Islote pancreático inclusión de secciones de la parafina

Resumen

Ex vivo islote pancreático estudios son importantes para la investigación de la diabetes. Técnicas existentes para el estudio de islotes cultivados en su arquitectura original de 3 dimensiones son lentos, ineficientes y uso poco frecuente. Este trabajo describe un método nuevo, simple y eficiente para la generación de secciones de la parafina de alta calidad de todo cultos islotes.

Resumen

Experimentos con islotes pancreáticos aislados son importantes para la investigación de la diabetes, pero islotes son costosos y de limitada abundancia. Islotes contienen una población de mezclado de la célula en una arquitectura estructurada que afecta a la función, e islotes humanos son ampliamente variables en la composición del tipo de célula. Métodos actuales utilizados para el estudio de islotes cultivados incluyen estudios moleculares realizados en islotes enteros, junten tipos de células de islote dispares juntos, o microscopía o estudios moleculares en células de los islotes dispersos, alterar la arquitectura de la isla. En vivo estudios de islote, secciones parafina-encajadas del páncreas es una técnica poderosa para evaluar los resultados de células específicas en el entorno nativo de páncreas. Estudiando la post-cultura islotes dividiendo el parafina ofrece varias ventajas: detección de múltiples resultados de mismo islotes (potencialmente incluso el mismo exacto islotes, mediante secciones seriadas), las medidas específicas del tipo celular y nativos manteniendo islote célula-célula y célula-sustrato interacciones durante la exposición experimental y de análisis. Sin embargo, técnicas existentes para incrustar aislaron islotes de cultura post son ineficientes, lentos, propensos a la pérdida de material y generalmente producen secciones con números islote inadecuada para ser útil para la cuantificación de los resultados. Patología clínica celular bloque preparación laboratorios son inaccesibles y poco práctico para los laboratorios de investigación básica. Hemos desarrollado un método de banco mejorado y simplificado que genera secciones con sólido rendimiento y distribución de los islotes. Islotes fijos son suspendidas en gel de agarosa histológica caliente y pipeta en un disco plano en un portaobjetos de vidrio estándar, tal que las islas se distribuyen en un plano. Después de deshidratación estándar e incrustación, (10 +) 4-5 μm las secciones múltiples se pueden cortar de la misma cuadra del islote. Usando este método, pueden realizarse análisis histológicos e inmunofluorescencia en ratón, rata e islotes humanos. Este es un enfoque eficaz, barato, ahorro de tiempo para evaluar los resultados específicos de tipo celular, intacta arquitectura de islotes cultivados.

Introducción

Páncreas islotes de Langerhans, la única fuente de circulación de insulina, son un tejido crítico para los investigadores de diabetes mellitus. De cualquier organismo dado, islotes tienen tamaño variable, la frecuencia de célula tipo y arquitectura^1,2,3. La estrategia convencional para estudiar en vivo la estructura y composición de células endocrinas de los islotes pancreáticos es dividiendo el páncreas tejido^4,5. Desde islotes constituyen sólo una pequeña fracción del contenido celular pancreática total, se realizan estudios moleculares en islotes aislados. Ex vivo islote cultura experimentos pruebas de respuesta a nutrientes, modulación del gene (transfección, transducción de señales), o tratamientos experimentales proporcionan la penetración importante en mecanismos de modulación de la función, la proliferación y supervivencia de la célula endocrina ^{5 , 6}.

A menudo los experimentos ex vivo del islote se analizan mediante estudios moleculares de islotes enteros o estudios histológicos o moleculares de células de los islotes dispersos en monocapa^5,6. Análisis molecular de islotes todo presenta la seria advertencia de mezclantes tipos de células, que pueden producir resultados falsos negativos o falsos positivos cuando se extrapolan a cualquier tipo de célula individual. Dispersión de células sobre cubreobjetos para microscopia de la cultura permite la medida de resultado específicas de tipo celular, pero altera la arquitectura del islote, que puede alterar la respuesta a la intervención y excluye la identificación de los resultados relacionados con la arquitectura. Además, generalmente solamente un resultado solo puede ser medido; por ejemplo, para medir la proliferación de la célula beta y la muerte de la célula beta en las mismas condiciones, dos experimentos separados deban realizarse. Estos enfoques también son ciegos a la variabilidad inter-islote, un área de creciente interés en el campo. Clasificación las células del islote por citometría de flujo para estudios moleculares de la célula-tipo-específico, o estudios de RNA unicelulares son elegantes pero costoso, desperdiciador de tiempo, limitada por la abundancia de tejido, erradicación de arquitectura y no muy adecuado para análisis de rutina de la célula cultura ^{5 , 7}. proyección de imagen confocal de islotes de Monte conjunto immunostained proporciona datos intacta arquitectura de alta calidad, pero es mano de obra, y datos obtenidos de cada muestra se limita a los resultados identificables en immunostaining solo⁸.

La capacidad para generar secciones de parafina de alta calidad de islotes todas cultura post abordará muchas de estas preocupaciones. Tejido del islote de alto costo, baja abundancia de modelos genéticos únicos o de los donantes de órganos humanos, o islotes estado post in vivo o in vitro manipulación experimental, son preciosos. Obtención de múltiples secciones de la parafina de los islotes mismo permitiría múltiples análisis específicos de tipo celular, intacta arquitectura desde el mismo experimento.

Técnicas existentes para generar pellets de islote para seccionamiento son imperfectas. Histología-optimizado de la agarosa es un gel acuoso bajo punto de fusión que es ampliamente utilizado en el procesamiento de muestras histológicas y citológicas, incluyendo muestras de tejidos pequeños o fragmentados que son difíciles de proceso⁹. Un islote inclusión enfoque es suspender los islotes en agarosa en un tubo de microcentrífuga, centrífuga para el material de la pelotilla, recuperar el tapón de agar, luego procesar y embed para seccionamiento^10,11. Extracción de la muestra solidificada de la parte inferior del tubo es lento y difícil, lleva a la fragmentación ocasional de la muestra y el riesgo de lesiones personales. Los islotes están concentrados en la punta de la clavija, islote inadecuada distribución en secciones obtenidas por este método. El fondo redondo del enchufe complica incorporar tales que puede presentar una región pobre en islote de seccionamiento. En general, este método conduce a bajo rendimiento y distribución islote agrupada en las secciones resultantes.

Este nuevo método es un enfoque simplificado y mejorado para la preparación de las secciones del islote. Islotes son concentrados en un pequeño volumen y luego se coloca en la superficie lisa de un portaobjetos de microscopio para formar un pequeño disco, con los islotes en un solo plano. El disco de Histogel-islote es posteriormente procesado para parafina incrustar en una deshidratación acortada y Protocolo de infiltración de xileno. El anterior planteamiento, que concentra los islotes en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga, también se lleva a cabo como una comparación. Esta nueva técnica mejora el rendimiento de islotes por sección, la distribución de los islotes en cada sección y toma menos tiempo para transferir los bloques islote casetes. Esta técnica es útil para los biólogos de islote u otros científicos estudiando pequeñas porciones de tejido que deseen maximizar productividad usan de un tejido de baja abundancia mediante la medición de los resultados múltiples en una sola muestra en su arquitectura de tejido propio.

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aprobados por la Comisión de uso y de UMass Medical School institucional Animal Care. Estudios del islote humano fueron determinados por la Junta de revisión institucional de UMass para no calificar para la revisión IRB o exención porque no implican el uso de sujetos humanos.

1. islote aislamiento y cultura

1. Islotes de aislar y separar contaminantes tejido exocrino y ductal mediante el método de su elección.
   Nota: Este método se optimizó utilizando islotes aislados por insuflación ductal colagenasa y Ficoll separación¹² (roedor) o islotes posterior a la expedición desde el programa integrado de distribución de islote (IIDP¹³; humanos). Islotes se recolecta a mano con una micropipeta de P200.
2. Para optimizar la morfología de la isla, permiten islotes recuperar durante la noche en medio del islote completo de 10 mL (RPMI con 10% FBS, penicilina/estreptomicina y glucosa de 5.5 mmol/L) en una cámara humidificada con 5% CO₂ a 37 ° C. Aunque este paso no es necesario para obtener las secciones, los islotes están más intactos después de un período de recuperación (ver figura 2).

2. islote fijación

1. Usando una punta de P200 de baja obligatoria, dedazo aproximadamente 250 islotes equivalentes (IEQ)¹³ usando una rejilla calibrada bajo un estereomicroscopio en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL baja obligatoria. Consejos y tubos Unión a baja reducen la pérdida de islotes pancreáticos.
2. Permiten islotes para instalarse en la parte inferior del tubo de microcentrífuga. Quite el sobrenadante más con una punta de la pipeta de P200, teniendo cuidado de no para eliminar cualquier islotes.
3. Añadir 1 mL de PBS. Centrifugar el tubo en una centrífuga oscilante del cubo hasta que la velocidad llegue a 200 x g y entonces detener el giro. Eliminar el sobrenadante. Repita el lavado de PBS, para un total de dos lavados.
4. Añadir 500 μl de solución de formol al 10% o paraformaldehído al 4% recién hechos. Fije en la temperatura ambiente durante 30 minutos. Para los resultados en este método, estos métodos de fijación eran indistinguibles. Fijación más corta también puede ser posible; se recomienda para optimizar la duración de la fijación para lograr el resultado deseado.
5. Retirar el fijador con una punta de P200.
6. Añadir 1 mL de PBS. Tubo de centrífuga hasta que la velocidad llegue a 200 x g y entonces detener el giro. Eliminar el sobrenadante. Repita el lavado de PBS, para un total de dos lavados.
7. Proceder inmediatamente al siguiente paso.

3. preparación del islote disco (figura 1)

1. El primer uso, fundir el gel (por ejemplo, Histogel) a 70 ° C y hacer alícuotas de 1,5 mL tubos de microcentrífuga para almacenamiento a largo plazo. Volumen de alícuota no es crítica, puesto que las alícuotas pueden ser reutilizadas.
2. Caliente del gel (aproximadamente 100 μl por muestra) a 70 ° C tubo de microcentrífuga con la alícuota de gel en un bloque térmico a 70 ° C.
3. Transferencia de perlas de agarosa azul (10 μl por cada muestra) en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL. Resuspender bien los granos antes de pipetear.
   Nota: Cuentas azules se mezclan con los islotes para ayudar en la identificación visual del material incrustado en el botón de la agarosa y el bloque de parafina. El número de abalorios azul utilizado no es fundamental para el resultado, pero evitar granos excesiva (> 5 x el número de islotes) para permitir una óptima distribución de islotes en las secciones.
4. Lavar los granos azules con 1mL de PBS, dos veces. Para cada lavado, gire los granos 1 min a 800 x g. Después del segundo lavado, suspender las cuentas de (n+ 2) x 10 μl PBS, donde n es el número de tubos de muestras; por ejemplo, 2 tubos, el volumen de PBS para añadir a los granos serían 40 μl.
5. Centrifugar el tubo de microcentrífuga con islotes (breve vuelta a 200 x g) y eliminar la mayor parte del sobrenadante. Corte el extremo de una punta de micropipeta 10 μl con tijeras o una cuchilla y añadir 10 μl de granos a cada tubo de islote, usando una punta limpiarla para cada muestra. No mezclar (para evitar la pérdida de islotes).
6. Centrifugue los islotes y los granos (breve vuelta a 200 x g). Quite tanta PBS como sea posible con una punta de micropipeta 10 μl sin cortar.
7. Etiquete los portaobjetos de microscopio para la identificación de la muestra. Se pueden preparar dos o tres muestras en cada diapositiva. Colocar el portaobjetos sobre la mesa cerca del bloque de calor con el gel caliente. Corte las puntas de tres a cinco 20 puntas de micropipeta vinculante bajo μl por muestra con una hoja de afeitar o tijeras. Carga dos P20 Micropipetas con puntas de corte para permitir la rápida conmutación de uno a otro.
8. Usando la primera micropipeta, agregar 15-20 μl de gel caliente en el tubo de microcentrífuga de islotes cuentas; inmediatamente la mezcla, evitando burbujas; y aplique la mezcla de granos de islotes de agar líquida a la diapositiva para formar un < disco de diámetro de 1 cm. Coloque el disco cerca del borde de la diapositiva, dejando espacio para el anillo de gel externo (siguiente paso). Puntee la diapositiva suavemente un par de veces a los islotes y los granos.
9. Usando una micropipeta segundo, añadir 20 μl de gel caliente al tubo de muestras. Utilizando la primera micropipeta, nuevo gel mezcla con cualquier restantes cuentas islotes, recalentamiento en el bloque de calor si empieza a solidificar, entonces aplique esta mezcla a la diapositiva, que rodea el disco original. Repita según sea necesario, utilizando puntas cortadas adicionales, hasta que el disco es el tamaño y grosor.
   Nota: El disco gelificado el manejo es más fácil si el anillo exterior es ligeramente más grueso. Por lo general, 3 x 20 μl de gel es suficiente. Este paso reduce al mínimo pérdida de islotes por tubo lavados y agrega islote pobres agarosa hacia el exterior del disco para facilitar el tratamiento de disco.
10. Preparar cada disco individualmente y seguimiento cuidadoso de la orden de la muestra si coloca varios discos en cada diapositiva.
11. Coloque el portaobjetos sobre una superficie plana de hielo húmedo, con una cubierta, por 10 minutos o hasta que el gel se solidifica. Es más difícil deslizar el disco de vidrio si se seca a cabo.
12. Etiqueta de procesamiento/incrustar cintas de tejido con lápiz, uno por cada muestra de la biopsia. Secar la parte posterior de la corredera para evitar mojar el papel azul.
13. Con el borde romo de una hoja de afeitar, empuje suavemente el disco en cada dirección libre de la Copa. Cuando se desliza fácilmente, empuje lentamente el disco desde el portaobjetos sobre el papel de seda azul. Coloque el disco, el lado plano hacia abajo, directamente sobre el papel.
14. Mantener el disco plano, doblar el papel alrededor del disco para prevenir movimiento, coloque el disco en un papel doblado en el cassette y cerrar el cassette. Si el disco no salga limpio el vaso, añadir más gel o volver la diapositiva de hielo durante unos minutos más.
15. Sumerja el cassette en PBS en un vaso de precipitados. Proceso para incorporar el mismo día para la morfología óptima de la parafina.

4. inclusión en parafina de

Nota: El gel del islote de proceso discos para bloques de parafina utilizando una serie de deshidratación abreviado como se describe a continuación. Esta técnica se optimizó utilizando un procesador automático y procesamiento manual debe producir resultados similares.

1. Sumergir cintas en etanol 85% durante 15 minutos.
2. Sumergir cintas en etanol al 95% durante 15 minutos.
3. Sumergir cintas en etanol al 100% durante 15 minutos. Repetir dos veces para un total de tres lavados.
4. Sumergir cintas en xileno durante 15 minutos. Repetir dos veces para un total de tres lavados.
5. Sumergir cintas en parafina fundida durante 10 minutos.
6. Transferencia de cassettes a parafina fundida fresco durante 10-30 minutos.
7. Cuidadosamente abra el cassette y desenvolver el papel azul. Retire el disco de gel, hacer el seguimiento de la superficie plana que se opuso al papel. Insertar el disco en un molde pequeño con la superficie plana (islotes conteniendo) hacia abajo, paralelo a la superficie de corte. Para el enchufe, cuidadosamente retire del cassette e incrustarlo en un molde pequeño con la punta apuntando hacia la superficie de corte.

5. parafina corte y tinción

1. Etiqueta diapositivas secuencialmente, en caso de secciones seriadas.
2. Tiene 5 secciones de parafina μm cortadas por un histotecnólogo experimentado. Para maximizar el rendimiento, guarde todas las secciones que contienen material. En general, que recoge 20 secciones permite captura de la mayoría del material.
3. Guardar secciones a temperatura ambiente. Las secciones son susceptibles a las manchas histológicas rutinarias (por ejemplo, H & E) e inmunofluorescencia (p. ej., insulina, glucagón y DAPI). Optimizar la fijación de otros antígenos, si es necesario.

Resultados

Figura 1muestra un esquema ilustrado de los pasos para preparar el disco de gel. Este gel disco método los resultados en las secciones de la parafina que contienen un número suficiente de islotes distribuidos en un solo plano para permitir la cuantificación significativa de los resultados. Figura 2 muestra las imágenes de baja magnificación de las secciones resultantes para ilustrar el número de islotes capturados por sección. En...

Discusión

Este método de empotrar modificado basado en el disco de gel proporciona un simple, barato y la forma eficiente para generar un alto rendimiento de islotes por sección. Construyendo el disco gel sobre una superficie de vidrio plano facilita islotes que se separa en una distribución uniforme sobre un área bien definida. Difusión de los islotes en un disco plano ofrece la ventaja de colocar muchos islotes en el plano de la sección, optimizando el rendimiento y permitiendo menos islotes ser utilizado. El grueso del disco pu...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo Eppendorf de 1,5 mL	Norgen Bioteck Corp	N/P 10113
Ranin Classic Starter Kit	ShopRanin	17008708
Ranin ClassicPipeta PR-2	ShopRanin	17008648
Punta de encuadernación baja (1000 μ L)	Genesee Scientific	24-430
Punta de unión baja (200 μ L)	Genesee Scientific	24-412
Punta de unión baja (20 μ L)	Genesee Scientific	24-404
Punta de unión baja (10 μ L)	Genesee Scientific	24-401
Solución de formalina al 10%	Sigma	HT501128
Paraformaldehído	Microscopía Electrónica Sciences	15710-S
Heatblock	VWR	949312
HistoGel	Thermo Scientific	HG-4000-012
Perlas azules de agarosa- Affi-gel	Bio-Rad	153-7301
Life technologies	de Dulbecco	14190-144
Casete de procesamiento de tejidos	Simport	M492-10
Bio-Wraps	Leica-Surgipath	3801090
Citadel 2000 procesador de tejidos	Thermo-Shandon LLC
Etanol a prueba de 200	Decon Laboratories, INC	2701
Xileno	Fisher Chemical	X5SK-4
Parafina	McCormick Scientific	39503002
Microtomo	Thermo-Shandon LLC	Finesse ME+
Anticuerpo de insulina	DAKO	A0564
Anticuerpo de glucagón	Sigma	G2654
Fluoroshield con DAPI	Sigma	F6057
Alex flúor 594 anticuerpos secundarios	Life technologies	A11076
Alex fluor 488 anticuerpos secundarios	Life technologies	A11001