Artículo de método

Reversión química de células madre pluripotentes humanas convencionales a un estado ingenuo con potencia mejorada del Multilineage diferenciación

9.4K vistas

⸱

DOI:

10.3791/57921

⸱

10 de junio de 2018

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Presentamos un protocolo de reversión química rápida, eficiente y a granel de las células madre pluripotentes humanas linaje preparado convencional (hPSC) en un estado de preimplantación epiblasto como pluripotentes ingenua de epigenomically estable. Este método resulta en expresión génica disminución linaje preparado y notable mejora en la diferenciación del multilineage dirigida a través de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC.

Resumen

Las ingenuo (N-hPSC) células madre pluripotentes humanas con la funcionalidad mejorada puede tener un gran impacto en medicina regenerativa. El objetivo de este protocolo es volver eficaz pluripotent humana convencional, preparado por el linaje de células (hPSC) mantenidas en condiciones libre de alimentador o feeder-dependiente a una pluripotencia ingenua-como con la funcionalidad mejorada. Este método de reversión química ingenuo emplea el factor inhibidor de leucemia clásica (LIF), GSK3β y MEK/ERK inhibición cóctel (LIF-2i), complementado con un inhibidor de tankirasa XAV939 (LIF-3i). LIF-3i vuelve hPSC convencional a un estado pluripotente estable adoptando transcripcional, bioquímicos y características epigenéticas del epiblasto antes de la implantación humana. Este método de LIF-3i requiere manipulación de la cultura de célula mínima y es altamente reproducible en un amplio repertorio de células madre embrionarias humanas (hESC) y líneas de células madre (hiPSC) libre de transgén de humanas pluripotentes inducidas. El método LIF-3i no requiere un paso re cebado antes de la diferenciación; N-hPSC pueden diferenciarse directamente con eficacias extremadamente altas y mantener karyotypic y epigenómica estabilidades (incluso de loci impresos). Para aumentar la universalidad del método, en el cóctel de LIF-3i complementado con dos pequeñas moléculas adicionales que potencian la proteína quinasa (Forskolina) y erizo sónico (sHH) (purmorphamine) señalización (LIF-5i) se cultivan primero hPSC convencional. Esta breve etapa de adaptación de LIF-5i significativamente mejora la inicial expansión clonal de hPSC convencional y permite que posteriormente volvieron a ingenuos con LIF-3i solo en grandes cantidades, así evitando la necesidad de picking/subcloning raro N-hPSC colonias más adelante. HPSCs LIF-5i-estabilizado se mantienen posteriormente en LIF-3i solos sin necesidad de moléculas anti-apoptóticas. Lo más importante, reversión de LIF-3i mejora notablemente la pluripotencia funcional de un amplio repertorio de hPSC convencional disminuyendo su expresión de gen de cebada de linaje y borrando la variabilidad interlineal de diferenciación dirigida comúnmente observado entre líneas hPSC independiente. Caracterizaciones representativas de LIF-3i-revertir N-hPSC son estrategias proporcionadas y experimentales para comparaciones funcionales de hPSC isogénicas en linaje cebada vs. ingenua-como Estados se contornean.

Introducción

El sistema de cultivo 2i (inhibidor de la MEK/ERK y GSK3β) fue desarrollado originalmente para refinar las culturas de las células madre embrionarias (mESC) heterogéneos basados en suero del ratón a un estado uniforme de pluripotencialidad similar al epiblasto preimplantacional de ratón1. Sin embargo, 2i no es compatible con el mantenimiento estable de humanas pluripotentes células madre (hPSC) líneas2. Los distintos compleja molécula pequeña, suplementada con factor de crecimiento y enfoques transgénicos se han divulgado recientemente para capturar supuestamente similar ingenua-como pluripotent humana molecular Estados2. Sin embargo, muchos de los Estados "ingenua-como" creados con estos métodos también exhibieron inestabilidad cariotípica, epigenómica defectos (por ejemplo, pérdida global de impresión genómica parental), o con problemas potenciales de diferenciación.

En contraste, el cóctel de triple inhibición química de la GSK3β, ERK y tankirasa señalización y factor inhibidor de leucemia (LIF-3i) era suficiente para la reversión estable de ingenua-como de un amplio repertorio de hPSC convencionales líneas3. LIF-3i-vuelto ingenuo hPSC (N-hPSC) mantiene los karyotypes normales y aumentado sus expresiones de genes específicos de ingenuo humano preimplantacional epiblasto (e.g.,NANOG, KLF2, NR5A2, DNMT3L, HERVH, Stella (DPPA3), KLF17 , TFCP2L1). LIF-3i reversión también conferida hPSC con una serie de características moleculares y bioquímicas únicas a pluripotencia mESC-como ingenua que incluyó mayor señalización de STAT3 fosforilados, disminución de la fosforilación de ERK, global de 5-METILCITOSINA CpG La hipometilación, desmetilación de CpG de genoma en células madre embrionarias (ESC)-promotores de genes específicos y el uso de potenciador de OCT4 distal dominante. Además, en comparación con otros ingenuos métodos de reversión que aberrantemente hypomethylated imprimieron loci genómicos, revertido por LIF-3i N-hPSC fueron sin pérdida sistemática de patrones de CpG impresos ni pérdida de expresión de ADN metiltransferasa (por ejemplo, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B)3.

Una cultura de LIF-3i directa de una amplia gama de células de vástago embrionarias humanas convencionales (hESC) y células de madre humanas pluripotentes inducidas (hiPSC) crecidas en comederos o en condiciones libres de alimentador de E8 logra reversión rápida y a granel a un ingenuo epiblasto-como estado. Sin embargo, directo LIF-3i ingenuo reversión puede ser ineficaz en algunas líneas de hPSC convencional inestable debido a las inherentes variabilidades genómicas y linaje preparado derivados de los fondos de donantes genéticamente diversas.

Así, para ampliar la utilidad del método LIF-3i, una optimización paso a paso fue desarrollada y se presenta en este documento, que permite la reversión ingenuo universal con casi cualquier hESCs convencional o libre de transgén hiPSC línea cultivados en alimentadores. Este método de reversión del ingenuo universalizado emplea un paso de la cultura inicial transitoria en hPSC convencional que complementa el cóctel de LIF-3i con dos adicionales pequeñas moléculas (LIF-5i) que potencian la proteína quinasa (Forskolina) y (sonic hedgehog (sHH) señalización de purmorphamine). Un paso inicial de hPSC convencional en LIF-5i adapta a posterior reversión de LIF-3i estable en grandes cantidades. Adaptación de LIF-5i inicial aumenta significativamente la proliferación clonal de la célula inicial de hPSC convencional en E8 o alimentadores (antes de su paso posterior estable, continuo en LIF-3i solo). Líneas convencionales hPSC adaptadas primero a un pasaje de LIF-5i toleran posterior a granel clonal pases de ingenuo revertir células en condiciones de LIF-3i, que evita la necesidad de escoger y subcloning de las colonias estables raras, o el uso rutinario de moléculas anti-apoptóticas o los inhibidores de la proteína Rho quinasa (ROCK).

El método LIF-3i ha sido empleado con éxito para ampliar estable y mantener un amplio repertorio de > 30 hPSC convencional independiente, genéticamente diversas líneas para > 10 – 30 pasos utilizando cualquiera de los dos métodos de disociación enzimática o no enzimática, y sin evidencia de inducción de cromosómicas o anomalías epigenómica, incluyendo anormalidades en lugares geométricos del gene impreso. Además, cultura de LIF-5i/LIF-3i secuencial es el método de reversión sólo ingenuo que hasta el momento se ha reportado que mejora la pluripotencia funcional de un amplio repertorio de líneas convencionales hPSC disminuyendo su expresión del linaje cebada gen y dramáticamente mejorar su potencia de diferenciación multipotentes. La borra de ingenuo reversión método de LIF-3i la inherente variabilidad de la diferenciación de líneas hPSC convencional, preparado por el linaje de la interlínea y tendrá una gran utilidad de aplicación en medicina regenerativa y terapias celulares.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Animales todos los procedimientos se realizaron con las pautas de cuidado de los animales y protocolos de actuación aprobados por el Johns Hopkins la escuela de medicina Instituto de cuidado de los animales y el Comité uso (IACUC).

1. preparación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) dependiente de la alimentación convencional (medio de hESC, MEF) o revertido ingenuo (medio de LIF-3i, MEF) hPSC cultura

  1. Comprar o preparar en suministros de paso bajo de alimentadores MEF de CF1 o CF1 x embriones de ratón E13.5 DR4 híbridos siguiendo protocolos publicados4.
    1. Criopreservar las culturas del paso bajo (p1-p2) MEF previas (para almacenamiento a largo plazo) o irradiación posterior (de hasta 6 meses) y almacenar en nitrógeno líquido como describieron anteriormente4.
    2. Irradiar (5.000 rad) a granel MEF ampliado debajo de p5 con una γ - o X-ray-irradiador y preparar alícuotas de 1.5 x 106 células por vial para almacenamiento a corto plazo (menos de 6 meses) a-80 ° C en un congelador de temperatura ultrabaja.
    3. Placa de 1.2 x 106 (recién irradiado criopreservado no) y 1.5 x 106 (irradiado criopreservado) MEF por una placa de 6 pozos gelatinizada para preparar cultivos de alimentación, como se describe a continuación.
  2. Preparar gelatina-6 pozo estériles Tratado de cultivo de tejidos las placas revestidas por agregar 1,5 mL de solución de gelatina 0.1% estéril a cada pozo en un gabinete de seguridad biológica.
  3. Incube las placas recubiertas de gelatina a 37 ° C durante al menos 1 hora o toda la noche en un incubador de CO2 de laboratorio.
  4. Al día siguiente, descongelar paso bajo (por ejemplo, P2 a P4) criopreservado de DMSO e irradiado (5.000 rad) MEF según los pasos indicados a continuación.
    Nota: MEF no irradiado debe también ser descongelado, ampliado e irradiado inmediatamente antes de uso.
  5. Colocar una alícuota MEF criopreservada en un baño de agua de 37 ° C. Al descongelar, esterilizar el tubo con etanol y diluir inmediatamente el crioprotector DMSO al menos 10 veces con medio MEF (tabla 1) dentro de un gabinete de bioseguridad (p. ej. transferencia 1 mL DMSO-MEF alícuota en medio MEF de 9 mL de 15 mL estéril cónico).
  6. Centrifugar las células MEF diluidas a 200 x g durante 5 min en tubos cónicos de 15 mL estéril.
  7. En un gabinete de bioseguridad, aspirar y eliminar el sobrenadante libre de células y resuspender el precipitado de células en medio fresco de MEF 1 – 2 mL.
  8. Suavemente, deseche la solución de gelatina y añadir 2 mL de MEF resuspendida en el medio MEF en cada pocillo de una placa de 6 pozos gelatinizada, como se indicó anteriormente. Las células MEF cuenta y placa 1.2 x 106 (recién irradiado criopreservado no) o 1.5 x 106 (irradiado criopreservado) MEF por una placa de 6 pozos gelatinizada.
    Nota: Todas la célula cultura las placas que se transfieren de la incubadora de CO2 para el gabinete de seguridad de la biotecnología pueden limpiarse suavemente con papel rociado de etanol pero no deben ser directamente rociadas en con solución de etanol 70% para evitar la difusión del etanol en los pozos.
  9. Incube las placas MEF a 37 ° C durante la noche en un incubador de CO2 de laboratorio (5% CO2, atmósfera húmeda) para permitir el accesorio antes de utilizarlo.

2. a granel estabilización de culturas hPSC convencional para la posterior reversión de ingenuo con un paso de adaptación breve LIF-5i

  1. Validar todas las líneas convencionales hPSC por poseer un karyotype normal por las g-bandas, antes de la reversión del principio LIF-5i/LIF-3i.
    Nota: Reversión LIF-3i de líneas hPSC convencional alto paso (e.g., P > 40-50) debe evitarse, ya que estas culturas ya pueden abrigar las aberraciones genómicas que pueden impactar negativamente reversión de LIF-3i estable, eficiente y a granel de cebada, líneas de hPSC convencionales.
  2. Mantener y ampliar las culturas hPSC convencional con el validados cariotipos normales en un sistema de cultivo basado en el MEF (como se describe en la sección 1), o un sistema de cultivo libre de alimentador (según preferencias del investigador).
    Nota: Ambos dependiente del alimentador hPSC/MEF cocultures (p. ej., células suplementado (tabla 1) con 4-10 ng/mL bFGF) o alimentador (e.g., E8 5 o mTSER 6 los medios de comunicación (según instrucciones del fabricante en métodos las placas revestidas de vitronectina) son compatibles con reversión de ingenuo a granel usando el sistema de LIF-5i/LIF-3i/MEF (figura 1). Métodos no enzimáticos son preferibles para los pases de hPSC convencional antes de prepararlos para la reversión. Formulaciones de medios de comunicación de LIF-5i y LIF-3i no contengan antibióticos o antifúngicos. Reglas de operación estándar para la esterilidad gabinete de bioseguridad y el mantenimiento deben respetarse rigurosamente para evitar cualquier contaminación bacteriana o micótica.
  3. Para el MEF-basado en sistema de cultivo, preparar alimentadores MEF en la placa de 6 pozos gelatinizada como se describe en la sección 1 por lo menos un día antes pases de culturas hPSC convencional adaptado por LIF-5i.
  4. Después de hPSC convencional culturas llegaron al confluencia de ~ 50% (es decir, 3 a 5 días después de la galjanoplastia inicial), sustituir el medio de cultivo de células estándar con LIF-5i medio (2 mL por pozo; Tabla 1).
    Nota: Realice estos pasos en un gabinete de bioseguridad.
  5. Cultura y mantener hPSC/MEF convencional hasta 2 días en LIF-5i en la incubadora de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda). Cambiar el medio de LIF-5i diariamente para adaptarlos para su posterior paso y reversión estable en LIF-3i.
  6. Por otra parte, para las culturas libres de alimentador convencionales (por ejemplo, en E8), cultura hPSC en LIF-5i noche antes pases a la mañana siguiente.
    Nota: Las culturas LIF-5i y LIF-3i tanto se pueden mantener con atmosférico (21% O2) o fisiológica (5% O2) oxígeno niveles en la incubadora de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
  7. Antes de pases, coloque las placas de cultivo en un gabinete de bioseguridad lavado LIF-5i-adaptado hPSC convencional una vez con PBS y añadir 1 mL de reactivo de la disociación de células a cada pozo. Incubar por 5 min a 37 ° C en un incubador de CO2 y triturate suavemente con una pipeta en una suspensión unicelular en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
    Nota: Buffers de disociación no enzimática pueden utilizarse alternativamente para la preparación de las células para pases.
  8. Recoger la suspensión celular en medio de hESC a tubos cónicos de 15 mL estéril (dilución al menos 2 veces) y suavemente triturate células mediante pipeteo para obtener una suspensión unicelular.
  9. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, aspirado/descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 – 2 mL del medio de LIF-5i en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Contar las células usando un hemocitómetro o un contador celular automático.
  10. Lave la placa MEF pre enchapada dos veces con PBS (2 mL por pocillo, en placas de 6 pocillos) y distribuir 1 – 2 x 106 células (en medio de 2 mL LIF-5i) en la 1 de la placa de lavado PBS MEF.
  11. Ajustar y optimizar la densidad inicial de la galjanoplastia para cada línea individual hPSC que revirtió de ingenuo, como replating eficiencia puede ser muy variable. Coloque la placa en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
    Nota: El uso rutinario de anti-apoptóticos reactivos no se recomienda para la mayoría de las líneas hPSC con este método. El sistema de LIF-5i ya significativamente mejora clonal eficiencia re-galjanoplastia a granel inicial de hPSC convencionales líneas. Sin embargo, un solo uso de inhibidor de la roca (5-10 μM Y-27632) puede mejorar la eficiencia inicial de la LIF-5i re-galjanoplastia clonal de culturas hPSC convencional en el primer paso para algunas líneas inestables hPSC linaje preparado con la propensión a la espontánea diferenciación.
  12. Si a partir de culturas libres de alimentación (p. ej., E8), directamente transferencia de un bien de la disociada hPSC convencional adaptado en LIF-5i en uno irradiado bien MEF-plateado (es decir, paso de 1:1).
  13. Al día siguiente, agitar suavemente la placa para levantar todas las células no adheridas, aspirar el medio (lavado PBS es opcional) y reemplazar con 2 mL de medio de LIF-5i. Realizar este paso en una bioseguridad gabinete diariamente durante 3 a 5 días o hasta que las células son confluentes de 60 – 70% (figura 1). Coloque la placa en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).

3. a largo plazo mantenimiento y ampliación de N-hPSC en medio de LIF-3i

  1. Tras la inicial adaptación de LIF-5i, paso posterior estable LIF-3i culturas cada 3-4 días en un gabinete de bioseguridad, o cuando las culturas se convierten en 60 – 70% confluentes (figura 1).
    Nota: LIF-3i culturas requieren mantenimiento riguroso y permitiendo cultivos N hPSC alcanzar alta confluencia/densidad celular del cultivo prolongado (por ej., > 4 días) disminuye la eficiencia re-galjanoplastia clonal posterior y promueve la espontánea diferenciación.
  2. En un gabinete de bioseguridad, deseche el medio de cultivo y lavar cada pozo de LIF-5i/LIF-3i culturas suavemente, añadir 2 mL de PBS. Descartar el PBS y añadir 1 mL de solución de separación celular. Incubar por 5 min a 37 ° C en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda).
  3. Recoger la suspensión de células, añadir medio de hESCs (sin inhibidores o factores de crecimiento (tabla 1); dilución por lo menos 2 veces) para recuperar todas hPSC y triturate suavemente las células mediante pipeteo para obtener una suspensión unicelular. Transferir la suspensión a un tubo cónico de 15 mL estéril.
  4. Centrifugar a 300 g durante 5 min y aspirado/descartar el sobrenadante. Resuspenda el sedimento celular en medio de LIF-3i. Contar las células usando un hemocitómetro o un contador celular automático.
  5. Placa 2 x 105 células por pocillo en el MEF irradiada en la placa de 6 pozos gelatinizado para pases de rutina de las culturas de LIF-3i. Para los cultivos iniciales de LIF-5i-adaptado de la placa un inicialmente mayor densidad (4 x 105 células/pocillo) antes del primer paso en LIF-3i/MEF.
  6. Volver a la placa y distribuir hPSC LIF-5i-adaptado en fresco lavado con PBS irradiado MEF alimentador placas (preparada el día anterior como la anterior) en el medio de LIF-3i. Reemplazar el medio de LIF-3i diariamente.
  7. Paso N-hPSC para menos bulto continua 4 – 7 pasos en el LIF-3i medio antes del uso de N-hPSC en estudios funcionales o criopreservación. Registrar el número de pasos de N hPSC ya sea convencional o LIF-3i.
    Nota: Reversión de LIF-3i de paso alto (p. ej. > p40) líneas hPSC convencional, preparado de linaje no se recomienda. Debe hacer un esfuerzo para revertir las líneas hPSC convencional en el paso más bajo posible que estén disponibles. Además, el uso de hPSC LIF-3i-revertido que han sufrido más de 10 pasos de LIF-3i no se recomienda para estudios funcionales, puesto que tales culturas hPSC N pueden albergar copias karyotypically anormales debido a la selección de la cultura de célula clonal prolongada. Reversiones de LIF-5i/LIF-3i frescos de hPSC convencional paso bajo líneas deben realizarse estudios funcionales, si las reservas de N-hPSC con < 10 pasajes de LIF-3i no están disponibles.

4. crioconservación y descongelación de LIF-3i-revertir N-hPSC

  1. Ampliar N-hPSC revertida para por lo menos 5-7 pasos en LIF-3i, como se indicó anteriormente, antes de su uso en estudios funcionales o criopreservación a largo plazo. Anotar el número de pasajes en las condiciones convencionales y en condiciones de LIF-3i en cada frasco criopreservado.
    Nota: Exceso vuelto LIF-3i N-hPSC no utilizado en los análisis funcionales puede ser criopreservado en cada paso, pero congelamiento de pasajes reversión posterior inferiores (por ejemplo., < p3) puede resultar en pobre o eficiencias de recuperación post-thaw altamente variable.
  2. En un gabinete de bioseguridad, aspirar el medio de cultivo, lavar las células en PBS (2 mL por pozo), aspirar PBS y disocian hPSC colonias en las células con solución de separación celular (1 mL por pozo). Coloque la placa por 5 min a 37 ° C en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda). Diluir la solución de la separación de la célula con el medio de LIF-3i (2), recoger hPSC en un estéril cónico de 15 mL, centrifugar las células a 200 x g durante 5 minutos y resuspender el precipitado de células en medio de LIF-3i (1 – 2 mL por pozo-equivalente). Contar el número de células usando un hemocitómetro o un contador celular automático.
  3. N-hPSC de centrífuga en el medio de LIF-3i (200 x g durante 5 min) y resuspender las células en un gabinete de seguridad de la biotecnología en la solución de congelación (tabla 2), con una densidad de al menos 1 x 106 células/mL.
  4. Transferencia de las células en los tubos criogénicos de almacenamiento a largo plazo y coloque en un recipiente de congelación lenta. Permita que las muestras se congelen durante la noche en un congelador de-80 ° C.
  5. Al día siguiente, transferir los crioviales en un congelador de nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.
  6. Para descongelar, coloque el frasco congelado en un baño de agua de 37 ° C por 2 min esterilizar el frasco (es decir, spray de etanol), transferencia hPSC en un estéril cónico de 15 mL y diluir lentamente la células hESCs en 10 veces suplementado (tabla 1) con 5 μM de Inhibidor de quinasa (ROCK) la proteína Rho-associated Y-27632 dentro de una campana de seguridad biológica estéril gabinete.
  7. Centrifugar a 200 x g durante 5 minutos. En un gabinete de bioseguridad, descartar sobrenadante libre de células y resuspender el precipitado de células en LIF-3i suplementado (1 – 2 mL) con inhibidor de roca de 5 μM Y-27632.
    Nota: Exclusión de Y-27632 dará lugar a eficiencias de recuperación post-descongelación pobres (figura 2).
  8. La transferencia de las células descongeladas resuspendió en LIF-3i/ROCK inhibidor en los pozos de lavado PBS MEF-plateado. Criopreservar el LIF-3i culturas a una densidad de 1 x 106 células por vial. Descongelar cada uno de estos frascos en alimentadores en un pocillo de una placa de 6 pozos gelatinizado.
  9. Al día siguiente, empezar a regular LIF-3i media expansión sin inhibidor de la cinasa Rho.

5. alimentador eliminación para la recogida de muestras de N hPSC

  1. Para preparar cultivos de muestras de LIF-3i/MEF (o células/MEF convencional) (es decir, para la expresión del gen (p. ej., RT-PCR cuantitativa, microarrays) o análisis de proteínas (por ejemplo, Western blot), agotan culturas LIF-3i de alimentadores MEF usando Magnética activa célula clasificación (MACS) con el anticuerpo anti-TRA-1-81 revestido microbeads según protocolo del fabricante.
  2. También puede utilizar el siguiente método simple de la pre-galjanoplastia para agotar las culturas de los alimentadores, como se describe a continuación.
  3. En una campana de seguridad biológica estéril gabinete, descartar el sobrenadante libre de células, lavar el sedimento con PBS estéril de 2 mL por pozo. Quitar adherentes culturas LIF-3i/MEF usando celular separación solución (1 mL/pocillo). Incubar durante 5 minutos en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda). Recoger hPSC en un estéril cónico de 15 mL. Lavado 2 veces hESCs en medio, las células de transferencia en el estéril cónico 15 mL y centrifugar a 200 x g durante 5 minutos.
  4. En un gabinete de bioseguridad, resuspender cada pocillo de las células de LIF-3i/MEF disociado en 2 mL de medio de LIF-3i y transferir directamente a un nuevo pozo de una placa de 6 pozos que ha sido recién cubierta con 0.1% de gelatina.
  5. Incube las células hPSC de LIF-3i/MEF por 1 h a 37 ° C en un incubador de CO2 (5% CO2, atmósfera húmeda). Recoger las células no adherentes con una pipeta en un tubo cónico nuevo. Cuidadosamente añadir 2 mL de medio de células a cada pozo y remolino para recoger las células restantes no adherente.
    Nota: La mayoría de lo MEF irradiado se fije a la placa gelatinizada en 1 h, dejando a la mayoría de la hPSC en suspensión.
  6. Combinar y centrifugar las células a 300 x g durante 5 min lavado en PBS. Rápido-congele el precipitado de células en nitrógeno líquido después de la centrifugación, o alternativamente resuspender los pellets en un tampón de lisis que es compatible con el análisis de proteína o ácido nucleico aguas abajo (figura 2B).
  7. Realizar caracterizaciones de LIF-3i hPSC líneas con un control convencional hPSC isogénicas preparado correspondiente.
    Nota: Debido a la variabilidad intrínseca entre y dentro de las culturas cebadas, controles pertinentes elaboran un punto coincidente en cultura o antes de la reversión de ingenuo. Protocolos detallados y materiales para Bioimagen inmunofluorescente descendente, flujo cytometry, Western blotting, expresión génica (análisis de RT-PCR y microarrays), estudios de metilación (blot dot, microarrays de la metilación CpG), OCT4 potenciador proximal y distal predominio reportero ensayos y ensayos de inhibidor de la señalización se proporcionan en otros lugares3.

6. post reversión de ingenuo: validación de la integridad genómica y retención de improntas parentales de LIF-3i-revertir N-hPSC antes de su uso en ensayos funcionales

  1. Pantalla las partida culturas hPSC convencional, preparado para la posesión de un cariotipo normal (por ejemplo, con análisis de tinción Giemsa banda usando métodos publicados 7) antes de iniciar la reversión de LIF-5i/LIF-3i.
    Nota: Esto es para eliminar las poblaciones de hPSC convencional que pueden albergar anormales alteraciones genómicas que pueden conducir a ventaja selectiva artefactual de la supervivencia en condiciones de LIF-3i clonales.
  2. Para obtener resultados óptimos, recién volver hPSC convencional culturas a un estado ingenuo con LIF-3i varias semanas antes de su uso en estudios funcionales o dirigida a la diferenciación.
    Nota: La rutina prolongada cultura 'mantenimiento' en condiciones de LIF-3i para más de 10 pasajes siguientes reversión de ingenuo no se recomienda. Expansión de rutina y mantenimiento de líneas de hESC y hiPSC deben realizarse utilizando sistemas de cultivo convencionales (por ejemplo, en E8 o MEF/células medianas con bFGF).
  3. Evaluar las revertidas hPSC N líneas para la retención normal karyotypes 5 – 7 pasajes después de reversión de LIF-3i (e.g., con bandas de Giemsa tinción de análisis7, o cualquier otro método de elección).
  4. Evaluar todas las líneas de N-hPSC revertidas para la retención de huellas genómicas parentales normales por un análisis de metilación de ADN de elección (por ejemplo, los protocolos para análisis de microarrays de ADN CpG de improntas parentales en N-hPSC LIF-3i-volvió en otra parte3 ) después de 5 a 10 pasos de reversión de LIF-3i.

7. post reversión de ingenuo: Diseño Experimental directrices para ensayos cuantitativos diferenciación dirigida utilizando N-hPSC LIF-3i-vuelto

  1. Utilizar directamente LIF-3i N-hPSC en protocolos de diferenciación dirigida establecido sin manipulaciones de la cultura de célula adicional.
    Nota: Volver a cebado (es decir, convertir N hPSC convencionales condiciones preparadas antes de su uso en ensayos de diferenciación dirigida) no es necesario con el método LIF-3i y no se recomienda.
  2. A para los efectos del análisis y variabilidad en las pruebas funcionales de líneas individuales hPSC de la interlínea, validación cruzada de las potencias de la diferenciación linaje-específicas empleando los protocolos de diferenciación independiente con al menos tres hPSC líneas derivadas de fondos genéticos independientes (es decir, múltiples derivados de donantes hiPSC y células).
  3. Comparaciones funcionales, establecer culturas de hermano, en el número de paso equivalente y de la misma línea de hPSC (isogénicas) en paralelo al convencional preparado de linaje y culturas hPSC LIF-3i-volvió. Mantener cultivos de cebada/ingenuo hermano hPSC isogénicas en sus respectivos medios de comunicación (por ej., E8 vs. LIF-3i) y al mismo tiempo diferenciar mediante diferenciación idénticos protocolos y materiales, para eliminar cualquier sesgo experimental (figura 4).
  4. Para isogénicas pintado vs ingenuo hPSC comparaciones, ajustar y optimizar la galjanoplastia inicial densidades para cada ensayo de diferenciación individual.
    Nota: Protocolos detallados para progenitoras neurales, endodermo definitivo y hemato-endoteliales diferenciación dirigida de LIF-3i-revertir N-hPSC reciben en otra parte 3. Revertido por LIF-3i N-hPSC tienen capacidad proliferativa y de diferenciación más robusta en los ensayos de diferenciación dirigida de hPSC convencional. N-hPSC típicamente requiere una menor concentración de placas iniciales que las hPSC convencional, y a diferencia de su convencional preparado hPSC homólogos, no requieren el uso de anti-apoptóticos reactivos para mejorar su supervivencia clonal tras enzimática digestión en los ensayos de diferenciación.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Este protocolo optimiza la reversión de ingenua-como eficiente con LIF-3i en ambas culturas dependiente de alimentación y alimentador independiente linaje preparado hPSC convencional (figura 1). El protocolo detallado, aquí descrito, contornos adaptación secuencial a LIF-3i a partir de cualquier condiciones hPSC dependiente del alimentador o libre de alimentador convencional (p. ej. E8 medio).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El sistema de LIF-3i aplica una versión modificada del clásico 2i murino ingenuo reversión cóctel1 a células madre pluripotentes humanas. La auto renovación de hPSC (que no se puede expandir en 2i solo) se estabiliza en LIF-2i por complementar este cocktail con el inhibidor de tankirasa XAV939. LIF-3i cultura permite a granel y eficiente reversión de la hPSC convencional a un estado pluripotente que se asemeja el epiblasto preimplantacional humana3<...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Bajo un acuerdo de licencia entre Life Technologies y la Universidad Johns Hopkins (JHU), Dr. Zambidis tiene derecho a una cuota de regalías recibidas por la Universidad para la concesión de licencias de las células madre. Los términos de este arreglo son gestionados por JHU conforme a sus políticas de conflicto de intereses. Esto no altera la adhesión de los autores a las políticas de diario en el intercambio de datos y materiales.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por becas del NIH/NEI (R01EY023962), NIH/NICHD (R01HD082098), RPB Stein innovación, el fondo de investigación de la célula de vástago Maryland (2018-MSCRFV-4048, 2014-MSCRFE-0742), Novo Nordisk ciencia Foro premio y la Fundación de Moseley.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
anti- SSEA-1/CD15 antibody, APC conjugatedBD Biosciences561716use 5µL per assay (FACS)
anti- TFCP2L1 antibodySigma AldrichHPA029708use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-beta-Actin antibodyAbcamab6276use at 1:5000 (Western blot)
anti-CD146 antibody,  PE conjugated BD Biosciences550315use 5µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibody, APC conjugatedeBioscience17-0319-42use 2µL per assay (FACS)
anti-CD31 microbead kitMiltenyi Biotec130-091-935
anti-NANOG antibodyAbcamab109250use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-NR5A2 antibodySigma AldrichHPA005455use at a 1:100 dilution (immunostainings)
anti-p44/42 MAPK (Erk1/2) antibodyCell Signaling4695use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204 antibodyCell Signaling4370use at 1:1000 (Western blot)
anti-phospho-STAT3 (Tyr705) antibodyCell Signaling9145use at 1:1000 (Western blot)
anti-rabbit immunoglobulin antibody, biotinylatedAgilentE0432use at a 1:500-1:1000 dilution (immunostainings)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Ause 5µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Guse at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-STAT3 antibodyCell Signaling9139use at 1:1000 (Western blot), for detection of total protein
anti-STELLA/DPPA3 antibodyMilliporeMAB4388use at a 1:50 dilution (immunostainings)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemNLLC4770Ruse at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193use 10µL per assay (FACS)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161use 10µL per assay (FACS)
APEL2-LiStemCell Technologies5271
Bovine Serum AlbuminSigma AldrichA3311
CellAdhere dilution bufferStemCell Technologies7183dilutent for Vitronectin XF™ matrix
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstitute at 100mM in DMSO
confocal microscope systemZeissLSM 510
cord blood CD34+ derived iPSC lineThermo Fisher ScientificA18945also referred as 6.2 line
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995-065
DMEM-F12Thermo Fisher Scientific11330-032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
ForskolinStemgent04-0025reconstitute at 100mM in DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspend in water and sterilize with an autoclave
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-081
MEM Non-essential amino acid (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Scientific11140-050
mTeSR1 mediumStemCell Technologies85850
Nalgene cryogenic vialsThermo Fisher Scientific5000-0020
Nunc Lab-Tek II Chamber Slide SystemFisher Scientific154534
Paraformaldehyde (PFA) solution, 4% in PBSUSB Corporation 19943
PD0325901Sigma AldrichPZ0162reconstitute at 100mM in DMSO
Penicillin/streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
PurmorphamineStemgent04-0009reconstitute at 10mM in DMSO
recombinant human Activin APeprotechAF-120-14E
recombinant human Bone morphogenetic protein (BMP)-4Peprotech120-05ETresupend at 100ug/mL in 0.1% bovine serum albumin in PBS
recombinant human FGF-basic (bFGF)Peprotech1

Referencias

  1. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  2. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing Human Naive Pluripotency in the Embryo and in the Dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  3. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naive pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  4. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  5. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  6. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat Biotechnol. 24 (2), 185-187 (2006).
  7. Howe, B., Umrigar, A., Tsien, F. Chromosome preparation from cultured cells. J Vis Exp. (83), e50203(2014).
  8. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PLoS One. 6 (4), 18293(2011).
  9. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), 42838(2012).
  10. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
  11. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Hum Reprod. 24 (3), 580-589 (2009).
  12. Collier, A. J., et al. Comprehensive Cell Surface Protein Profiling Identifies Specific Markers of Human Naive and Primed Pluripotent States. Cell Stem Cell. 20 (6), 874-890 (2017).
  13. Liu, X., et al. Comprehensive characterization of distinct states of human naive pluripotency generated by reprogramming. Nat Methods. 14 (11), 1055-1062 (2017).
  14. Choi, J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
  15. Yang, Y., et al. Derivation of Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 169 (2), 243-257 (2017).
  16. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  17. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  18. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  19. Taapken, S. M., et al. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  20. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  21. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  23. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

C lulas madre pluripotentes ingenuasm todo LIF 3ic lulas madre embrionarias humanasc lulas madre pluripotentes inducidascultivo sin c lulas alimentadoraspasaje celulartinci n inmunofluorescentean lisis Western blotdiferenciaci n de teratomas

Artículos relacionados