MiRNA de tejidos específicos perfiles de expresión en ratón corazón secciones usando el hibridación In Situ

Summary

micro-RNAs (miRNAs) son cortas y altamente homólogas secuencias de ARN, que sirven como reguladores post-transcripcionales de mensajero RNAs (mRNAs). Los métodos actuales de detección de miRNA varían en sensibilidad y especificidad. Se describe un protocolo que combina en situ el hibridación y el immunostaining para la detección simultánea de moléculas miRNA y la proteína en secciones de tejido de corazón de ratón.

Abstract

micro-RNAs (miRNAs) son transcritos de RNA monocatenario que se unen a mensajero RNAs (mRNAs) e inhiben su traducción o promoción su degradación. Hasta la fecha, miRNAs se han implicado en un gran número de procesos biológicos y enfermedad, que ha significado la necesidad de los métodos de detección fiable de las transcripciones de miRNA. Aquí, describimos un protocolo detallado para marcado con digoxigenina ácido nucleico bloqueado (DIG) (LNA) basada en sondeos miRNA detección, combinada con la proteína immunostaining en secciones de corazón de ratón. En primer lugar, realizamos una técnica de hibridación en situ utilizando la sonda para identificar la expresión del miRNA-182 en las secciones de centro de control y los ratones de la hipertrofia cardiaca. A continuación, realizamos immunostaining para la proteína troponina T (cTnT) cardiaca, en las mismas secciones, localizar Co miRNA-182 con las células de cardiomiocitos. Mediante este protocolo, hemos podido detectar miRNA-182 por una fosfatasa alcalina a base de ensayo colorimétrico y reposo mediante tinción fluorescente. Este protocolo se puede utilizar para detectar la expresión de cualquier miRNA de interés mediante sondas LNA marcada con DIG y expresión de la proteína correspondiente en secciones de tejido de corazón de ratón.

Introduction

son micro-RNAs (miRNAs) corto (18 – 25 nucleótidos), ARN monocatenario, los que funcionan como reguladores negativos de la expresión génica a nivel post-transcripcional por inhibición de la traducción del ARN mensajero (ARNm) o promover la degradación del mRNA ¹. miRNAs se transcriben intrones o exones de codificación o los genes y son troceados en el núcleo por DROSHA, miRNAs del precursor (pre-miRNAs), que son estructuras de corto lazo del vástago de 70 nucleótidos². Después citoplásmica de la exportación, pre-miRNAs más son procesados por DICER en miRNAs maduros que abarcan 18 – 25 nucleótidos³....

Protocol

Muestras de tejido de corazón de ratón para este estudio fueron obtenidas en conformidad con las leyes pertinentes y las directrices y fueron aprobadas por Yale Universidad institucional Animal cuidado y uso.

1. preparación de la solución

1. Preparar Rnasa ddH gratis₂O, por el tratamiento de 5 L de ddH₂O con 5 mL de 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) durante la noche (O/N), a temperatura ambiente (RT). Autoclave (121 ° C) para desactivar la DEPC. Uso tratada con DEPC ddH₂O para la preparación de soluciones downstream como indicado.
   PRECAUCIÓN: Con DEPC es un conocido carcinógeno, manejar sólo en la c....

Results

miRNA en situ el hibridación se ha optimizado en las secciones de corazón de ratón utilizando un scramble miRNA y U6-snRNA, que sirvieron como controles positivos y negativos respectivamente. Coloración positiva está indicada en azul, mientras que la tinción negativa es indicada por la falta de desarrollo de color (figura 1A-1B). Evaluaron la expresión específica de cardiomiocitos de miRNA-182 en secciones de centro de control y los .......

Discussion

detección de transcripción miRNA puede lograrse a través de diferentes técnicas que varían en sensibilidad, especificidad y potencia cuantitativa. Aquí, demostramos el acoplamiento de miRNA en situ hibridación con inmunotinción y describe un protocolo que permite la evaluación simultánea de los niveles de expresión de moléculas de proteína y miRNA, en las mismas secciones de corazón. Primero mostramos cómo realizar en situ hibridación de sondas de miRNA LNA marcada con DIG en las secciones de corazón em.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dietilpirocarbonato	Sigma Aldrich	D5758	DEPC
Solución salina tamponada con fosfato	Sigma Aldrich	P4417	PBS
Tween-20		Tensioactivo no iónico	AB02038 bioanalítico estadounidense
Histoclear	National Diagnostics	HS-200
Proteinasa K, recombinante, grado PCR	Sigma Aldrich	3115879001	ProK
Paraformaldehído	Sigma Aldrich	P6148	PFA
Cloruro de sodio	ThermoFisher	S271	NaCl
Cloruro de magnesio hexahidratado	ThermoFisher	M33	MgCl2
Tris	Sigma Aldrich	T6066
Solución de ácido clorhídrico, 1 N	ThermoFisher	SA48	HCl
Solución de ácido clorhídrico, 12 N	ThermoFisher	S25358	HCl
1-metilimidazol	Sigma Aldrich	336092
N-(3-dimetilaminopropil)-N′-clorhidrato de etilcarbodiimida	Sigma Aldrich	39391	EDC
Solución de peróxido de hidrógeno H2O2	Sigma Aldrich	216763	H2O2
Trisodium citrato dihidratado	Sigma Aldrich	S1804	Citrato de sodio
miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)	Qiagen	339450	scramble miRNA/U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182	sonda de detección QIagen	YD00615701	5'-DIG y 3'-DIG marcado con
clorhidrato de levamisol	Sigma Aldrich	31742
Albúmina sérica bovina	Sigma Aldrich	A9647	BSA
NBT/BCIP Comprimidos Sigma	Aldrich	11697471001	NBT-BCIP
Cloruro de potasio	ThermoFisher	P217	KCl
solución DAPI (1 mg/ml)	ThermoFisher	62248	DAPI
Cubreobjetos de vidrio	ThermoFisher	12-545E	Cubreobjetos
vidrio Funda de plástico	Grace Bio-Labs	HS40 22 mm x 40 mm x 0,25 mm	cubreobjetos de plástico sin ARN-asa
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentos Sigma	Aldrich	11093274910	anticuerpo DIG
Pluma de barrera hidrofóbica Pluma de protección hidrofóbica	Vector Laboratories		Lápiz Papanicolaou
Anticuerpo anti-troponina T cardíaca Anticuerpo	Abcam	ab92546	cTnT
de absorción cruzada IgG (H+L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 568	Anticuerpo anti-Rabbit-568	ThermoFisher	A-11011
Dako Fluorescencia Medio de montaje	DAKO	S3023	Medio de montaje
Suero de oveja	Sigma Aldrich	S3772
Suero de cabra	Sigma Aldrich	G9023
Formamida desionizada	americana Horno de	AB00600
	ThermoFisher	UVP HB-1000 Hybridizer