Artículo de método

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

DOI:

10.3791/57941

⸱

17 de octubre de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Vascular Biology Research Centre, Westmead Hospital, 2Westmead Clinical School, Department of Surgery, The University of Sydney, 3Westmead Research Hub, Westmead Institute for Medical Research, 4Institute for Clinical Pathology and Medical Research, Westmead Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí presentamos un protocolo para la caracterización de subconjuntos de monocitos por citometría de flujo de sangre. Esto incluye delineando cómo los subconjuntos de la puerta y evaluar su expresión de marcadores de superficie y dando un ejemplo de la evaluación de la expresión de marcadores de M2 (antiinflamatorio) y M1 (inflamatoria).

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los monocitos son colaboradores claves en diversos trastornos inflamatorios y alteraciones en estas células, incluyendo sus funciones y proporciones subconjunto pueden tener significación patológica. Un método ideal para examinar alteraciones de monocitos es citometría de flujo de la sangre como la mínima manipulación de las muestras por este método limita la activación de la célula artifactual. Sin embargo, muchos enfoques diferentes son llevados a los subconjuntos de monocitos hacia la identificación incompatible de los subconjuntos entre los estudios de la puerta. Aquí se demuestra un método mediante citometría de flujo de sangre para identificar y caracterizar subconjuntos de monocitos humanos (clásicos, intermedios y no clásica). Nos indican cómo preparar las muestras de sangre por citometría de flujo, los subconjuntos (Asegúrese de que se han eliminado las células contaminantes) de la puerta y determinar monocito subconjunto expresión de marcadores de superficie, en este ejemplo M1 y M2 los marcadores. Este protocolo puede ampliarse a otros estudios que requieren un método bloquea estándar para evaluar proporciones de subconjunto de monocito y monocitos subconjunto expresión de otros marcadores funcionales.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los monocitos son un tipo de glóbulos blancos que juegan un papel importante en la promoción y resolución de la inflamación. Hay tres subconjuntos principales de monocitos reconocidos, clásicos (~ 85%), intermedio (~ 5%) y monocitos (~ 10%) no clásicas que se caracterizan por su nivel de cluster de diferenciación (CD) 14 y expresión de CD161. Las proporciones de subconjuntos de monocitos pueden diferir con la presencia de la enfermedad, una proporción mayor de productos intermedios en diversos Estados inflamatorios2,3 incluyendo enfermedad cardiovascular, donde el nivel de intermedios es asociado con eventos clínicos4,5. Además, en condiciones de enfermedad, monocitos pueden también sufrir cambios funcionales, con muchos cambios detectables por una diferencia en el marcador superficial expresión6,7. Un ejemplo es el monocito sesgar M1, un aumento de marcadores asociados con los macrófagos M1, que se ha observado en enfermedades cardiovasculares, diabetes, obesidad y síndrome metabólico7,8,9 , 10.

A pesar de la popularidad de citometría de flujo para evaluar la función y la proporción de monocitos subconjunto, existe una variabilidad considerable en la preparación de la muestra y el subconjunto que bloquean entre los estudios que hace difícil comparar los resultados entre estos estudios. Lo importante, no existe un consenso en la demarcación de subconjuntos de monocitos, pero un enfoque estandarizado es esencial dada la importancia clínica de los cambios en proporciones de subconjunto en varias enfermedades. Parte de la dificultad de sincronización surge del hecho de que monocitos diferencian desde el clásico a través de la intermedia al subconjunto no clásica11 y como tal, monocitos existen como un espectro continuo en vez de poblaciones distintas12 . Interesante, Zawada et al demostró que utilizando ya sea una rectangular o trapezoidal que bloquean del subconjunto intermedio, resultó en un subconjunto más intermedio que predijo un endpoint cardiovascular13. Esto pone de relieve que, al menos para el cálculo de proporciones, la cuestión clave es aplicar una estrategia bloquea consistente entre diferentes muestras (estudios), en lugar de intentar discriminar definitivamente entre subconjuntos. Mientras que bloquean definitivo puede ser más importante al evaluar la función, el cambio en la expresión del marcador entre subconjuntos es incremental12,14, y así otra vez, consistencia en la compuerta sea clave. Como tal, se necesita un objetivo método reproducible adjudica los subconjuntos de monocitos entre diferentes muestras que bloquean. El propósito del método presentado aquí es subconjuntos de monocitos con una clara explicación de la puerta y justificación de la técnica bloquea empleadas y evaluar los subconjuntos para la expresión del marcador superficial, proporcionando un método que permite a los investigadores que confianza en el uso de esta técnica al evaluar diferentes muestras.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio ha sido aprobado por el Comité de ética de investigación humana WSLHD (HREC) (aprobación AU rojo HREC/15/WMEAD/289).

1. preparación para citometría de flujo de sangre

Nota: Como sangre humana potencialmente infecciosa, el montaje de la muestra debe realizarse en una campana de biohazard.

  1. Recoger las muestras de sangre de los participantes en tubos con 3 mL etileno diamina tetra acético (EDTA).
  2. Determinar el número de glóbulos blancos (WBC) utilizando un analizador de la hematología o hemocitómetro.
  3. Diluir con tampón fosfato salino (PBS) (pH ~ 7.4) para ajustar la concentración a ~ 5 x 10 6/mL WBC.
  4. Preparar mezcla principal suficiente para el número de tubos (por ejemplo, para tubos de 14 preparar 16 x mix master) combinando 16 x volúmenes de sangre μl 50, 0,75 μl anti CD14-V450, 0,5 μl anti CD16-APC y 0,625 μl anti HLA-DR-PerCP. Vórtice y pipeta 51,9 μl de la mezcla en cada tubo (tabla 1).
    Nota: Anticuerpos deben titularse para determinar concentraciones de tinción óptima para los anticuerpos fluorescentes utilizados.
  5. Añadir marcador superficial (control M1 y M2 o isotipo, ficoeritrina (PE) etiquetado) anticuerpos (ejemplo según tabla 2) y PE etiquetado marcadores de células T (CD3), linfocitos B (CD19), neutrófilos (CD66b) y células de asesino natural (NK) (CD56) (tabla 3). Vortex e incubar por 30 min, 4 ° C en la oscuridad.
    Nota: Los marcadores de los linfocitos, neutrófilos y células NK se incluyen sólo para la validación del método bloquea.
  6. Añadir 250 μl de solución de fijación combinado glóbulos rojos leucocitos lisis, vortex suavemente inmediatamente e incubar por 10 min en la oscuridad a 4 ° C.
  7. Añadir 250 μl de PBS y vuelta células abajo a 260 x g por 10 min a temperatura ambiente.
  8. Eliminar el sobrenadante, resuspender las células en 300 μL de formaldehído al 1%.
    Nota: El formaldehído es tóxico. Use guantes de nitrilo y en campana.
  9. Almacenar a 4 ° C protegido de la luz hasta que se realizaron el análisis.
    Nota: Análisis de flujo se recomienda realizarse dentro de las 48 h de preparación de la muestra.

2. citometría de flujo

  1. Verificar registro de citómetro de flujo para personal de la institución han realizado controles de calidad.
    Nota: Para garantizar la coherencia entre el análisis, control de calidad de instrumentos y mantenimiento constante se recomiendan intensidades de fluorescencia blanco con perlas de control.
  2. Para configurar el experimento de citometría de flujo, haga clic en "nuevo experimento entonces"nueva muestra"y"nuevo tubo"para agregar tubos. Seleccionar parcelas bivariados haciendo clic en el icono y utilice los menús desplegables para seleccionar los parámetros de eje. Garantizar la inclusión de una parcela de CD16/CD14 y un diagrama mostrando un detector junto a tiempo para supervisar la adquisición.
  3. Inserte el tubo y haga clic en "Adquirir". Compruebe los ajustes del voltaje del instrumento asegurando que las señales del detector no son escala.
  4. Observar las células en la puerta del monocito de la trama de CD14/CD16. Ajuste umbral de grabación a 5.000 eventos para la puerta clásica monocito y clic en "Registro".
  5. Siguen datos de registro para los tubos restantes. Después de que se ha registrado datos para todos los tubos, exportar datos de flujo como .fcs archivos de análisis.
    Nota: Para asegurar la precisión, controles de compensación de color solo deben registrarse. Una matriz de compensación puede ser calculada y aplicada a los datos antes del análisis para tener en cuenta derrame espectral sobre15,16.

3. monocitos Gating

  1. Abrir archivos en el software de análisis. Haga doble clic en nombre del tubo y seleccionados parámetros desde el menú desplegable para visualizar las células en un área de dispersión hacia adelante FSC (A) reenviar la trama de FSC(H) de altura de dispersión. Crear una puerta de exclusión doblete haciendo clic en el icono de la herramienta de polígono puerta y adjuntando las células como en la (figura 1A).
  2. Seleccione las celdas cerradas (haciendo doble clic sobre la región cerrada) en la nueva pantalla de caja ajuste de parámetros del menú desplegable para mostrar las celdas de un FSC (A) y diagrama de dispersión lateral SSC(A). Haga clic en el icono rectangular puerta y generosamente seleccionar la población de monocitos basada en las propiedades de dispersión hacia delante y lateral para excluir a la mayoría de los linfocitos, las células NK y los granulocitos (figura 1B).
  3. Seleccione las celdas cerradas y volver a mostrar en una parcela de CD14/CD16, seleccionando los parámetros usando los menús desplegables. Haga clic en la puerta del polígono para seleccionar monocitos basados en su forma característica "┐" (figura 1).
  4. Seleccione las celdas cerradas y mostrar los monocitos en una parcela de CD16/HLA-DR usando los menús desplegables para seleccionar parámetros. Haga clic en la puerta del polígono para seleccionar las células del positivo HLA-DR y excluir cualquier restante NK neutrófilos y células17 (figura 1).
  5. Seleccione las celdas cerradas y mostrar las células del positivo HLA-DR en una parcela de CD14/HLA-DR con menús desplegables para seleccionar parámetros. Haga clic en la puerta de la poligonal y dibuja una puerta para excluir el HLA-DR alta/CD14 bajo las células (linfocitos B expresan altos niveles de HLA-DR pero no CD14) (Figura 1E).
    Nota: contaminación de células B puede ocurrir y por lo tanto deben ser investigada. Si la población no clásica en la figura 1 no es distinta de las células a su izquierda, es probable la contaminación. Paso 3.5 puede omitirse si las células de B no se solapan con monocitos no clásica.
  6. Seleccione las celdas cerradas y utilizar menús desplegables para mostrar en una parcela de CD16/CD14. Seleccione opciones de trama de la "Trama de cebra" que permitirá a puertas de subconjunto de monocitos que se adopte para determinar proporciones de subconjunto (Figura 1F).
    Nota: si trama de cebra está disponible en el software de análisis, pseudo color (liso) o trama de contorno puede ser adecuado.
  7. Haga clic en el icono rectangular puerta y seleccione los monocitos clásicos dibujando una puerta rectangular aproximada en la población de alta/CD16 bajos, clásico monocitos CD14. En "Pantalla" seleccione "Mostrar medias" para mostrar la intensidad de fluorescencia media para monocitos clásicos. Ajustar la puerta de tal manera que la población tiene una distribución igual de la mediana en la izquierda y derecha que abarca todas las celdas a la izquierda.
  8. Seleccione la población intermedia por una puerta rectangular que engloba a las células a la derecha de la puerta clásica de dibujo. Ajustar la parte inferior de la puerta para excluir las células no clásicas por alinear la puerta con la parte inferior de los círculos concéntricos que están completamente dentro de la puerta clásica de monocitos, que asegura que la parte intermedia tiene una expresión de CD14 comparable a la principal población clásica consistente con la nomenclatura actual.
  9. Puerta el subconjunto no clásicas dibujando una caja rectangular hacia abajo desde el borde inferior de la parte intermedia, seleccionar todas las celdas en la parte inferior de la población (Figura 1F).
  10. En "Pantalla" seleccione "Mostrar frecuencias de puerta" para determinar el porcentaje de cada subconjunto de monocitos.

4. validación del método que bloquean

  1. Para determinar si los tipos de células potencialmente contaminantes están efectivamente cerrada, primero identificar diferentes poblaciones celulares con anticuerpos contra las células T (CD3), linfocitos B (CD19), neutrófilos (CD66b) y las células NK (CD56) (figura 2).
    Nota: Aquí T células neutrófilos no se siente cerca de la forma "┐" de monocitos y está cerrados hacia fuera en la figura 1.
  2. Confirman que las células NK se quitan en el paso 3.4 (figura 1), y las células de B se quitan en el paso 3.5 (Figura 1E) como se muestra en la figura 3. Si las células NK o células de B no fuera cerrada, vuelva a ajustar las puertas.

5. expresión de marcadores de monocitos fenotípica

  1. Seleccione celdas de cada subconjunto de monocitos. Modificar parámetros de lista desplegable para crear un histograma para cada subconjunto de monocitos (Figura 1F) mostrando cada marcador y su isotipo que empareja (figura 4).
  2. Calcular el grado de expresión de cada marcador (mediana o media geométrica) en comparación con el control de isotipo correspondiente.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La estrategia bloquea monocito y el análisis de citometría de flujo utilizada aquí (figura 1) con éxito Country los subconjuntos de monocito y revelaron sus proporciones relativas. Se calcularon las proporciones (para este ejemplo) como clásicos de 88.1%, intermedios de 4.33% y 7.49% no-clásicos. Estas puertas de subconjunto no fueron contaminadas con células B, células T, neutrófilos o células NK, que fue confirmada con los marcadores CD19, CD3, CD56 y CD66b, respectivamente. Mediante la evaluación de la posición relativa de otras poblaciones, resulta claro que las células T y los neutrófilos caen fuera de la forma de monocitos "┐" en una parcela de CD16/CD14 (figura 2A y 2D). Sin embargo, las poblaciones de células B y las células NK se traslaparon con la población de monocitos no clásica (figura 2B y 2C). Los pasos de la estrategia de bloquea (figura 1 y 1E) confirmaron a excluir las células de B (figura 3B) y las células NK (Figura 3A). Aunque la población de células B incluye una pequeña porción de monocitos no clásica, la cantidad es insignificante.

Después de haber cerrado los subconjuntos, el grado en que expresaron diferentes marcadores de superficie, M1 (CD64, CD86 y CD120b) y M2 (CD163, CD11b y CD93) fue evaluada. Los marcadores mostraron expresión positiva en comparación con sus correspondientes controles de isotipo, como se ve por el cambio de los histogramas (figura 4). La mediana de los marcadores fue mayor que la de los controles de isotipo.

Aplicación de esta estrategia bloquea a una muestra de sangre, que se dividió en cuatro tubos, teñido y había analizado por separado, los resultados comparables los rendimientos entre tubos (tabla 4).

Diagramas de dispersión de citometría de flujo; clasificación de células inmunitarias; diagrama; marcadores de CD; Análisis de subpoblaciones.
Figura 1: monocito representante gating estrategia en sangre entera humana. (A) FSC(A) vs FSC(H) parcela: que bloquean las células que tienen un igual área y altura, eliminando así Matas (mayor FSC(A) FSC(H)) y escombros (muy bajo FSC) K = 1000. (B) FSC(A) vs SSC(A) parcela: amplia selección de monocitos basado en sus propiedades SSC/FSC. (C) CD16 vs CD14 parcela: compuerta para seleccionar monocitos basado en su forma característica "┐". (D) CD16 vs HLA-DR parcela: bloquea para seleccionar las células positivas de HLA-DR y eliminar las células NK. (E) CD14 vs HLA-DR: bloquea a excluir las células de B (HLA-DR alta/CD14 bajo) de los monocitos. (F) seleccionado vuelve a aparecer en CD16 vs CD14 parcela a puerta los subconjuntos de monocitos monocitos. A-F color representa la densidad celular con azul y verde que indica baja densidad, rojo y naranja que indica alta densidad y naranja que indica la densidad de la gama media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Diagramas de citometría de flujo de diferenciación de células inmunitarias: células T, B, NK, neutrófilos; Marcadores de CD.
Figura 2: validación de bloquear la estrategia de identificación de contaminantes potencialmente células. Las células potencialmente contaminantes se identifican mediante marcadores (A) T células (CD3), linfocitos (B) B (CD19), células (C) NK (CD56) y (D) neutrófilos (CD66b). Los paneles del lado izquierdo Mostrar identificación de cada población después de compuerta según figura 1A y 1B, con el color que representa la densidad celular de alta (rojo) a baja (azul). Los paneles de la derecha muestran cada población celular (azul) superpuesta a la trama de CD16/CD14 monocitos final para revelar la proximidad de estas poblaciones de monocitos (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Análisis de citometría de flujo; diagramas de dispersión de monocitos, NK y células B por marcadores CD, distribución de datos.
Figura 3: confirmación que bloquea pasos eliminar células contaminantes. Calor mapas que muestren el grado de expresión de alta (rojo) a baja (azul) de CD56 (A) y (B) CD19. Pasos bloquea con éxito excluyen las células con alta CD56 (células NK) y alta CD19 (linfocitos B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Gráficos de citometría de flujo; marcadores M1, M2; Fenotipos de macrófagos: clásico, intermedio, no clásico.
Figura 4: expresión del monocito de M1 (CD120b) y M2 (CD93) marcadores. Alisado histogramas de monocito M1 y M2 marcador expresión (azul), mostrando claro cambio del isotipo (rojo) para (A) clásicos, productos intermedios (B) y (C) no-clásicos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

AnticuerpoVolumen (sangre de 50 μL)Sangre de 800 μl de volumen (x 16)
CD14 - V4500.75 ΜL12 ΜL
CD16 - APC0.5 ΜL8 ΜL
HLA-DR-PerCP0,625 ΜL10 ΜL

Tabla 1: Anticuerpos para el flujo de sangre y mezcla principal.

TuboAnticuerpos de PECódigoPartido de isotipoConcentración stockVolumen de trabajo
1IgG1BD (555749)NA1,0 μg/20 μl0,625 ΜL
2CD163BD (556018)BD IgG10.125 μg/20 μl5 ΜL
3CD64BD (558592)BD IgG10.06 μg/20μL10 ΜL
4IgG1BD (555749)NA1,0 μg/20 μl1.25 ΜL
5CD86BD (555658)BD IgG11,0 μg/20 μl1.25 ΜL
6CD11bBD (561001)BD IgG11,0 μg/20 μl1.25 ΜL
7IgG2aR & D (IC003P)NA25 μg/mL5 ΜL
8CD120b (TNFRII)R & D (FAB226P)R & D IgG2a25 μg/mL5 ΜL
9IgG1BL (400112)NA0,2 mg/mL2,5 ΜL
10CD93BL (336108)BL IgG150 μg/mL1.25 ΜL

Tabla 2: M1/M2-PE fluorocromo había etiquetado anticuerpos monoclonales para el flujo de sangre.

TuboAnticuerpoVolumen de trabajo
11CD35 ΜL
12CD195 ΜL
13CD66b1.25 ΜL
14CD565 ΜL

Tabla 3: Fluorocromo PE había etiquetado anticuerpos monoclonales para linfocitos (células T, células B), neutrófilos y células NK.

Tubo% Clásico% Intermedio% No clásico
184.35.1110.1
284.25.0510.5
384.35.0310.7
481,65.0312.1

Tabla 4: Proporciones de subconjunto de monocitos de una sangre muestra teñidas y analizadas por separado.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Citometría de flujo de la sangre total es un enfoque ideal para el estudio de monocitos, las células se examinan en condiciones cerca de su microambiente fisiológico proporcionando una visión de su papel en la infección y condiciones inflamatorias. Además, el uso de frescos (es decir, sin procesar) las muestras de sangre minimiza las alteraciones o transformaciones celulares que pueden ocurrir debido al almacenamiento o manejo de18,19, como los que se sabe para ocurrir con monocitos de congelar-descongelar 20. preparación de la muestra pronto se recomienda como algunos marcadores son upregulated si las muestras se mantienen a temperatura ambiente antes de procesar19. Las concentraciones óptimas de marcadores M1 y M2 se determinaron por titulación, y esto debe hacerse para que cualquier nuevo anticuerpo limitar la fijación no específica mientras que asegurar que el grado de cambio debido a la expresión del antígeno y no restringido por falta de anticuerpos. La eliminación de glóbulos rojos y la fijación de las células blancas de la sangre con solución de lisis es un paso importante en este protocolo como la presencia de glóbulos rojos puede interferir con el flujo cytometry21,22. Tenga en cuenta que mientras que algunas soluciones de lisis son compatibles con la coloración no lave, poblaciones más claras son evidentes en nuestras manos cuando se utiliza un paso de lavado.

Configuración correcta de la citometría de flujo también es crítico al comparar la expresión de marcadores de monocitos. Se recomienda que los investigadores mantienen intensidades de fluorescencia blanco consistente de cuentas de control y realizan control de calidad en el instrumento a utilizarse para proporcionar resultados consistentes a través de diferentes muestras correr en días diferentes. Además, controles de isotipo se utilizan para ayudar en la interpretación de cualquier señal de fondo no específica generada por Unión de anticuerpos no específicos. Monocitos tienen altos niveles de receptores de Fc11 y por lo tanto son propensos a la Unión no específica. De nota, el nivel de fijación no específica difiere para los distintos subconjuntos, y así el uso de un control de isotipo se convierte en importante cuando se compara el grado de expresión de marcador entre subconjuntos.

Otro criterio importante a considerar es el bloquea empleado. Algunos estudios sugieren que es crucial establecer una puerta firmemente alrededor de los monocitos población en FSC(A)/SSC(A) complot para deshacerse de la mayoría de los no-monocytic CD16 células positivas23,24,25, pero esto puede conducir a la pérdida de algunos monocitos, células de monocitos no pueden traslaparse con monocitos en FSC/SSC parcelas26. Por el contrario, para excluir otras células de sangre que pueden contaminar los monocitos, la inclusión de un tercer marcador de monocitos CD14 y CD16, es esencial26,27. Por esta razón, HLA-DR se utiliza a menudo y es ideal ya que no es expresado por NK células o neutrófilos17,28. Aunque los linfocitos (células B y células T) pueden expresar HLA-DR, se diferencian de los monocitos en respeto a la expresión de CD14. Mientras que el HLA-DR es un marcador ideal de tercera, CD86 también ha recomendado5,27,29 pero no fue utilizado aquí es también un marcador M1 y así se evaluó su grado de expresión en subconjuntos de monocitos.

Validación de la estrategia bloquea utilizada es de vital importancia. Mientras que las células NK son conocidas se superponen a los clásicos no si no están cerradas a28, nos damos cuenta de que las células B también pueden traslaparse con los no clásicos (figura 2B); Si este es el caso en otros estudios pueden depender la elección de fluorocromo, configuración del equipo, sensibilidad del detector o incluso la condición de la enfermedad siendo examinada. Aquí, la superposición B células mostraron alta expresión de HLA-DR y no se fuera por la selección de las células positivas de HLA-DR en la figura 1. Más bien, para eliminar las células B se utilizó una trama adicional de CD14 / HLA-DR, donde las células de B separan hacia fuera no clásicos debido a su mayor HLA-DR y baja expresión de CD14.

También hay muchas maneras en que las puertas de los monocitos se han visto atraídas en la literatura; Estos incluyen cuadrantes (los subconjuntos están separados por marcadores de cuadrante) y cajas rectangular o trapezoidal13 (con cajas separadas para cada subconjunto), que además difieren en su colocación delinear donde un subconjunto termina y empieza otro. Estas diferencias probablemente reflejan el hecho de que los monocitos existen como un continuo de células, diferenciando desde clásico a no clásica, en lugar de poblaciones claramente distintas. Sin embargo, debido a las variaciones en las técnicas para la identificación de los subconjuntos se pueden llevar a diferencias en las proporciones de subconjunto de monocito calculado, es importante que el método bloquea es razonablemente objetiva más que subjetiva, como esto que el método más robusta y reproducible. Algunos estudios usan un control de isotipo para CD16 para determinar la frontera entre los subconjuntos clásicos e intermedios30. Por otra parte, para definir la separación entre productos intermedios y no clásicos, se ha propuesto que la línea de corte puede ser vertical u oblicua, con la opción hasta los investigadores, la salvedad de que debe ser reproducible, pero una puerta rectangular se ha recomendado para facilitar las comparaciones entre estudios13,30,31. Aquí, mayor objetividad fue obtenida por trazar los datos en una trama de cebra y aplicación de las normas visuales objetivas, porque parcelas de zebra proporcionan un cue de visualización adicional mezclando degradado de color a cada bin igual probabilidad sobre una parcela de contorno tradicional. El borde derecho del subconjunto clásico se señaló que la población se distribuye uniformemente alrededor de la mediana de la población. La división entre los intermediarios y no clásicos también fueron estandardizada por tener la base de los productos intermedios se alinean con la parte inferior de los círculos concéntricos dentro de la población clásica (es decir, la población intermedia claramente expresa altos niveles de CD14, según la nomenclatura estándar1).

Mientras que algunos estudios han sugerido el uso de marcadores adicionales, tales como C-C chemokine receptor tipo 2 (CCR2) o 6-sulfo LacNAc (SLAN) para la obtención exitosa enumeración de monocitos y revelar su significación clínica32,33 , en nuestras manos el nivel de expresión de los marcadores funcionales de muchos monocitos varía ampliamente entre individuos14. Dicha variación puede limitar la utilidad de estos marcadores para definir subconjuntos basados en su expresión. Enfoques computacionales automatizados también se han utilizado para visualizar y cluster subconjuntos de monocito incluyendo visual interactivo estocástico vecino incrustación (viSNE), t-distribución estocástica vecino incrustación (tSNE) o progresión de Spanning-tree Análisis de eventos normalizado de densidad (espada)34,35, que puede proporcionar una representación visual de las células basadas en el conjunto de múltiples marcadores utilizados. Mientras que esto se ha demostrado para aumentar la precisión de la estrategia bloquea en clasificación de subconjunto de monocitos, es reconocido que un inconveniente es la cantidad de anticuerpos (y canales de fluoróforo correspondientes). Su utilidad dependerá de las preguntas se formulan; la complejidad adicional puede no estar justificada, por ejemplo, en estudios de enumeración.

Cerrada con nuestra técnica de monocitos muestran proporciones en consonancia con la literatura y la expresión de marcadores de superficie de los tres subconjuntos puede ser fácilmente determinada. En general, la técnica y la metodología explicada aquí proporciona un método estandarizado y sencillo de enumeración proporciones de subconjunto de monocitos y la evaluación de expresión superficial del marcador, que puede ampliarse para incluir otros marcadores, así, de tal modo validar sus papeles funcionales en varias otras condiciones.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Citometría de flujo se realizó en las instalaciones de centrales de citometría de flujo que es apoyado por el Instituto de Westmead para médico investigación, Westmead Hub, cáncer Instituto de investigación New South Wales y nacional de salud y Consejo de investigación médica. Este estudio fue apoyado por el fondo de educación e investigación de química clínica.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Kit de extracción de sangre BD vacutainerBecton Dickinson 367286
BD vacuitainer K2E 5.5 mg más tubos de extracción de sangre -3.0 mLBecton Dickinson7128959
Solución salina tamponada de fosfato (PBS)Lonza17-516F
5ml tubo FACS de poliestireno de fondo redondo (estilo 12 mm x 75 mm)Tecnologías Invitro352054
V450 Anticuerpo CD14 antihumano para ratones [Mφ P9]BD Biosciences560349
APC Anticuerpo monoclonal anti-CD16 para ratones [3G8]Abcam Australiaab140477
Por CP Anticuerpo anti-HLA-DR humano [L243]BioLegend307628
PE Ratón IgG1 κ Control de Isotipo [MOPC-21]BD Biosciences555749 Lote # 4283901
Ratón PE Anticuerpo CD163 Antihumano [GHI/61]BD Biosciences556018 Lote # 2335626
Ratón PE Anticuerpo CD64 Antihumano [10.1]BD Biosciences558592Lote # 36768
Ratón PE Anticuerpo CD86 Antihumano [2331 (FUN-1)]BD Biosciences555658Lote # 3109766
Ratón PE Anti-humano Anti-humano CD11b/Mac-1 Anticuerpo [ ICRF44]BD Biosciences561001Lote # 3228959
Ratón PE IgG2A Control de isotipo [20102]R& D SystemsIC003PLote # 1212031
PE TNF humano RII/TNFRSF1B Anticuerpo [22235]R& D SystemsFAB226P lote # 612051
ratón PE IgG1, κ Control de Isotipo [MOPC-21]BioLegend400112Lote # B220359
PE Anticuerpo CD93 Antihumano [VIMD2]BioLegend336107Lote # B143544
Ratón PE Anticuerpo anti-CD3 humano [SK7]BD Biosciences347347Lote # 3010929
Ratón PE Anticuerpo CD19 Anti-Humano [HIB19]BD Biosciences561741Lote # 2307721
Ratón PE Anticuerpo anti-humano CD56 [B159]BD Biosciences561903Lote # 3011796
PE Anticuerpo CD66b humano [G10F5]BioLegend305105Lote # B154037
OptiLyse CBeckman CoulterA11895
Solución de formaldehído 37%SigmaF1635
BD FACSCanto II Citómetro de flujoBD Biosciences
hematología, XT-1800iCentrífuga Sysmex
GS-6RBeckman
Flowjo software v10.0.7Tree Star Inc
Analizador automático de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  2. Rossol, M., Kraus, S., Pierer, M., Baerwald, C., Wagner, U. The CD14(bright) CD16+ monocyte subset is expanded in rheumatoid arthritis and promotes expansion of the Th17 cell population. Arthritis & Rheumatism. 64 (3), 671-677 (2012).
  3. Wildgruber, M., et al. The "Intermediate" CD14++CD16+ monocyte subset increases in severe peripheral artery disease in humans. Scientific Reports. 6, 39483(2016).
  4. Heine, G. H., et al. Monocyte subpopulations and cardiovascular risk in chronic kidney disease. Nature Review Nephrology. 8 (6), 362-369 (2012).
  5. Rogacev, K. S., et al. CD14++CD16+ monocytes independently predict cardiovascular events: a cohort study of 951 patients referred for elective coronary angiography. Journal of the American College of Cardiology. 60 (16), 1512-1520 (2012).
  6. Bories, G., et al. Impaired alternative macrophage differentiation of peripheral blood mononuclear cells from obese subjects. Diabetes and Vascular Disease Research. 9 (3), 189-195 (2012).
  7. Fadini, G. P., et al. An unbalanced monocyte polarisation in peripheral blood and bone marrow of patients with type 2 diabetes has an impact on microangiopathy. Diabetologia. 56 (8), 1856-1866 (2013).
  8. Satoh, N., et al. Unbalanced M1/M2 phenotype of peripheral blood monocytes in obese diabetic patients: effect of pioglitazone. Diabetes Care. 33 (1), 7(2010).
  9. Chen, X., Devaraj, S. Monocytes from metabolic syndrome subjects exhibit a proinflammatory M1 phenotype. Metabolic Syndrome and Related Disorders. 12 (7), 362-366 (2014).
  10. Williams, H., et al. Human classical monocytes display unbalanced M1/M2 phenotype with increased atherosclerotic risk and presence of disease. International Angiology. 36 (2), 145-155 (2017).
  11. Wong, K. L., et al. Gene expression profiling reveals the defining features of the classical, intermediate, and nonclassical human monocyte subsets. Blood. 118 (5), e16-e31 (2011).
  12. Hijdra, D., Vorselaars, A. D., Grutters, J. C., Claessen, A. M., Rijkers, G. T. Phenotypic characterization of human intermediate monocytes. Frontiers in Immunology. 4, 339(2013).
  13. Zawada, A. M., et al. Comparison of two different strategies for human monocyte subsets gating within the large-scale prospective CARE FOR HOMe Study. Cytometry Part A. 87 (8), 750-758 (2015).
  14. Patel, V. K., Williams, H., Li, S. C. H., Fletcher, J. P., Medbury, H. J. Monocyte inflammatory profile is specific for individuals and associated with altered blood lipid levels. Atherosclerosis. 263, 15-23 (2017).
  15. Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 72 (1), 8-13 (2007).
  16. Szaloki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 87 (11), 982-985 (2015).
  17. Abeles, R. D., et al. CD14, CD16 and HLA-DR reliably identifies human monocytes and their subsets in the context of pathologically reduced HLA-DR expression by CD14(hi) /CD16(neg) monocytes: Expansion of CD14(hi) /CD16(pos) and contraction of CD14(lo) /CD16(pos) monocytes in acute liver failure. Cytometry Part A. 81 (10), 823-834 (2012).
  18. Mukherjee, R., et al. Non-Classical monocytes display inflammatory features: Validation in Sepsis and Systemic Lupus Erythematous. Scientific Reports. 5, 13886(2015).
  19. Lundahl, J., Halldén, G., Hallgren, M., Sköld, C. M., Hed, J. Altered expression of CD11b/CD18 and CD62L on human monocytes after cell preparation procedures. Journal of Immunological Methods. 180 (1), 93-100 (1995).
  20. Appleby, L. J., et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets. Immunology Letters. 152 (1), 32-41 (2013).
  21. Dagur, P. K., McCoy, J. P., et al. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells. Current protocols in cytometry. Robinson, J. P. 73, 5.1.1-5.1.16 (2015).
  22. Einwallner, E., et al. Lysis matters: Red cell lysis with FACS Lyse affects the flow cytometric enumeration of circulating leukemic blasts. Journal of Immunological Methods. 390 (1), 127-132 (2013).
  23. Tsujioka, H., et al. Impact of Heterogeneity of Human Peripheral Blood Monocyte Subsets on Myocardial Salvage in Patients With Primary Acute Myocardial Infarction. Journal of the American College of Cardiology. 54 (2), 130-138 (2009).
  24. Autissier, P., Soulas, C., Burdo, T. H., Williams, K. C. Immunophenotyping of lymphocyte, monocyte and dendritic cell subsets in normal rhesus macaques by 12-color flow cytometry: Clarification on DC heterogeneity. Journal of Immunological Methods. 360 (1), 119-128 (2010).
  25. Hristov, M., Schmitz, S., Nauwelaers, F., Weber, C. A flow cytometric protocol for enumeration of endothelial progenitor cells and monocyte subsets in human blood. Journal of Immunological Methods. 381 (1-2), 9-13 (2012).
  26. Zawada, A. M., et al. Monocyte heterogeneity in human cardiovascular disease. Immunobiology. 217 (12), 1273-1284 (2012).
  27. Zawada, A. M., et al. SuperSAGE evidence for CD14++CD16+ monocytes as a third monocyte subset. Blood. 118 (12), e50-e61 (2011).
  28. Heimbeck, I., et al. Standardized single-platform assay for human monocyte subpopulations: Lower CD14+CD16++ monocytes in females. Cytometry Part A. 77 (9), 823-830 (2010).
  29. Rogacev, K. S., et al. Monocyte heterogeneity in obesity and subclinical atherosclerosis. European Heart Journal. 31 (3), 369-376 (2010).
  30. Ziegler-Heitbrock, L., Hofer, T. P. J. Toward a Refined Definition of Monocyte Subsets. Frontiers in Immunology. 4, 23(2013).
  31. Weber, C., et al. Role and analysis of monocyte subsets in cardiovascular disease. Joint consensus document of the European Society of Cardiology (ESC) Working Groups "Atherosclerosis & Vascular Biology" and "Thrombosis". Thromb Haemost. 116 (4), 626-637 (2016).
  32. Shantsila, E., et al. Immunophenotypic characterization of human monocyte subsets: possible implications for cardiovascular disease pathophysiology. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (5), 1056-1066 (2011).
  33. Hofer, T. P., et al. slan-defined subsets of CD16-positive monocytes: impact of granulomatous inflammation and M-CSF receptor mutation. Blood. 126 (24), 2601-2610 (2015).
  34. Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nature Biotechnology. 29, 886(2011).
  35. Thomas, G. D., et al. Human Blood Monocyte Subsets: A New Gating Strategy Defined Using Cell Surface Markers Identified by Mass Cytometry. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (8), 1548-1558 (2017).

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Selecci n de CD14 y CD16an lisis del marcador HLA DRexpresi n de marcadores M1 y M2preparaci n de muestras de sangrelisis de eritrocitosan lisis de dispersi n frontalselecci n para la exclusi n de dobleteseliminaci n de c lulas contaminantes

Artículos relacionados