Artículo de método

Diferencia de potencial nasal para cuantificar el transporte de iones Trans epitelial en ratones

DOI:

10.3791/57934

⸱

4 de julio de 2018

 , 
1Louvain Center for Toxicology and Applied Pharmacology (LTAP), Institut de Recherche Expérimentale et Clinique (IREC), Université Catholique de Louvain

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para medir diferencia de potencial nasal en ratones. La prueba cuantifica la función de transportadores transmembrana de iones tales como el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis quística y el canal epitelial del sodio. Es valioso para evaluar la eficacia de nuevas terapias para la fibrosis quística.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La prueba de diferencia de potencial nasal se ha utilizado durante casi tres décadas para ayudar en el diagnóstico de fibrosis quística (FQ). Ha demostrado ser útil en casos de atenuados, formas oligo o mono sintomática de la FQ se diagnostican generalmente más tarde en la vida y de trastornos relacionados con la CF como ausencia bilateral congénita de conductos deferentes, la pancreatitis crónica idiopática, alérgica aspergilosis broncopulmonar y bronquiectasia. En ajustes clínicos y preclínicos, la prueba se ha utilizado como un biomarcador para cuantificar las respuestas a estrategias terapéuticas específicas para CF. adaptar el test a un ratón es difícil y puede exigir una mortalidad asociada. Este papel describe la adecuada profundidad de la anestesia necesaria para mantener un catéter nasal en situ para perfusión continua. Listas las medidas para evitar la Bronco-aspiración de soluciones de perfusión en la nariz. También describe el cuidado de los animales al final de la prueba, incluyendo la administración de una combinación de los antídotos de los fármacos anestésicos, a revertir rápidamente la anestesia con la recuperación completa de los animales. Datos representativos de un CF y un ratón de tipo salvaje muestran que la prueba discrimina entre CF y CF no. En conjunto, el protocolo descrito aquí permite mediciones fiables de la situación funcional de transportadores trans epitelial de cloruro y sodio en ratones de respirar espontáneamente, así como varias pruebas en el mismo animal reduciendo el relacionado con la prueba mortalidad.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Durante casi tres décadas, se han utilizado mediciones potenciales eléctricas de la diferencia (PD) para evaluar el estado funcional de los transportadores de iones transmembrana expresada en la mucosa nasal, como representante de la de las vías aéreas distales1. Como una dinámica de varias fases de la prueba2,3, nasal PD permite disección funcional del regulador de conductancia transmembrana de la Fibrosis Quística (CFTR) y actividad del canal (ENaC) de sodio epiteliales, ambos localizan en las membranas apicales de las células epiteliales y ejercer roles críticos en la hidratación superficial de la vía aérea. La principal aplicación clínica de la prueba PD nasal es ayudar en el diagnóstico de la FQ, el desorden genético fatal más común en población Caucásica con una incidencia promedio de 1 de cada 2.500 nacidos vivos en países europeos. La prueba larga ha demostrado ser útil en el diagnóstico de formas oligo o mono sintomática atenuada, de la fibrosis quística generalmente se diagnostica más tarde en la vida y de trastornos relacionados con la CF como ausencia bilateral congénita de conductos deferentes, la pancreatitis crónica idiopática, alérgica aspergilosis broncopulmonar y bronquiectasias4. Más recientemente, clinométrica evaluación de la modulación terapéutica de la CFTR básico defecto5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 ha hecho uso de la PD nasal en los ensayos clínicos de nuevas terapias de CF. En la configuración de preclínica, la prueba ha sido adaptada a ratón17 para permitir la investigación de la bioactividad de nuevo CF blanco terapias18,19,20,21. En ratones, la técnica es delicada, basada en especies relacionadas con las diferencias anatómicas en el tamaño de la región nasal entre roedores y humanos y principalmente en el papel esencial de entradas sensoriales de la región nasofacial en roedores. Requiere operadores entrenados y calificados, maquinaria y equipo dedicado.

CF es un desorden sistémico múltiples de las glándulas exocrinas, en que la enfermedad respiratoria crónica domina el cuadro clínico. La enfermedad es causada por mutaciones en el gene que codificaba el monofosfato de adenosina cíclico (campo)-regulado de canal de cloruro CFTR22. Hasta la fecha, más de 2.000 mutaciones de CFTR han sido identificadas23. El más común mutación24,25, en casi el 90% de los alelos de la CF, corresponde a una supresión del fenilalanina en posición 508 de la cadena polipeptídica de la proteína (F508del-CFTR). La proteína CFTR es un canal puramente óhmica pequeña conductancia del cloruro. También hay evidencia considerable que la CFTR regula otros mecanismos de transporte, en particular, ENaC26,27. Transporte de electrolito defectuoso, incluyendo menor conductancia de cloruro CFTR dependiente y creciente conductancia de sodio ENaC-dependiente, es un sello de epitelios CF. El defecto anterior se refleja en una reducida o suprimida la repolarización en respuesta a una emanación de cloruro que Gradiente electroquímico y la adición de isoprenalina (un agonista β-adrenérgico que aumenta el cAMP intracelular) o forskoline (una adenilato ciclasa agonista, no aprobado para uso clínico). El defecto de este último se refleja en una hiperpolarización basal de la mucosa nasal (un EP más negativo) y una mayor respuesta a amilorida, un medicamento diurético que bloquea ENaC28.

Modelos de ratón de CF se han utilizado con frecuencia en la investigación de CF y han sido invaluables para disección de patología CF. Hoy en día, por lo menos quince modelos han sido descrito29, de los cuales tres son homocigóticos para el clínico más relevante F508del mutación30,31,32. Una de estas tres cepas30, desarrollado en la Universidad Erasmus en Rotterdam, se ha utilizado por casi 20 años en el laboratorio de Université catholique de Louvain (UCL). La Cftrtm1Eur modelo30 ha demostrado para ser muy útil para estudiar la fisiopatología multiorgánica de la enfermedad de CF y comprobar la eficacia de nuevas estrategias terapéuticas18,19,20, 21. Numerosos problemas pueden ocurrir durante o temprano después de (< 24 h) la prueba PD nasal en ratones. En este artículo se describen la profundidad adecuada de la anestesia necesaria para mantener un catéter nasal en situ para la perfusión continua y medidas para evitar la Bronco-aspiración de soluciones de perfusión en la nariz. El cuidado de los animales al final de la prueba también se describe, incluyendo la administración de una combinación de los antídotos de drogas anestésicas, a revertir rápidamente la anestesia con la recuperación completa de los animales. En conjunto, estos procedimientos permiten mediciones fiables en ratones de respiración espontánea, disminución de la mortalidad relacionada con la prueba y repetir la prueba en el mismo animal. Representante de datos obtenidos de la prueba de PD nasal en un CF y un ratón de tipo salvaje se muestran y discuten.

El protocolo de pruebas PD nasal murino se divulga en tres sesiones: evaluación y manejo antes, durante y después de la prueba. En la evaluación pre-test y la gestión, el protocolo de preparación del catéter doble lumen nasal y de las soluciones utilizadas para perfusión continua nasal se describe en detalle. Durante la evaluación y las porciones de la administración de la prueba, el montaje experimental y el manejo del ratón es disecado minuciosamente. Por último, manejo del animal al final de la prueba se describe para mejorar la recuperación completa de animal.

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Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los estudios y procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética para la investigación animal de la UCL (2017/UCL/MD/015) de acuerdo con la normativa comunitaria europea para el uso de animales en investigación (CEE n ° 86/609). Los investigadores están capacitados para la experimentación en animales después de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo, de 22 de septiembre de 2010 sobre la protección de los animales utilizados para fines científicos.

1. la prueba de evaluación y gestión

  1. Preparar el catéter de doble lumen nasal.
    Nota: Un catéter nasal es como un tubo capilar de doble luz, una luz se utilizan para la perfusión continua de soluciones, y el otro como una medición del canal.
    1. Calentar la parte central de una pieza, de unos 20 cm de largo, de tubo de polietileno (diámetro interno de 2.0 mm, 3.0 mm de diámetro externo; Figura 1 una) en la llama de un mechero de gas hasta que esté lo suficientemente suave como para tirar (10-15 s).
    2. Separe los dos extremos para obtener un tubo capilar muy delgado de longitud adecuada (~ 15 cm) y diámetro exterior (~0.1 milímetros) para la sonda nasal (figura 1b).
    3. Limpiar y desengrasar dos tales capilares con etanol puro, unirlos con cinta adhesiva (figura 1c) y pegar con pegamento de cianocrilato.
    4. Corte la longitud excesiva de las sondas con una navaja o un bisturí para obtener una óptima longitud del catéter doble lumen de unos 8 cm (figura 1d).
    5. Inyectar agua a través de dos lúmenes para verificar que son permeables.
    6. Aplicar una marca en una distancia de 5 mm de la punta.
      Nota: La sonda se introduce hasta la marca en la fosa nasal, por lo que todas las mediciones se hacen en el mismo sitio dentro de la cavidad nasal.
    7. Guarde el catéter de doble lumen en una caja seca.
      Nota: Puede ser usado 6 - 10 veces si adecuadamente limpiado inmediatamente después de la prueba.
  2. Preparar la mezcla de crema.
    1. Suavemente mezcle crema de electrólito y 3 M KCl solución saturada en una proporción de 1:1 (volumen), evitando formación de burbujas de aire pequeñas.
      Nota: La mezcla de crema se utiliza para construir los puentes de electrodo para la medición y la referencia de Ag/AgCl electrodos, como se ilustra en la figura 1.

figure-protocol-1
Figura 1 : Sondas con electrodos y puentes. La figura muestra el tubo de polietileno antes (a) y después del calentamiento y tracción (b), la cinta de unión de las dos partes capilares (c) de catéter doble lumen (d), los conectores de tubo de silicona (e) y electrodos (f). Para mayor claridad de imagen, los conectores no han sido llenados con la mezcla de crema. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Etiqueta de la soluciónDescripción de la solución
ASolución salina tamponada basal
BCloruro-libre tamponada con solución salina
C10-2 M solución amilorida
DLa forskoline solución 10-3 M

Tabla 1: Solución de valores para la prueba de PD nasal en ratones.

SalmMPeso molecularg/L
Cloruro de sodio (NaCl)13558.447.889
Dihidrato del cloruro de calcio (CaCl2.2 h2O)2.251470.331
Hexahidrato de cloruro de magnesio (MgCl2.6H2O)1.2203.30.244
Fosfato dipotásico (K2HPO4)2.4174.20.418
Fosfato monopotásico (KH2PO4)0.4136.10.054

Tabla 2: Composición de basal tamponada con solución salina (solución stock A).

  1. Preparar las soluciones.
    1. Prepare las cuatro soluciones madre necesarias para el protocolo experimental (tabla 1).
      1. Preparar la solución basal (solución A; Tabla 2) y la solución tamponada de cloruro-libre (solución madre B; Tabla 3) mezclando las sales en agua pura a temperatura ambiente. Ajustar el pH a 7.4 (gama 7.0-7.6) utilizando 1 N NaOH para elevar el pH, 1 N HCl a pH más bajo. Controlar la osmolaridad de la solución (275 mOsm/L).
      2. Almacenar en botellas de vidrio etiquetados a 4 ° C hasta por 3 meses o congeladas en botellas de plástico hasta por 6 meses.
      3. Preparar la solución de amilorida 10-2 M (solución C) mediante la adición de 26,6 mg de clorhidrato de amilorida a 10 mL de agua pura. Calienta la mezcla durante 5 a 10 minutos a 70 ° C. Como amilorida es sensible a la luz, conservar la solución C en un recipiente oscuro. Marque el recipiente y almacenar a 4 ° C hasta por 3 meses.
      4. Preparar la solución de forskoline 10-3 M (solución D) mediante la adición de 10 mg de Forskolina a 24,36 mL de agua pura. Etiqueta de alícuotas de 0,1 mL de la solución madre de forskoline y almacenar a-20 ° C hasta por 6 meses.
  2. Preparar soluciones frescas de A1, B1 y B2 (cuadro 4).
    1. Preparar solución fresca A1 (solución salina tamponada basal plus 10-4 M amilorida) obtener 10 mL de solución salina basal (solución stock A) y agregando 0,1 mL de 10-2 M solución de amilorida (solución C). Marque el recipiente y utilizar dentro de 24 horas de preparación.
    2. Preparar solución fresca B1 (cloruro tampón solución además de 10-4 M amilorida) obtener 10 mL de solución salina tamponada libre de cloro (solución stock B) y agregando 0,1 mL de 10-2 M solución de amilorida (solución C). Marque el recipiente y use dentro de las 24 horas de preparación.
    3. Preparar solución fresca B2 (amilorida de solución salina tamponada de cloruro libre y 10-4 M y 10-5 M forskoline) obtener 10 mL de solución salina tamponada libre de cloro (solución stock B) y agregando 0,1 mL de 10-2 M amilorida (solución stock C) y 0,1 mL de 10-3 M forskoline solución (solución D). Marque el recipiente y usar dentro de 2 horas de preparación.
SalmMPeso molecularg/L
Gluconato de sodio (sal monosódica)135218.129.444
Gluconato de calcio (anhidro polvo)2.2430,40.947
Heptahidrato del sulfato de magnesio (MgCl2.6H2O)1.2246.50.296
Fosfato dipotásico (K2HPO4)2.4174.20.418
Fosfato monopotásico (KH2PO4)0.4136.10.054

Tabla 3: Composición de cloruro-libre amortiguada (solución stock B).

figure-protocol-2
Figura 2 : Posición del ratón durante la perfusión de la mucosa nasal. La figura ilustra el cojín de calentamiento (a) el voltímetro (b), el electrodo de referencia en el espacio subcutáneo en una extremidades (c), la proximal (d) y distales (e) salidas de la bomba peristáltica, la almohadilla (f), y la cama de la hoja (g). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. evaluación y manejo durante la prueba

  1. Preparar la instalación experimental.
    1. Para prevenir la hipotermia durante y después de la prueba, utilice dos almohadillas mantenidas a temperaturas fisiológicas, uno para la instalación de medición (18,8 x 37,5 cm; Figura 2 una) y el otro (15.5 x 15.5 cm) para el cuadro en el que se colocará el animal para la recuperación al final de la prueba.
    2. Encienda el equipo cargado con el software para captura de datos conectado a la impedancia de entrada alta datos memoria (> 1012Ω) y alta resolución (0,1 mV) voltímetro (figura 2b).
    3. Conecte los electrodos al voltímetro. Conectar el electrodo positivo de la medición el catéter nasal y el electrodo de referencia negativa para el catéter que se inserta en el espacio subcutáneo en un miembro trasero, como se muestra en la figura 2c.
    4. Sumergir las puntas de los electrodos en la mezcla de crema. Compruebe el valor del offset del electrodo inicial. Rechazar los electrodos Si el valor es mayor de (±) 2 mV (idealmente 0 mV).
    5. Encienda la bomba peristáltica e Inserte el tubo de la bomba en posición, como se ilustra en la figura 2.
    6. Conecte la salida proximal del tubo de la bomba al frasco que contiene la solución seleccionada para perfusión nasal (figura 2d). Conecte la salida distal del tubo de la bomba a la luz de la perfusión del catéter nasal (figura 2e).
    7. Llene un lumen del catéter nasal con mezcla de crema de electrolitos a través de una pipeta de 10 μl. Adaptar el catéter a un conector de tubo de silicona (figura 1e), llene el conector con la mezcla de crema e Inserte el electrodo positivo en el conector (fde lafigura 1). Compruebe el valor de desplazamiento de puente electrodo de medición. Rechazar los puentes si el valor es mayor de (±) 2 mV (idealmente 0 mV).
    8. Llene el segundo lumen del catéter nasal con solución fresca A1. Sumergir la punta del catéter nasal en el frasco que contenga solución inversa A. la dirección de la bomba peristáltica para cubrir una longitud de catéter nasal correspondiente a 10 s de perfusión.
      Nota: Esto permite registrar valores basales de PD por 10 s antes de aplicar el amiloride. Sumerja la punta del catéter nasal en la mezcla de crema dentro del conector del electrodo de referencia (figura 1).
  2. Comenzar a manejar el ratón.
    1. Registrar el peso del ratón para calcular la dosis exacta de anestesia para ser inyectada por vía intraperitoneal (ip)17.
    2. Utilizando una aguja de 26G (0.45 x 10 mm), inyectar premedicación por vía intraperitoneal para promover la inducción de la anestesia: una dosis fija de 50 μl de midazolam 5 mg/mL. Espere 5 minutos.
    3. Preparar la mezcla anestésica (fentanilo, medetomidina, droperidol en concentración final de 0.05 0.40 y 20 mg/kg de peso corporal respectivamente y clonidina a la dosis fija de 0,375 μg) permitiendo profundidad óptima y estable de la anestesia (etapa III, avión 2)17 . Inyectar el volumen de mezcla anestésica por vía intraperitoneal y luego inyectar el volumen de la clonidina.
      Nota: Después de 15 minutos, el ratón debe estar dormido y la anestesia puede durar al menos 30 minutos.
    4. Doblar una hoja de tejido para hacer una 3 cm ancho 'almohada' (figura 2f) que cubra la parte superior de la almohadilla de la calefacción (figura 2a) como un apoyo para la cabeza de ratón que absorbe.
    5. Cubrir la almohada con una lámina de absorción de tejido ('sábana'; Figura 2 g). Coloque el ratón sobre su parte posterior en la almohadilla de la calefacción. Cinta hacia fuera de las extremidades y la cola (figura 2).
    6. Inserte el catéter intravenoso de referencia (figura 1g) en el espacio subcutáneo de un miembro trasero. Retire la aguja y adaptar el conector del tubo de silicona (figura 1e, 2 c).
    7. Llene el catéter y el conector con la crema mezclar e Introduzca el electrodo negativo en el conector (fde lafigura 1).
    8. Fijar el catéter y el electrodo con cinta adhesiva según sea necesario para evitar cualquier desplazamiento. Después de la colocación de los puentes y electrodo de referencia, para comprobar el valor de desplazamiento de puente electrodo de medición otra vez sumergir la punta del catéter nasal en la mezcla de crema de electrodo dentro del conector del catéter IV. Registre el valor de offset final estable (idealmente menos de (±) 2 mV).
    9. Fijar el ratón orejas con la cinta "suave" en el cojín de calentamiento en un espacio libre entre las dos piezas de absorción del tejido ('almohada' (figura 2f) y 'sábana'; (Figura 2g)). Fijar los vibrissae (los pelos tiesos que crecen cerca de las fosas nasales) sin tocar los ojos.
    10. Para absorber el líquido de la cavidad oral, mover la lengua hacia los lados (figura 3a) e inserte una punta mecha de papel de filtro (el ' tubo'; Figura 3 b) alrededor de 1 cm en la boca. Para absorber el fluido funcionamiento de la fosa inundada, coloque un segundo pedazo de papel de filtro (el ' pañuelo'; Figura 3 c) llevó a cabo en la punta de la nariz.
    11. Compruebe un valor de control positivo del potencial epitelial colocando la punta del catéter nasal en contacto con el interior de la boca.
      Nota: La lectura debe ser estable y oscilan entre los -10 mV y -20 mV.
    12. Sujetándola con unas pinzas finas y bajo buena iluminación directa, introduzca delicadamente el catéter nasal en un orificio nasal hasta 4 - punta de 6 mm de la nariz.
      Nota: El catéter nasal de PD se encuentra en la concha nasal media en la posición que da la línea de base estable máxima PD valor17,20.
    13. 5 minutos después de la inyección de las drogas anestésicas, incline suavemente el cojín de calentamiento unos 30 ° con la cabeza del animal hacia abajo. Supervisar el valor de PD basal máximo.
    14. Cuando es estable durante un período de cerca de 30 s, Inicio perfundiendo la mucosa nasal, con una velocidad constante de 10 μl / min, con las soluciones tampón 4 (A, A1, B1, B2) en sucesión. Inundar la primera solución (paso 1.3.1.1) durante 10 s y cada siguiente solución (paso 1.4) durante 5 minutos o hasta alcanzar un valor estable. Parada perfundiendo forskoline (B2) cuando la respuesta transitoria forskoline comienza a bajar.
    15. Seleccione un intervalo de s 1 para registro de datos. Iniciar la grabación de datos en el momento de iniciar la perfusión. Mostrar los datos en función del tiempo en la pantalla del ordenador.
    16. Captura de datos parados al final de la perfusión con solución B2. Guardar los datos como un archivo de hoja de cálculo.
    17. Datos correctos restando el valor de desvío final.

figure-protocol-3
Figura 3 : Posición del ratón sobre el cojín de calentamiento con el catéter nasal y los papeles de filtro en lugar. La figura muestra la lengua poner hacia un lado (a), el tubo (b) y el pañuelo (c). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. la prueba de evaluación y gestión

  1. Suelte el ratón de la almohada.
  2. Limpiar la nariz del ratón con la 'sábana' (figura 2g).
  3. Inyectar por vía intraperitoneal la mezcla anestésica antagonista compuesta de una dosis fija (4 μg) de naloxona, un antagonista competitivo de la morfina y atipamezole, un antídoto específico de la medetomidina (2 mg/kg de peso corporal).
  4. Coloque el ratón sobre la almohada más pequeñas en el cuadro de recuperación hasta total recuperación, que generalmente se observa después de 1 a 2 h.
    Nota: En el laboratorio de la UCL, alrededor del 10% la mortalidad, principalmente relacionadas con broncoaspiración de soluciones de perfusión en la cavidad nasal durante la prueba, se observa independientemente del género o genotipo.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para ilustrar las anormalidades del transporte de iones característicos en la FQ, se realizaron mediciones PD nasal siguiendo el protocolo descrito en un ratón de F508del-CF y en un control de tipo salvaje del FVB/129 fondo genético de la colonia de Bruselas de Ratones detm1Eur 30de CFTR. Este modelo clínico relevante, albergar los más comunes y uno de los más graves F508del-CFTR mutación23,24

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El objetivo de este trabajo es describir un protocolo adecuado para la medición de PD nasal bajo perfusión continua de soluciones espontáneamente de respiración ratones por un periodo de tiempo necesario para probar la integridad de los transportadores de iones, principalmente CFTR y ENaC. Todos los pasos del protocolo han sido cuidadosamente optimizados para asegurar recuperación completa animal y buena calidad y datos reproducibles. En particulares, importantes pasos son evaluación de anestesia y manejo y adecuada posi...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen la Prof. J. Lebacq edición crítica del manuscrito. CFTRtm1Eur (ratones homocigóticos de F508del-CFTR (FVB/129) fueron desarrollados por el Erasmus MC, Rotterdam, los países bajos, con el apoyo de la Comunidad Económica Europea acción de coordinación europea para la investigación en Fibrosis Quística Unión Europea FP6 LHHM-CT-2005-018932.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de polietileno Portex Smiths Medical, Hythe, Kent, Inglaterra CT21 6JLPortex 800/100/500; 2,0 mm de diámetro interior, 3,0 mm de diámetro exteriorpara preparar tubos capilares para sonda nasal
Crema de electrodosParker, Fairfield, NJ, EE. UUCrema Reduxpara construir puentes de electrodos
Electrodos de Ag/AgClBiomedical, Clinton Township, MI, EE. UUJNS BNT131-1,0electrodos de medición y referencia
clorhidrato de amiloridaSigma, St Louis, MI, EE. UUA7410para preparar soluciones
forskolinSigma, St Louis, MI, EE. UUF6886para preparar soluciones de perfusión
Knick Portamessvoltímetro Elektronisch Meβ gerä te, Berlín, AlemaniaPortavo 904 pHpara medir la diferencia de potencial
Paraly SW 112 Software Elektronisch Meβ gerä te, Berlín, AlemaniaSoftware Paraly SW112para capturar datos de diferencia de potencial
midazolam Mylan, Hoeilaart, BélgicaDormicum 15 mg/3 mlpara servir como premedicación anestésica
fentaniloJanssen Cilag, Berchem, BélgicaFentanilo-Janssen 0,05 mg/mlpara servir como medicamento anestésico
medetomidinaOrion Pharma, Espoo, FinlandiaDomitor 1 mg/mlpara servir como medicamento anestésico
droperidol Janssen  Cilag, Berchem, BélgicaDehidrobenzperidol 2,5 mg/mlpara servir como medicamento anestésico
clonidina Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, AlemaniaCatapresán 0,15 mg/ml,la medicación anestésica
Becton Dickinson, Sandy, UT, EE. UU.24 GA x 0,75 IN, BD Insyte-Wpara construir pinzas de puentes de electrodos
 Herramientas de ciencia fina, Heidelberg, AlemaniaDumont # 5, Herramientas de ciencia finapara colocar el catéter nasal
naloxona  Braun Medical, Bruselas, BélgicaNarcan, 0,4 mg/mlpara servir como antagonista anestésico
atipamezole Zoetis, Bloomberg, BélgicaAntisedán, 5 mg/mlpara servir como antídoto específico para medetomedína 
Almohadillas térmicas Aparato Harvard, Holliston, MA, EE.UU18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cmpara evitar la hipotermia durante y después de la prueba
Bomba peristáltica P1GE Life Sciences, Uppsala, Suecia18111091para perfundir soluciones en la nariz del ratón
pegamento de cianoacrilatoLoctite, Henkel, Dü sseldorf, Alemania  Super Glue 3para pegar dos tubos capilares  para sonda nasal
NaClSigma, St Louis, MI, EE. UU.RES0926S-A7de grado farmacéutico, USP
CaCl2.2H2OSigma, St Louis, MI, EE. UUM7304de grado farmacéutico, USP
MgCl2.6H2OSigma, St Louis, MI, EE. UU. 1551128de grado farmacéutico, USP
K2HPO4Sigma, St Louis, MI, EE. UU. 1551139Grado farmacéutico, USP
Na gluconatoSigma, St Louis, MI, EE. UUS2054Grado farmacéutico, USP
Gluconato de CaSigma, St Louis, MI, EE. UUC8231Grado farmacéutico, USP
MgSO4.7H2OSigma, San Luis, MI, EE. UU. RES0089M-A7Grado farmacéutico,
aguja USP BD Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE.UUBD 26G (0,45x10 mm)inyección intraperitoneal
. . . de perfusión. para servir como catéter intravenoso de referencia para . . . . .

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knowles, M., Gatzy, J., Boucher, R. Increased bioelectric potential difference across respiratory epithelia in cystic fibrosis. New England Journal of Medicine. 305 (25), 1489-1495 (1981).
  2. Middleton, P. G., Geddes, D. M., Alton, E. F. W. Protocols for in vivo measurement of the ion transport defects in cystic fibrosis nasal epithelium. European Respiratory Journal. 7 (11), 2050-2056 (1994).
  3. Knowles, M. R., Paradiso, A. M., Boucher, R. C. In vivo nasal potential difference: techniques and protocols for assessing efficacy of gene transfer in cystic fibrosis. Human Gene Therapy. 6 (4), 445-455 (1995).
  4. Paranjape, S. M., Zeitlin, P. L. Atypical cystic fibrosis and CFTR-related disorders. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 35 (3), 116-123 (2008).
  5. Wilschanski, M., et al. A pilot study of the effect of gentamicin on nasal potential difference measurements in CF patients carrying stop mutations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 161 (3), Pt 1 860-865 (2000).
  6. Clancy, J. P., et al. Evidence that systemic gentamicin suppresses premature stop mutations in patients with CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 163 (7), 1683-1692 (2001).
  7. Wilschanski, M., et al. Gentamicin-induced correction of CFTR function in patients with CF and CFTR stop mutations. New England Journal of Medicine. 349 (15), 1433-1441 (2003).
  8. Sermet-Gaudelus, I., et al. In vitro prediction of stop-codon suppression by intravenous gentamicin in patients with CF: a pilot study. BMC Medicine. 5, 5(2007).
  9. Clancy, J. P., et al. No detectable improvements in CF transmembrane conductance regulator by nasal aminoglycosides in patients with CF with stop mutations. American Journal of Respiratory and Cell Molecular Biology. 37 (1), 57-66 (2007).
  10. Kerem, E., et al. Effectiveness of PTC124 treatment of CF caused by nonsensemutations: a prospective phase II trial. Lancet. 372 (9640), 719-727 (2008).
  11. Sermet-Gaudelus, I., et al. Ataluren (PTC124) induces CF transmembrane conductance regulator protein expression and activity in children with nonsense mutation CF. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (10), 1262-1272 (2010).
  12. Wilschanski, M., et al. Chronic ataluren (PTC124) treatment of nonsense mutation cystic fibrosis. European Respiratory Journal. 38 (1), 59-69 (2011).
  13. Accurso, F. J., et al. Effect of VX-770 in persons with CF and the G551D-CFTR mutation. New England Journal of Medicine. 363 (21), 1991-2003 (2010).
  14. Clancy, J. P., et al. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation. Thorax. 67 (1), 12-18 (2012).
  15. Leonard, A., Lebecque, P., Dingemanse, J., Leal, T. A randomized placebo-controlled trial of miglustat in cystic fibrosis based on nasal potential difference. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (3), 231-236 (2012).
  16. De Boeck, K., et al. CFTR biomarkers: time for promotion to surrogate end-point. European Respiratory Journal. 41, 203-216 (2013).
  17. Leal, T., et al. Successful protocol of anaesthesia for measuring transepithelial nasal potential difference in spontaneously breathing mice. Laboratory Animals. 40 (1), 43-52 (2006).
  18. Lubamba, B., et al. Preclinical evidence that sildenafil and vardenafil activate chloride transport in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (5), 506-515 (2008).
  19. Lubamba, B., et al. Airway delivery of low-dose miglustat normalizes nasal potential difference in F508del cystic fibrosis mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (11), 1022-1028 (2009).
  20. Lubamba, B., et al. Inhaled PDE5 inhibitors restore chloride transport in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 37 (1), 72-78 (2011).
  21. Vidovic, D., et al. rAAV-CFTRΔR Rescues the Cystic Fibrosis Phenotype in Human Intestinal Organoids and Cystic Fibrosis Mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 288-298 (2016).
  22. Stutts, M. J., et al. CFTR as a cAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269 (5225), 847-850 (1995).
  23. Lubamba, B., Dhooghe, B., Noel, S., Leal, T. Cystic fibrosis: insight into CFTR pathophysiology and pharmacotherapy. Clinical Biochemistry. 45 (15), 1132-1144 (2012).
  24. Kerem, B., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).
  25. Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4925), 1066-1073 (1989).
  26. Stutts, M. J., Rossier, B. C., Boucher, R. C. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inverts protein kinase A-mediated regulation of epithelial sodium channel single channel kinetics. Journal of Biological Chemistry. 272 (22), 14037-14040 (1997).
  27. Ismailov, I. I., et al. Regulation of epithelial sodium channels by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biological Chemistry. 271 (9), 4725-4732 (1996).
  28. Althaus, M. ENaC inhibitors and airway re-hydration in cystic fibrosis: state of the art. Current Molecular Pharmacology. 6 (1), 3-12 (2013).
  29. Wilke, M., et al. Mouse models of cystic fibrosis: phenotypic analysis and research applications. Journal of Cystic Fibrosis. 10, Suppl 2 152-171 (2011).
  30. Van Doorninck, J. H., et al. A mouse model for the cystic fibrosis delta F508 mutation. The EMBO Journal. 14 (18), 4403-4411 (1995).
  31. Colledge, W. H., et al. Generation and characterization of a delta F508 cystic fibrosis mouse model. Nature Genetics. 10 (4), 445-452 (1995).
  32. Zeiher, B. G., et al. A mouse model for the delta F508 allele of cystic fibrosis. Journal of Clinical Investigation. 96 (4), 2051-2064 (1995).
  33. Ghosal, S., Taylor, C. J., McGray, J. Modification of the nasal membrane potential difference with inhaled amiloride and loperamide in the cystic fibrosis (CF) mouse. Thorax. 51 (12), 1229-1232 (1996).
  34. Ghosal, S., Taylor, C. J., Colledge, W. H., Ratcliff, R., Evans, M. J. Sodium channel blockers and uridine triphosphate: effects on nasal potential difference in cystic fibrosis mice. European Respiratory Journal. 15 (1), 146-150 (2000).
  35. Leonard, A., et al. Comparative Variability of Nasal Potential Difference Measurements in Human and Mice. Open Journal of Respiratory Disease. 2, 43-56 (2012).
  36. Tannenbaum, J., Bennett, B. T. Russell and Burch's 3Rs then and now: the need for clarity in definition and purpose. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (2), 120-132 (2015).
  37. Pritchett-Corning, K. R., et al. AALAS/FELASA Working Group on Health Monitoring of rodents for animal transfer. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (6), 633-640 (2014).
  38. Salinas, D. B., et al. CFTR involvement in nasal potential differences in mice and pigs studied using a thiazolidinone CFTR inhibitor. American Journal of Physiology. Lung Cell Molecular Physiology. 287 (5), 936-943 (2004).
  39. Fisher, J. T., et al. Comparative processing and function of human and ferret cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Journal of Biological Chemistry. 287 (26), 21673-21685 (2012).
  40. Kaza, N., et al. Use of ferrets for electrophysiologic monitoring of ion transport. PLoS One. 12 (10), 0186984(2017).
  41. Leal, T., Beka, M., Panin, N., Mall, M. A., Noel, S. Nasal potential difference in βENaC-overexpressing mouse reveals pH-sensitive channel hyperactivity and shift of subunits stoichiometry. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (S1), 72(2017).
  42. Mall, M., Grubb, B. R., Harkema, J. R., O'Neal, W. K., Boucher, R. C. Increased airway epithelial Na+ absorption produces cystic fibrosis-like lung disease in mice. Nature Medicine. 10 (5), 487-493 (2004).
  43. Shah, V. S., et al. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice. Science. 351 (6272), 503-507 (2016).

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