina Anfífilos, denominado PPA⁶. Las morfologías, cinética de la uno mismo-montaje y degradación metabólica, de estos biomateriales, fueron encontrados para ser relacionado con su grupo de cabeza solubilización. Por otra parte, las nanoestructuras de PPA no mostraron toxicidad hacia células de mamífero (líneas MiaPaCa2 y HeLa de la célula) en las concentraciones probadas. Nanocarriers basados en PPA son vehículos de fármaco atractivo porque: poliaminas (1) absorción y metabolismo se ha demostrado para ser aumentada en las células cancerosas, nanoestructuras (2) catiónico pueden lograr endosomal escape^7,8, que conduce a mayor circulación y residencia dentro de una célula y (3) deben tener un perfil metabólico distinto en comparación con PA; por ejemplo, será más estables a las proteasas que se encuentran en el cuerpo humano (aunque ellos tal vez sensibles a otras enzimas, como oxidasas amina)^9,10. Además, los PPA se han encontrado diversas morfologías, propiedades fisicoquímicas, rigidez de nanopartículas y cinética de montaje dependiendo de la longitud y la carga de cada molécula de PPA⁶. Adjunto, describimos un protocolo detallado de síntesis, identificación y purificación de los PPA que puede aplicarse también a la preparación de PAs o moléculas de péptidos híbridos similares.

Porque poliaminas no están comúnmente disponibles en el mercado en sus formas protegidas y porque proteger las aminas primarias y secundarias de poliaminas es de suma importancia para conjugar con los aminoácidos y otras moléculas, hemos descrito el medidas sintéticas para lograr su protección. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método simple para conjugar poliaminas a aminoácidos. Poliaminas carecen de un grupo carboxílico; por lo tanto, no puede acoplarse a pista de amida o resinas de Wang. En cambio, resinas como el cloruro de 2-chlorotrityl se recomiendan el protocolo sintético. El desafío principal para la síntesis de la PPA es la presencia de grupos funcionales de aminas primarias y secundarias. Para nuestros propósitos, hemos protegido todas las aminas secundarias de la poliamina manteniendo el grupo amino primario de la poliamina libre permitir la reacción de acoplamiento. La reacción se realizó sobre un soporte sólido siguiendo los principios de síntesis de péptidos de fase sólida (SPPS) para facilitar el trabajo después de cada etapa de acoplamiento y desprotección. El protocolo siguiente es para la síntesis manual y automatizada de PPAs (aunque la verificación de algunos pasos será difícil en un sistema automatizado). La síntesis de estas moléculas puede también ser realizada en un sintetizador automático o con la ayuda de un reactor de microondas (automático o semiautomático). El esquema de la reacción ha sido resumido en la figura 1.

Figura 1: (A) A esquema general de la reacción para la síntesis de los PPA. Poliaminas representante (B) que pueden utilizarse para sintetizan PPAs se describe aquí. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. general protocolo para síntesis de PPA

1. Calcular la escala de síntesis (generalmente mmol). Esta escala se basa en la masa de la cantidad de PPA de destino. Tenga en cuenta que la eficiencia de la reacción de SPPS gradualmente disminuye con un aumento de la secuencia de aminoácidos. Por lo tanto, la eficiencia de la reacción exacta es difícil de calcular.
2. Calcular el peso de la resina que se utiliza según la carga de la resina. La carga se encuentra en el contenedor o el protocolo de análisis de la resina y expresada en mmol/g. Puede utilizarse la siguiente fórmula para calcular el peso de la resina:
3. Cuidadosamente pesar resina del cloruro de 2-chlorotrityl (en nuestro caso la carga es ~0.85 mmol)
4. Colocar la resina en un recipiente de sinterizado síntesis con las siguientes especificaciones: capacidad: 50 mL, Fritted Disc – 25 mm, porosidad – medio.
5. Añadir 15 mL de diclorometano (DCM) a la resina.
6. Coloque el recipiente de la síntesis de un agitador mecánico de velocidad variable (frasco agitador/agitador) y gire los vasos a un ángulo de 45° (u horizontalmente) para maximizar la agitación.
7. Permitir que los granos de la resina se hinche durante 15 minutos hinchazón mejora el rendimiento de la reacción ya que facilita la difusión molecular y la accesibilidad al sitio activo, mejora de la eficiencia de acoplamiento.
8. Añadir 8 equivalentes (2 mmol de escala 0.25 mmol) de la deseada poliaminas (espermina, espermidina, Diethyelenetriamine, diaminopropane 1, 3, etc.) a la resina y dejarlo reaccionar durante 5 h.
   Nota: Un menor período de reacción reduciría el rendimiento.
9. Un Kaiser de prueba (véase Tabla de materiales) para confirmar el exitoso acoplamiento de la poliamina a la resina. Exitoso acoplamiento de las aminas primarias produce un color violeta/azul, que corresponde a la amina libre.
10. Proteger el grupo de la amina primaria utilizando 4 equivalentes de 1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)ethyl (Dde), disueltos en metanol anhidro (15 mL), agitando la mezcla de reacción durante la noche¹¹.
    Nota: Un menor tiempo de reacción reduce el rendimiento.
11. Realice una prueba de Kaiser. La ausencia de color azul de la perla de resina confirma protección acertada. En caso de protección de la amina primaria, repita el paso anterior.
12. El DCM de drenaje y lave las resinas dos veces con una mezcla de DCM y DMF (2:1, 15 mL).
13. Disolver 20 equivalentes (5 mmol) de di-terc butil di-carbonato (Boc) en DCM (20 mL) y permitir la reacción proceder durante 3 horas.
14. Hacer un cloranilo (véase Tabla de materiales) de prueba para confirmar la protección completa de la amina secundaria. Una prueba positiva (protección) produce un color amarillo claro o incoloro. Aminas secundarias gratis dan un color verde/azul oscuro, mientras que aminas primarias dan un color rojo.
15. Escurrir la mezcla solvente y lavar dos veces con una mezcla de DCM y DMF (2:1, 15 mL).
16. Añadir una solución al 2% de hidracina en DMF (10 mL) y agitar durante 1 hora.
17. Hacer la prueba para confirmar éxito desprotección de la amina primaria un Kaiser.
18. Añadir el deseado aminoácidos en la secuencia inversa en el cual usted escribir o dibujarles. Péptidos son atraídos desde el termini N a la termini C pero se sintetizan en la dirección opuesta, C y N. Por ejemplo, para un PPA que requieren el siguiente péptido base - GLFD-, añadir el ácido aspártico (D), seguido de fenilalanina (F), leucina (L) y finalmente glicina (G).
    Nota: Para la mayoría de los aminoácidos, el siguiente Cóctel de acoplamiento es apropiado para la fijación en las resinas poliaminas cargado.
    1. Mezclar 4 equivalentes (1 mmol) de los aminoácidos Fmoc-protegido, 3,95 equivalentes de 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) y 15 equivalente de Amina diisopropylethyl (DIPEA).
    2. Disolver en una mezcla de DCM y DMF (1:1, 15 mL) y someter a ultrasonidos el cóctel por 2 min (hasta disolución completa).
    3. Espere un min de 3 a 5 adicional para asegurar la activación de los ácidos carboxílicos en el aminoácido.
    4. Añadir la mezcla de reacción a la embarcación. Llevar a cabo la reacción de 2-4 h a temperatura ambiente.
       Nota: Hemos encontrado los siguientes alternativas eficientes al HBTU (que generalmente requiere menos cantidad de los aminoácidos y el agente de acoplamiento): COMU, PyBOP, HATU, DIC/Oxima.
    5. Hacer la prueba para confirmar el acoplamiento exitoso un Kaiser.
    6. -Proteger el grupo Fmoc del aminoácido mediante la adición de una solución al 20% de 4-metil piperidina (10 mL) en DMF. Hacerlo dos veces, cada vez agitando la mezcla de reacción durante 15 minutos.
       Nota: Una alternativa eficiente para la eliminación de Fmoc es piperazina/DBU¹².
       1. Realizar un lavado con DCM (15 mL) entre adiciones.
    7. Hacer la prueba para confirmar la protección acertada la del aminoácido un Kaiser.
    8. Lavar la resina a fin de eliminar los restos de 4-metil. Lavar la resina dos veces con DMF (10 mL), cada colada dura 5 min y finalmente con DCM (10 mL) durante 10 minutos.
    9. Añadir todos los aminoácidos restantes repitiendo sucesivamente el acoplamiento y protección de pasos.
19. Finalmente, después de todos los aminoácidos necesarios, enganche, conjugar la cola hidrofóbica en el último aminoácido de la construcción de la poliamina-péptido:
    1. Añadir 10 equivalentes de la funcionalidad deseada ácido carboxílico 9,5 equivalentes de HBTU y 12 equivalentes de DIPEA disolución en mezcla de DCM y DMF (1:1, 20 mL).
       Nota: Tenga en cuenta que algunas colas pueden necesitar una diferente proporción de disolvente (generalmente un mayor % de DCM) o la adición de otro solvente como N-methylpyrrolidone (NMP).
    2. Someter a ultrasonidos el cóctel durante 5 – 10 minutos hasta disolución (hemos visto tarda más para la cola completamente disolver) y agregar al recipiente.
       Nota: Para colas que contienen múltiples sitios reactivos, deben ser protegidos antes acoplándolos.
    3. Llevar a cabo esta reacción (la cola hidrofóbica de acoplamiento) durante al menos 5 h, aunque es aconsejable llevarla a cabo durante la noche para el mayor rendimiento.

2. PPA escote de soporte sólido

El propósito de este paso es la ruptura de la PPA de la resina y eliminar los grupos de protección Boc de los amino ácidos y residuos de poliaminas.

1. Lavar la resina con DMF (8 mL en 2 minutos) y dos veces con DCM (8 mL, cada vez durante 5 minutos). Antes de cada adición, drenar el solvente desde el buque. Una vez que se realiza el último lavado, seque la resina bajo vacío durante 15 minutos.
2. Preparar la solución de escote usando la siguiente proporción de mezcla: 28:1:1 ácido trifluoroacético (TFA): H₂O: Triisopropyl silano (TIPS). Para hacer 15 mL del escote cocktail añadir 14 mL de TFA, 0,5 mL de H₂O y 0.5 mL de consejos.
3. Añadir esta solución de escote a la resina y agitar por 2 – 4 h a temperatura ambiente.
4. Recoger la solución en un 25 o matraz de fondo redondo de 50 mL.
5. Concentrar la TFA en vacío a 1 – 2 mL utilizando un evaporador rotatorio a presión reducida y calentar la mezcla a 40 ° C (no superar los 55 ° C para evitar la descomposición de la PPA).
6. Después de la evaporación, añadir la solución obtenida de TFA (gota a gota) a un matraz de fondo redondo que contiene éter anhidro frío (15 mL). Esto precipitará inmediatamente la PPA.
7. Además, añadir éter anhidro frío (5 mL) al matraz original donde se concentraba el TFA.
8. Someter a ultrasonidos este matraz para recuperar sólidos adicionales y para combinar con la solución de éter en el paso 2.6.
   Nota: Se puede lavar la pipeta de transferencia con un volumen pequeño de DCM. Evitar la introducción de DMF durante el proceso porque tiende a formar una gel como sustancia.
9. Coloque el matraz (cubierto) dentro del refrigerador y déjela reposar durante la noche para maximizar la precipitación.
10. Recoger el material precipitado por filtración de vacío utilizando un embudo de filtro de disco sinterizado. Los tamaños de poro ideal son finos o medios.
11. Lavar el precipitado dos veces con éter frío (5-10 mL) para eliminar cualquier materia orgánica residual.

3. identificación del producto crudo utilizando el método de la gota seca de MALDI

1. Preparación de la matriz para el análisis en modo positivo:
   1. Para iniciar el análisis del peso molecular mediante espectrometría de masas matriz asistida por láser de desorción/ionización (MALDI), agregue 10 a 20 mg de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico a un tubo de microcentrífuga.
   2. Agregar una solución de agua/acetonitrilo (1:1, 1,0 mL) con 0.1% de ácido trifluoroacético (TFA). Mezclar bien todo con un vórtex.
      Nota: Esta matriz debe utilizarse para péptidos cargados positivamente. Modo negativo MALDI es similar, pero requiere una matriz que contiene 9-aminoacridina con 0.1% amoníaco como solvente aditivo.
   3. Añadir 1-2 μl de la muestra a la placa de la blanco de acero inoxidable para MALDI y secar la muestra en aire. Añadir 1-2 μl de la matriz y secar otra vez.
      Nota: Las placas tienen marcas circulares cuadriculadas a lo largo de la placa de la blanco para ayudar a localizar el lugar en particular.
2. Analizar las muestras en instrumento MALDI para verificar su identidad. Ionización por electrospray (ESI) es una alternativa válida para confirmar la identidad de las PPA.

4. purificación de la PPA mediante la purificación de la reverso-fase preparativa alto rendimiento cromatografía líquida (HPLC)

1. Disolver el precipitado de PPA en una mínima cantidad de agua y acetonitrilo.
   1. Como regla general, se disuelven 100 mg de PPA crudo seco en menos de 5 mL de acetonitrilo y agua. Más hidrofóbicos PPA podrían requerir un mayor porcentaje de acetonitrilo para disolver y también pueden requerir un volumen mayor de solvente en general, dependiendo de la carga neta de las PPA (tabla 1).
   2. Si la disolución completa no ocurre, agregar 1% TFA (ACN o H₂O). También es posible añadir cantidades de rastro de otros disolventes compatibles incluyendo dimetilsulfóxido, metanol o isopropanol (limitar su contenido a un 5%).

Solvente	PPAs cargados positivamente		PPA con carga negativa
	0.1% TFA en el agua		0.1% NH3 en el agua
	0.1% TFA en ACN		0.1% NH3 en ACN

Tabla 1: sistemas de solvente. Propuesta sistema de solventes para positivamente y negativamente cargados PPA.

2. Someter a ultrasonidos la PPA utilizando un sonicador cuerno por 20 min a 10 impulsos de s con Amp1 del 48% o de 2-3 h en un baño ultrasónico.
3. Luego, filtrar usando un filtro de jeringa de 0.45 μm seguido por filtración usando un filtro de jeringa de politetrafluoroetileno (PTFE) de 0.20 μm. La solución PPA debe ser clara y libre de todos los materiales de partículas.
   1. Si la filtración es demasiado difícil, someter a ultrasonidos para un período prolongado de tiempo. Se recomienda que la solución de PPA es purificada inmediatamente después de la filtración de la jeringa, ya que un almacenamiento prolongado puede Agregar a gelate, que necesitarán volver a sonicación y, tal vez, la filtración.
4. Durante y después de la purificación, utilizar solventes de grado HPLC o los que se filtran a través de un 0.25 μm jeringa filtro de membrana.
   Nota: Las condiciones solvente más común para purificar PPAs consisten en un gradiente de H₂O y ACN.
5. Utilizar un instrumento estándar de HPLC de fase inversa de este protocolo. Debe incluir un programador de gradiente de elución, un sistema binario de solvente, capaz de detectar en el 220 y 254 nm y un colector de fracciones programable de detección de UV. El caudal máximo debe ser 50 mL/min.
6. Uso un C-18 invertida columna para separación de fase. Columnas de las siguientes dimensiones se pueden utilizar dependiendo de la masa del sólido se purifica y la red de carga de la PPA (tabla 2).

Carga de PPA	Tamaño de partícula	Tamaño de la columna	Masa de crudo PPA
+ ve cargadas	5 μm	150 x 30 mm	170 mg
-ve cargadas	5 μm	150 x 30 mm	170 mg
+ ve cargadas	5 μm	150 x 21,2 mm	90 mg
-ve cargadas	5 μm	150 x 21,2 mm	90 mg

Tabla 2: sugiere columnas: Dimensiones de columnas, tamaños de partícula y la capacidad de carga máxima por inyección para C18 columnas HPLC de fase reversa

7. Inyectar el PPA con un volumen determinado por tanto la capacidad de la columna y por el volumen del loop de inyección de la HPLC. Ejecutar el método de gradiente HPLC según la configuración que se observa en la tabla 3 (tiempo de elución de 40 min).

Tiempo	Solvente (acetonitrilo)	B solvente (agua)	Caudal (mL/min)
0	5%	95%	Velocidad de flujo depende de su tamaño y el embalaje de la columna.
2	5%	95%
35	95%	5%
38	100%	0%
40	5%	95%

Tabla 3: gradiente sugerida: Gradiente de fase inversa sugiere que muestra la composición relativa de agua vs acetonitrilo durante un período de tiempo. El caudal depende de las especificaciones de la columna.

8. Analizar las fracciones recogidas en los diferentes tubos de ensayo usando MALDI y determinar que tubo (o tubos) contienen la PPA. Esto se evalúa estudiando el peso molecular encontrado en cada tubo.
   1. Compruebe la pureza de las fracciones en un HPLC analítico. Utilizar un sistema de HPLC-gradiente equipado con un detector de ultravioleta a 220 nm.
   2. Si hay impurezas, no un ciclo adicional de la purificación por HPLC. El degradado anterior utilizado para HPLC preparativa puede reducido para utilizar con el HPLC analítica utilizando la columna convertidor en línea de software. Cada fracción mucho ser ≥ 95% puro para la caracterización física o evaluación biológica.
9. Recoger las fracciones en un gran matraz o frasco de evaporación y retire el acetonitrilo y la mayoría del agua. La solución final de PPA debería ser no más de 10 mL.
10. Transferir esta concentrado en un tubo de centrífuga de 50 mL. Tenga en cuenta que los PPA son sustancias detergente; así, se generarán burbujas durante la evaporación del disolvente. Hemos encontrado que la adición de alcohol etílico disminuye la formación de burbujas.
11. Vacío concentrado concentrado. Durante la evaporación al vacío, una gran cantidad de la PPA podría adherirse a las paredes del recipiente. Recuperar esta enjuagando repetidamente la pared del matraz con agua HPLC. El volumen combinado de la PPA concentrada y el agua de enjuague debe ser no más de 30 mL.
12. Colocar la solución acuosa dentro de un tubo de 50 mL.
13. Flash freeze esta solución PPA en nitrógeno líquido:
    Nota: Flash congelación resultados en pequeños cristales de hielo que se sublime más rápido en el liofilizador. Por otra parte, la congelación lenta puede permitir la formación de uno mismo-montado estructuras supramoleculares. Otra alternativa (pero menos deseable) es poco a poco se congela en un congelador de-80 ° C o congelar con un hielo seco + mezcla de acetona
    1. Antes de colocar el tubo de centrífuga en el liofilizador, perforar o afloje el tapón del tubo para permitir que la humedad escape la muestra y recogido en la unidad de refrigeración. Establezca la unidad de liofilización a-54 ° C y 0.016 mbar.
       Nota: Otra opción es quitar la tapa y colocar un paño (con una banda elástica) sobre la apertura. También, hemos encontrado que congelar las muestras en un ángulo o el hielo se rompe en pequeñas porciones permite una liofilización más rápida y mejor debido a un aumento en la superficie.
    2. Si el sólido empieza a fundirse, esto puede indicar que existen rastros de un solvente orgánico (generalmente acetonitrilo). Repita el paso congelación y evaluar la condición de liofilización.
    3. Si el deshielo continúa, hay dos posibles soluciones:
       1. Dividir la muestra en dos porciones (para ser colocados en tubos), diluir con agua y congelar otra vez. No utilice esta solución a menudo porque grandes cantidades de solventes orgánicos pueden dañar el equipo.
       2. Alternativamente, coloque la muestra en un matraz y más se evapora el solvente orgánico bajo vacío. Lyophilizing una muestra que está en la forma líquida generalmente conduce a golpes y la pérdida del recinto de las PPA.

5. almacenamiento de PPA

1. Guarde el PPA en a-20 ° C con las tapas apretadas y selladas con Parafilm en un tubo con una etiqueta apropiada.
2. Antes de su uso, llevar la PPA a temperatura ambiente en una cámara de vacío para evitar la condensación del vapor de agua en el PPA.

Results

Después de la síntesis y purificación y antes de la evaluación físico-química o biológica, se recomienda las masas de las PPA son comprobarse y la pureza comprobada mediante análisis de HPLC. Caracterización de materiales o evaluación biológica, PPA tiene que tener una pureza de > 95%. La figura 2 muestra los espectros MALDI (abajo) confirmando la presencia del producto y del rastro HPLC (arriba). Sistemas de análisis de HPLC integran el área bajo la curva...

Discussion

Los protocolos descritos aquí pueden utilizarse para sintetizar los PPA como pozos como PAs y relacionados con moléculas basadas en péptidos (como híbrido peptoides PA). Aunque la síntesis de péptidos mediante SPPS es un procedimiento sencillo, la síntesis de péptidos que contiene moléculas biológicas autoguiados hacia el blanco puede ser particularmente difícil. Poliaminas como espermina, espermidina, diethyelenetriamine, etc., pueden funcionar como moléculas autoguiados hacia el blanco para apuntar las células...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Resina de cloruro de clorotritilo	Recipiente de síntesis AappTec	RTZ001
SynthwareTM	Aldrich	SYNP120050M
Diclorometano	Acros AC406920250		Fisher Sci. Catálogo #
Wrist Shaker	Boekel Scientific	401000-2
Kit de prueba Kaiser	Sigma-Aldrich	60017
2-[(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)etil-amino]-etanol	Sigma-Aldrich	CDS004772
Metanol anhidro	Acros	AC610981000	Fisher Sci. Catálogo #
Kit de prueba de cloranil	TCI	TCC1771-KIT	Catálogo VWR #
Di-tert dicarbonato de butilo	Acros	AC194670250	Fisher Sci. Catálogo #
Dimetilformamida	Fisher Scientific	BP1160-4
Hidracina	Acros	AC296815000	FIsher Sci. Catálogo #
(2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametileluronio hexafluorofosfato)	p3biosystems	31001
4-metilpiperidina	Acros	AC127515000	FIsher Sci. Catálogo #
Ácido trifluoroacético	AappTec	CXZ035
Triisopropil Silano	Sigma-Aldrich	233781
Ether	Fisher Scientific	E138-1
;-Ciano-4-hidroxicinámico	ácido Sigma-Aldrich	C8982
9-Aminoacridina	Sigma-Aldrich	92817
Fisherbrand  Filtros de jeringa: Membrana de PTFE	Fisher Scientific	09-730-21