Artículo de método

MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

DOI:

10.3791/57920

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15 de septiembre de 2018

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1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

micro-RNAs (miRNAs) son cortas y altamente homólogas secuencias de ARN, que sirven como reguladores post-transcripcionales de mensajero RNAs (mRNAs). Los métodos actuales de detección de miRNA varían en sensibilidad y especificidad. Se describe un protocolo que combina en situ el hibridación y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

micro-RNAs (miRNAs) son transcritos de RNA monocatenario que se unen a mensajero RNAs (mRNAs) e inhiben su traducción o promoción su degradación. Hasta la fecha, miRNAs se han implicado en un gran número de procesos biológicos y enfermedad, que ha significado la necesidad de los métodos de detección fiable de las transcripciones de miRNA. Aquí, describimos un protocolo detallado para marcado con digoxigenina ácido nucleico bloqueado (DIG) (LNA) basada en sondeos miRNA detección, combinada con la proteína immunostaining en secciones de corazón de ratón. En primer lugar, realizamos una técnica de hibridación en situ utilizando la sonda para identificar la expresión del miRNA-182 en las secciones de centro de control y los ratones de la hipertrofia cardiaca. A continuación, realizamos immunostaining para la proteína troponina T (cTnT) cardiaca, en las mismas secciones, localizar Co miRNA-182 con las células de cardiomiocitos. Mediante este protocolo, hemos podido detectar miRNA-182 por una fosfatasa alcalina a base de ensayo colorimétrico y reposo mediante tinción fluorescente. Este protocolo se puede utilizar para detectar la expresión de cualquier miRNA de interés mediante sondas LNA marcada con DIG y expresión de la proteína correspondiente en secciones de tejido de corazón de ratón.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

son micro-RNAs (miRNAs) corto (18 – 25 nucleótidos), ARN monocatenario, los que funcionan como reguladores negativos de la expresión génica a nivel post-transcripcional por inhibición de la traducción del ARN mensajero (ARNm) o promover la degradación del mRNA 1. miRNAs se transcriben intrones o exones de codificación o los genes y son troceados en el núcleo por DROSHA, miRNAs del precursor (pre-miRNAs), que son estructuras de corto lazo del vástago de 70 nucleótidos2. Después citoplásmica de la exportación, pre-miRNAs más son procesados por DICER en miRNAs maduros que abarcan 18 – 25 nucleótidos3,4. Posteriormente, el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) incorpora estos miRNAs como ARN monocatenario, que permite su unión a la región 3' no traducida (3'-UTR) de sus mRNAs de destino para reprimir su expresión3,5 .

En las últimas tres décadas, puesto que primero fueron identificados, miRNAs han surgido para principales reguladores de la expresión génica, cuyos niveles de expresión están estrechamente controlados6. Papeles de miRNAs se han descrito en órgano desarrollo7,8,9,10,11,12, mantenimiento de la homeostasis13,14 , así como de contextos de enfermedad que incluyen neurológica15,16,17,18,19, cardiovascular20, condiciones autoinmunes21 ,22,23,de cáncer24y otros25. La apreciación creciente de la importancia de los patrones de expresión de miRNA ha presentado la necesidad de métodos de detección fiable de las transcripciones de miRNA. Tales métodos incluyen PCR de tiempo Real, microarrays, norte Blot, hibridación en situ y otros, que varían en sensibilidad, especificidad y potencia cuantitativa, predominante debido a que miRNA transcripciones se componen de corto y secuencias altamente homólogo6.

Nos informó recientemente un papel importante de miRNA-182 en el desarrollo de la hipertrofia del miocardio26, una condición que describe la adaptación estructural del corazón en respuesta a elevadas exigencias hemodinámicas27,28. Hipertrofia cardiaca se caracteriza por el aumento de la masa miocárdica, que, si asociado con remodelación desadaptativas29, puede llevar a un mayor riesgo para la insuficiencia cardíaca, una condición representan 8.5% de todas las muertes atribuibles a cardiovascular enfermedad30.

Aquí, describimos nuestro protocolo que combina en situ el hibridación con una sonda de ácido nucleico bloqueado (DIG) (LNA) y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón, marcados con digoxigenina en nuestro modelo de la hipertrofia cardiaca.

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Protocolo

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Muestras de tejido de corazón de ratón para este estudio fueron obtenidas en conformidad con las leyes pertinentes y las directrices y fueron aprobadas por Yale Universidad institucional Animal cuidado y uso.

1. preparación de la solución

  1. Preparar Rnasa ddH gratis2O, por el tratamiento de 5 L de ddH2O con 5 mL de 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) durante la noche (O/N), a temperatura ambiente (RT). Autoclave (121 ° C) para desactivar la DEPC. Uso tratada con DEPC ddH2O para la preparación de soluciones downstream como indicado.
    PRECAUCIÓN: Con DEPC es un conocido carcinógeno, manejar sólo en la capilla del humo.
  2. Preparar solución de fosfato tampón salino (PBS) 1 x 5 tabletas de PBS en 1 L de ddH tratada con DEPC2O. Autoclave (121 ° C) de disolución.
  3. Diluir 1 mL de detergente no iónico por 1 L de 1 x PBS para preparar 0,1% detergente no-iónico/PBS (SAFT).
  4. Preparar etanol 90%, 70%, 50% y 30% en el ddH tratada con DEPC2O.
  5. Prepare un 10 mg/mL solución de proteinasa K (ProK) tratada con DEPC ddH2O. alícuota y almacenar a-20 ° C. Preparar una solución de trabajo μg/mL 20 de ProK por dilución 100 μL de solución stock ProK en 50 mL de ddH tratada con DEPC2o haga fresco antes de usarlo.
  6. Preparar 4% paraformaldehido (PFA) añadiendo 2 g de PFA en 50 mL de PBS 1 x. Calentar a 65 ° C con agitación ocasional, hasta que se disuelva. Alícuota y almacenar a-20 ° C.
    PRECAUCIÓN: PFA es un cancerígeno conocido, sólo la manija en la campana.
  7. Preparar una solución de NaCl de 3 M añadiendo g 87,8 a 500 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  8. Preparar una solución de 1 M MgCl2 agregando 20,3 g a 100 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  9. Preparar 1 M Tris pH 8.0 g 121,1 disolver en 800 mL de ddH2O. ajustar el pH a 8.0 con unas gotas de 1 N HCl, llevar el volumen a 1 L y autoclave (121 ° C). Preparar una solución de trabajo de 50 mM de Tris pH 8.0 diluyendo 2,5 mL de 1 M Tris pH 8.0 en 47.5 mL de ddH2O.
  10. Preparar 1 M Tris pH 9.5 por disolver 60,6 g en 400 mL de ddH2O. ajustar el pH a 9.5 con unas gotas de 1 N HCl, llevar el volumen a 500 mL y autoclave (121 ° C).
  11. Preparar 1-Metilimidazol 0,13 M pH 8.0 por dilución 1.6 mL de 1-Metilimidazol a 130 mL de ddH tratada con DEPC2O. ajustar el pH a 8.0 con aproximadamente 450 μl de 12 N HCl. agregar 16 mL de 3 M NaCl y llevar el volumen a 160 mL. Hacer fresco antes de usarlo.
    PRECAUCIÓN: 1-Metilimidazol es perjudicial para las membranas mucosas, ojos y piel, manejar sólo en la capilla del humo.
  12. Preparar diluyendo 176 μl de EDC a 10 mL de 0,13 M 1-Metilimidazol 0,16 M N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-etilcarbodiimida clorhidrato (EDC). Ajustar el pH a 8.0 con aproximadamente 100 μl de 12 N HCl. hacer fresco antes de usarlo.
    PRECAUCIÓN: EDC es perjudicial para las membranas mucosas, ojos y piel, manejar sólo en la capilla del humo.
  13. Preparar 1% H2O2 diluir 1,5 mL de 30% H2O2 en 50 mL de 1 x PBS. Hacer fresco antes de usarlo.
  14. Preparar 20 x SSC pH 7.0 por disolver 175,3 g de NaCl y 88,2 g de citrato de sodio (Na3C6H5O7) en 800 mL de ddH2O. ajustar el pH a 7.0 con unas gotas de 1 N de ácido clorhídrico, llevar el volumen a 1 L y autoclave (121 ° C).
    1. Preparar una solución de trabajo de 2 x SSC pH 7.0 diluyendo 20 mL de 20 x SSC pH 7.0 en 180 mL de ddH2O.
    2. Preparar una solución de trabajo de 1 x SSC pH 7.0 diluyendo 2,5 mL de 20 x SSC pH 7.0 en 47.5 Dec2O.
    3. Preparar una solución de trabajo de 0,2 x SSC pH 7.0 diluyendo 5 mL de 2 x SSC pH 7.0 en 45 mL de ddH2O.
  15. Diluir 0,5 mL de tampón ISH x microRNA 2 en 0,5 mL de ddH tratada con DEPC2o haga fresco antes de su uso para preparar solución de hibridación 1 x.
  16. Preparar solución stock de 200 mM de levamisol añadiendo 250 mg en 5 mL de ddH2O. alícuota y almacenar a-20 ° C.
  17. Preparar solución de bloqueo para el paso 5 (10% oveja serum/1% BSA/0.2 mM Levamisol) diluir 1 mL de suero de oveja en 9 mL de Saft y añadiendo 0,1 g de BSA. Añada 10 μL de levamisol antes de usar. Hacer fresco antes de usarlo.
  18. Preparar solución de bloqueo para el paso 6 (10% cabra serum/1% BSA) diluir 1 mL de suero de cabra en 9 mL de Saft y añadiendo 0,1 g de BSA. Almacenar a 4 ° C y usar dentro de una semana.
  19. Preparar la solución prestaining diluyendo 3,3 mL de 3 M NaCl, 5 mL de 1 M MgCl2, 10 mL de 1 M Tris pH 9.5, 100 μl de Tween-20, 100 μl de levamisol en 81,5 mL de ddH2o haga fresco antes de usar.
  20. Uso de nitroazul de tetrazolio (en tabletas de fosfato (BCIP) NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly para preparar 20 mL de solución de sustrato de la fosfatasa alcalina (AP) según las instrucciones del fabricante. Añadir 20 μL de levamisol. Hacer fresco antes de su uso y proteger de la luz.
  21. Preparar la solución KTBT al agregar 4 g de Tris, 4,4 g de NaCl y 375 mg de KCl en 500 mL de ddH2O. Autoclave (121 ° C).
  22. Opcional: Prepare una solución de trabajo de DAPI (1 μg/mL) diluyendo 50 μL de solución stock de DAPI (1 mg/mL) en 50 mL de PBS 1 x.
    Nota: Soluciones estándar como 3 M NaCl, 1 M de MgCl2, 1 M Tris-HCl, libre de nucleasas ddH2O 1 x PBS y 20 x SSC pueden adquirirse como alternativa. Para este protocolo, frascos de 50 mL vidrio Coplin o mailer de polipropileno diapositiva 20 mL frascos han sido utilizados.

2. preparación de tejido

Nota: Las secciones de corazón de ratón aquí fueron preparadas por Yale patología servicios de tejido, de tejido formalina-fijo/parafina-encajado, corte a 5 μm y colocadas en diapositivas cargadas.

  1. Rehidratación del tejido.
    1. Calentar los portaobjetos a 60 ° C durante 10 min, en el horno de hibridación hasta que la parafina se derrite visiblemente.
    2. Incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de agente de limpieza disponibles en el mercado (véase Tabla de materiales) durante 10 minutos, dos veces.
    3. Incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de etanol al 100% por 2 min, dos veces, seguido de etanol al 90% por 2 min, etanol al 70% por 2 min, dos veces, etanol al 50% por 2 min y etanol al 30% por 2 min.
    4. Incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de ddH tratada con DEPC2O 5 minutos.
    5. Incubar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x durante 5 minutos.
  2. Tejido de-proteinating.
    1. Incube los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de solución de trabajo ProK, a 37 ° C durante 15 min en el horno de hibridación de 20 μg/mL.
      PRECAUCIÓN: Digestión insuficiente puede resultar en pobre o ningún desarrollo de señal, mientras que la digestión excesiva puede resultar en la degradación del tejido y el desarrollo de la tinción de fondo. Optimización puede ser necesaria para este paso (1-20 μg/mL ProK, incubación de 5 a 20 min, RT-37 ° C).
    2. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x durante 5 minutos, a temperatura ambiente, dos veces.
  3. Fijación del tejido.
    1. Utilice un lápiz hidrofóbico para dibujar un círculo repelente al agua alrededor del tejido en cada diapositiva.
    2. 500 μl de solución PFA 4% se aplica a la duración de cada diapositiva e Incube los portaobjetos horizontal durante 10 min, a TA.
    3. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x durante 5 minutos, a temperatura ambiente, dos veces.
    4. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 0,13 M 1-Metilimidazol para 10 min, a temperatura ambiente, dos veces.
    5. Aplicar 500 μl de solución EDC de 0.16 M a la longitud de cada diapositiva e Incube los portaobjetos horizontal por 1 h a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
    6. Enjuague los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 50 mM Tris, pH 8.0 a TA.
    7. Enjuague los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x a RT, dos veces.
      Nota: Los pasos de fijación PFA y EDC son necesarios para la reticulación de miRNA y no deben ser omitidos. 31
  4. Bloqueo de la peroxidasa endógena.
    1. Incube los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1% H2O2 por 30 min a TA.
    2. Enjuague los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de PBS 1 x a RT, dos veces.

3. hibridación

  1. Precalentar la solución de hibridación (500 μl) a 50 ° C en el horno de hibridación, hasta la temperatura deseada, se alcanza (10 – 15 min).
  2. Preparar la cámara de hibridación por colocar 2 piezas de filtro o papel de tejido en la parte inferior de la cámara y mojando el papel con 50% formamida/1 x SSC.
    PRECAUCIÓN: Formamida es perjudicial para las membranas mucosas, ojos y piel, mango sólo en la capilla del humo.
  3. Aplique 200 μL de solución de hibridación para la duración de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal para 1-3 h a 50 ° C, en una cámara humidificada.
  4. Preparar la solución de sonda mezclando 0,5 μl stock punta de prueba (25 μm) en la solución de ofhybridization 250 μl (concentración final 50 nM) en un tubo de 1,5 mL.
    Nota: Diversos miRNAs se expresan en diferentes niveles, para que optimización con respecto a la concentración de la sonda puede ser necesario para este paso (1-50 nM) no evitar que ninguna señal o fondo alto desarrollo.
  5. 250 μl de solución de la punta de prueba se aplica a la duración de cada diapositiva y coloque encima un cubreobjetos libre de Rnasa. Evitar la formación de burbujas.
  6. Sellar la cámara de hibridación con parafilm e incubar O/N a 50 ° C.
    Nota: La temperatura de hibridación debe establecerse aproximadamente 30 ° C por debajo de la temperatura de fusión del RNA (Tm) de cada sonda. Optimización puede ser necesaria. Aquí, 50 ° C se utiliza como la temperatura de hibridación/lavado de miRNA-182, Ayuste de diversas puntas de prueba.

4. rigor lavados

  1. Precaliente 200 mL de 2 x SSC a 50 ° C en el horno de hibridación, hasta alcanzar la temperatura deseada (20 – 40 min).
  2. Lavar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 2 x SSC a 50 ° C por 5 min, o hasta que afloje el cubreobjetos.
  3. Lavar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 2 x SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos, dos veces.
  4. Lavar los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 0.2 x SSC a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  5. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de SAFT a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  6. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    Nota: El uso de condiciones libres de Rnasa ya no es necesario puesto que los híbridos de RNA-RNA se consideran estables.

5. Empuje la detección del anticuerpo

  1. Usar una pluma hidrofóbica para volver a dibujar un círculo repelente al agua alrededor del tejido en cada diapositiva, si es necesario.
  2. Aplicar 500 μl de bloquear la solución a la longitud de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal por 30 min a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
  3. Preparar la solución de anticuerpo de empuje (1:1, 000) por dilución 0,5 μL de anticuerpo DIG en la solución de ofblocking de 500 μL en un tubo de 1,5 mL.
    PRECAUCIÓN: Optimización puede ser necesaria para este paso (1: 500, 1:2, 000).
  4. Aplicar 500 μl de solución de anticuerpo DIG a la duración de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal por 1 h a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
  5. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de SAFT a temperatura ambiente durante 5 minutos, tres veces.
  6. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de prestaining solución a temperatura ambiente durante 5 minutos, dos veces.
  7. Incube los portaobjetos en un tarro de mailer polipropileno diapositiva que contiene la solución de substrato ofAP de 20 mL a 37 ° C, durante 6-24 h, protegido de la luz.
    PRECAUCIÓN: Desarrollo de Color debe controlarse que cada 2 h. optimización puede ser necesario para este paso.
  8. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de solución KTBT a temperatura ambiente durante 5 minutos, dos veces.
  9. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos.

6. reposo detección del anticuerpo

  1. Usar una pluma hidrofóbica para volver a dibujar un círculo repelente al agua alrededor del tejido en cada diapositiva, si es necesario.
  2. Aplicar 500 μl de bloquear la solución a la longitud de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal por 1 h a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
  3. Preparar la solución de anticuerpo de cTnT (1: 100) diluyendo 2 μL del anticuerpo de la cTnT en la solución de ofblocking de 200 μL en un tubo de 1,5 mL.
  4. Aplique 200 μL de solución de anticuerpo de reposo a la duración de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal O/N a 4 ° C, en una cámara humidificada.
  5. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, tres veces.
  6. Preparar la solución de anticuerpo anti-anti-conejo-568 (1: 500) por dilución 0,5 μL de anticuerpo anti-anti-conejo-568 en la solución de ofblocking de 250 μL en un tubo de 1,5 mL.
  7. 250 μl de solución de anticuerpo anti-anti-conejo-568 se aplica a la duración de cada diapositiva. Incube los portaobjetos horizontal por 1 h a temperatura ambiente, en una cámara humidificada.
  8. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, tres veces.
  9. Opcional: 250 μl de solución de trabajo de DAPI se aplica a la duración de cada diapositiva e Incube los portaobjetos horizontal durante 1 min a temperatura ambiente, protegido de la luz.
  10. Lave los portaobjetos en un frasco de Coplin de vidrio conteniendo 50 mL de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 5 minutos, dos veces.

7. montaje y proyección de imagen

  1. Montar el portaobjetos con 2 – 3 gotas de medio de montaje y un cubreobjetos de vidrio. Deje que los portaobjetos se seque completamente, O/N, a 4 ° C, protegido de la luz.
  2. Proceder a epifluorescente o microscopía confocal.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

miRNA en situ el hibridación se ha optimizado en las secciones de corazón de ratón utilizando un scramble miRNA y U6-snRNA, que sirvieron como controles positivos y negativos respectivamente. Coloración positiva está indicada en azul, mientras que la tinción negativa es indicada por la falta de desarrollo de color (figura 1A-1B). Evaluaron la expresión específica de cardiomiocitos de miRNA-182 en secciones de centro de control y los ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

detección de transcripción miRNA puede lograrse a través de diferentes técnicas que varían en sensibilidad, especificidad y potencia cuantitativa. Aquí, demostramos el acoplamiento de miRNA en situ hibridación con inmunotinción y describe un protocolo que permite la evaluación simultánea de los niveles de expresión de moléculas de proteína y miRNA, en las mismas secciones de corazón. Primero mostramos cómo realizar en situ hibridación de sondas de miRNA LNA marcada con DIG en las secciones de corazón em...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer a Athanasios Papangelis, por comentarios críticos sobre el manuscrito. FM es apoyado por la biotecnología y el Consejo de investigación de ciencias biológicas (BBSRC; BB/M009424/1). IP se apoya en el corazón Americano Asociación científico desarrollo Grant (17SDG33060002).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
DietilpirocarbonatoSigma AldrichD5758DEPC
Solución salina tamponada con fosfatoSigma AldrichP4417PBS
Tween-20Tensioactivo no iónicoAB02038 bioanalítico estadounidense
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinasa K, recombinante, grado PCRSigma Aldrich3115879001ProK
ParaformaldehídoSigma AldrichP6148PFA
Cloruro de sodioThermoFisherS271NaCl
Cloruro de magnesio hexahidratadoThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
Solución de ácido clorhídrico, 1 NThermoFisherSA48HCl
Solución de ácido clorhídrico, 12 NThermoFisherS25358HCl
1-metilimidazolSigma Aldrich336092
N-(3-dimetilaminopropil)-N′-clorhidrato de etilcarbodiimidaSigma Aldrich39391EDC
Solución de peróxido de hidrógeno H2O2Sigma Aldrich216763H2O2
Trisodium citrato dihidratadoSigma AldrichS1804Citrato de sodio
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)Qiagen339450scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182sonda de detección QIagenYD006157015'-DIG y 3'-DIG marcado con
clorhidrato de levamisolSigma Aldrich31742
Albúmina sérica bovinaSigma AldrichA9647BSA
NBT/BCIP Comprimidos SigmaAldrich11697471001NBT-BCIP
Cloruro de potasioThermoFisherP217KCl
solución DAPI (1 mg/ml)ThermoFisher62248DAPI
Cubreobjetos de vidrioThermoFisher12-545ECubreobjetos
vidrio Funda de plásticoGrace Bio-LabsHS40 22 mm x 40 mm x 0,25 mmcubreobjetos de plástico sin ARN-asa
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentos SigmaAldrich11093274910anticuerpo DIG
Pluma de barrera hidrofóbica Pluma de protección hidrofóbicaVector LaboratoriesLápiz Papanicolaou
Anticuerpo anti-troponina T cardíaca AnticuerpoAbcamab92546cTnT
de absorción cruzada IgG (H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 568Anticuerpo anti-Rabbit-568ThermoFisherA-11011
Dako Fluorescencia Medio de montajeDAKOS3023Medio de montaje
Suero de ovejaSigma AldrichS3772
Suero de cabraSigma AldrichG9023
Formamida desionizadaamericana Horno deAB00600
ThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer
de Anticuerpo secundario hibridación bioanalítico

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  3. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science. 297, 2056-2060 (2002).
  4. Krol, J., et al. Structural features of microRNA (miRNA) precursors and their relevance to miRNA biogenesis and small interfering RNA/short hairpin RNA design. Journal of Biological Chemistry. 279, 42230-42239 (2004).
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