Artículo de método

Aislamiento de arteriolas retinianas por estudios de fisiología celular Ex Vivo

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DOI:

10.3791/57944

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14 de julio de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Experimental Medicine, Queen's University of Belfast, 2Centre for Biomedical Sciences (Education), Queen's University of Belfast, 3Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacognosy, Naresuan University, 4School of Medicine, Dentistry and Biomedical Sciences, Queen's University of Belfast

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo simple para el aislamiento de las arteriolas de la retina de rata que puede utilizarse en, calcio presión y proyección de imagen de miografía estudios electrofisiológicos.

Resumen

La retina es un tejido metabólicamente muy activo que requiere una fuente substancial de la sangre. La circulación retiniana compatible con la retina interna, mientras que los vasos coroides fuente de los fotorreceptores. Alteraciones en la perfusión retiniana contribuyan a numerosas enfermedades avistar-que amenaza, incluyendo retinopatía diabética, glaucoma y retina rama oclusiones de la vena. Comprender los mecanismos moleculares implicados en el control del flujo de sangre a través de la retina y cómo estos se alteran en la enfermedad ocular podría conducir a la identificación de nuevas dianas para el tratamiento de estas condiciones. Arteriolas retinianas son los vasos de resistencia principal de la retina y por lo tanto, juegan un papel clave en la regulación hemodinámica retiniana a través de cambios en el diámetro luminal. En los últimos años, hemos desarrollado métodos para aislar las arteriolas de la retina de rata que son convenientes para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo estudios de fisiología celular. Esta preparación ha comenzado ya a producir nuevos conocimientos sobre cómo el flujo de sangre es controlado en la retina y nos ha permitido identificar algunos de los cambios claves que ocurren durante la enfermedad ocular. En este artículo, describir los métodos para el aislamiento de arteriolas de retina de rata e incluir protocolos para su uso en estudios miografía presión, proyección de imagen de calcio y electrofisiología patch-clamp. Estos buques también son susceptibles para su uso en PCR, western blot y immunohistochemistry basado en los estudios.

Introducción

Entender cómo se controla el flujo sanguíneo en la retina es un objetivo importante, ya que el flujo de sangre anormal se ha implicado en la patogenia de una gran variedad de avistar-que amenaza enfermedades de la retina1,2,3, 4. La circulación retiniana, que provee las células gliales y neuronas retinianas internas, tiene un arreglo de la arteria extremo, con toda la sangre de las arterias retinianas y arteriolas pasando por los capilares a las vénulas retinianas y finalmente las venas5. Flujo sanguíneo en la retina está regulado por el tono de las arterias retinianas y arteriolas así como la actividad contráctil del pericitos situado en las paredes de los capilares de la retina y vénulas post capilares6,7, 8. el control del tono vascular retiniano es complejo y es modulado por una variedad de entradas desde el sistema circulatorio y el tejido retiniano circundante, incluyendo gasometría arterial, circulación de moléculas y hormonas, y sustancias vasoactivas liberados de la retina vascular endotelio y macroglía9,10,11. Las arteriolas retinianas son las pequeñas ramas arteriales de la retina y se componen de una sola capa de células musculares lisas vasculares y un revestimiento interior de longitudinalmente dispuestas las células endoteliales12,13, 14. estos vasos forman el sitio web principal de la resistencia vascular en la circulación retiniana y por lo tanto juegan un papel importante en el control local del flujo sanguíneo retiniano. Arteriolas retinianas regulan el flujo sanguíneo capilar en la retina por dilatación o constricción su diámetro luminal, mediada por cambios en la contractilidad del músculo liso vascular10,15,16. Comprensión de los mecanismos moleculares a través de que retina las arteriolas regulan la perfusión retiniana por lo tanto requiere preparaciones donde las células del músculo liso arteriolar pueden acceder y estudiadas en condiciones como a fisiológico como sea posible.

Ex vivo preparaciones de vasos sanguíneos retinianos aislados proporcionan acceso a las células de músculo liso vascular, mientras que sigue manteniendo su funcionalidad y su interconexión con el endotelio subyacente. Mayoría de los estudios hasta la fecha usando los recipientes aislados se ha centrado en bovinos o porcinos arteriales vasos (60-150 μm). Estas pueden montarse en alambre comercialmente disponible o sistemas de presión de la laringe para permitir interrogatorios farmacológica del músculo liso vascular células mecanismos contráctiles17,18. Estas preparaciones han contribuido enormemente a nuestro conocimiento de la fisiología vascular retiniana en condiciones normales. Pocos estudios han utilizado arteriolas retinianas aisladas de animales de laboratorio pequeños como su diámetro más pequeño (~ 8-45 μm) impide su uso en sistemas convencionales de miografía19,20,21,22. Una ventaja importante, sin embargo, utilizando embarcaciones de animales de laboratorio pequeños es la amplia disponibilidad de modelos de enfermedad retiniana, transgénicos y genéticamente modificados. Animales de laboratorio pequeños también son más susceptibles para estudios de intervención en vivo .

Aquí describimos protocolos sencillos para aislar y canular arteriolas retinianas de ratas para los experimentos miografía de presión. CA2 + proyección de imagen y electrofisiología protocolos utilizando estas embarcaciones también se detallan. Estos pueden proporcionar otras penetraciones en la regulación de la contractilidad del músculo liso vascular y flujo sanguíneo en la retina.

Protocolo

Todos los experimentos aquí descritos fueron realizados según las directrices contenidas en la ley de Reino Unido los animales (procedimientos científicos) de 1986 y fueron aprobados por de la reina Bienestar Animal de la Universidad de Belfast y órgano de examen de ética.

1. aislamiento de arteriolas retinianas

Nota: El siguiente protocolo se utiliza para aislar las arteriolas retinianas. Este método está optimizado de arteriolas de retina de rata pero se puede utilizar con retinas de ratón. El rendimiento de los buques, sin embargo, es inferior al usar ratones.

  1. Hacer una solución de baja Ca2 + que contienen madejas (LCH) como se muestra en la tabla 1.
    Nota: Esta solución puede conservarse hasta 3 días a 4 ° C (cuando uso almacena LCH, asegúrese de que equilibra a la temperatura y el pH es correcto antes de usar).
  2. El siguiente montaje antes de la obtención de tejido para asegurar la rápida microdisección de las retinas: dentado fórceps, tijeras curvas, hoja de plato (plato de Petri recubiertas de silicona), solo bordeada de disección, 2 sets de 1 cristal (Romo) fórceps pipeta Pasteur (fuego pulido a una punta suave pero no estrecha), 1 pipeta de plástico desechable (con punta cortado para aumentar la abertura a ~ 5-7 mm), 1 vaso redondo tubo de prueba inferior (5 mL) y soporte. Aproximadamente 50 mL de HCl en un vaso de vidrio se decanta y preparar un segundo vaso de precipitados decantar residuos líquidos.
    Nota: Ver Tabla de materiales para las especificaciones y detalles del fabricante.
  3. Eutanasia la rata usando CO2 seguido por punción cardiaca para exsanguinate (evitar la dislocación cervical o conmoción ya que pueden dañar los vasos sanguíneos en el ojo). Retraer los párpados con pinzas dentadas, luego utilice las tijeras curvas para cortar alrededor de los músculos orbitales y a través del nervio óptico. Extraiga suavemente los ojos de la órbita, teniendo cuidado de cortar a través cualquier accesorio restantes con las tijeras.
  4. Coloque los ojos sumergidos en solución de HCl en la bandeja de disección (ojos pueden transportarse en hielo en una solución de HCl si es necesario). Utilizar un sistema de pinzas embotadas para anclar el ojo en el plato por los accesorios del músculo orbital o del nervio óptico; Asegúrese de que el punto de anclaje esté lo más cercano posible de la esclera para estabilizar el ojo.
  5. Usando la cuchilla, corte a través de la córnea a lo largo de la ora serrata y retirar la lente presionando suavemente sobre la esclera con el fórceps.
  6. Corte de la taza del ojo en la mitad simétricamente a través del disco óptico. Utilizando cierra pinzas suavemente 'cepillo' por las retinas de las dos mitades del cilindro teniendo cuidado de retirar cualquier accesorio restante en el disco óptico. Repita el proceso con el segundo ojo y transferir las retinas disecadas en el tubo de ensayo usando que la pipeta de plástico y una pequeña gota de medio de HCl.
  7. Con la pipeta de plástico llene el tubo de ensayo con HCl a ~ 5 mL y permitir que las retinas para instalarse en la parte inferior.
  8. Lavar el tejido aproximadamente 3 veces sacando ~ 4 mL de solución del tubo y añadir HCl fresco utilizando la pipeta de plástico. En caso necesario, remover el tejido extraño como ligamentos suspensorios, humor vítreo y pelos.
  9. Lave el interior del pipeta de Pasteur (punta de pulido) con HCl para evitar que el tejido se pegue a la pipeta de vidrio. Usando la misma pipeta, retire aproximadamente 4 mL de solución de la probeta. Luego añada aproximadamente 2 mL de HCl fresco.
  10. Suavemente disociar (triture) las retinas dibujando el tejido a través de la punta de vidrio pipeta lentamente y expulsar el contenido en la probeta. Nota, trate de no introducir burbujas en esta etapa.
  11. Repita paso 1.10 hasta las retinas están quebradas para arriba a un tamaño de aproximadamente 2-3 mm2.
  12. Lavar el interior de la pipeta con aproximadamente 2 mL de HCl y vierta esto en la probeta. Permita que el contenido a instalarse en la parte inferior sobre 5-10 minutos.
  13. Repita el proceso de trituración como se indica en 1.10 1.12 con fuerza un poco más hasta que las piezas de tejido aproximadamente de 1 mm2 de tamaño. Otra vez, permitir que el tejido a reposar 5-10 minutos.
  14. Repita los pasos 1.10 1.12 por tercera vez con más fuerza hasta que los contenidos son totalmente homogeneizados y no pedazos de retina permanecen (la solución debe ser lechosa en apariencia).
    Nota: Esta técnica producirá hasta 8 segmentos arteriolare (relativamente libres de alrededor de neuropilos y con algunas ramas quedan intactos) por aislamiento medición 8-45 μm de diámetro y 200-2500 μm de longitud.
  15. Transferir una pequeña cantidad de la cepa en una cámara de grabación fisiológica o añadir tintes fluorescentes para la medición de Ca2 + concentración intracelular ([Ca2 +]i; ver sección 3). Eliminar restos de tapas oculares y solución durante el proceso de aislamiento según las normas locales sobre el manejo de los desechos animales.
    Nota: Mientras que es recomendable experimentar en los buques inmediatamente después de la aislamiento, aislante excedentes puede almacenarse a 4 ° C durante 8 h.

2. arteriolar presión miografía

Nota: La presión Arteriolar miografía se lleva a cabo como sigue usando equipos detallados en la figura 1A, B y la Tabla de materiales.

  1. Transferir una alícuota de homogeneizado de vasos retinianos (1-2 mL; aislado según la sección 1) a una cámara de grabación fisiológica (parcialmente lleno con nominalmente solución de Hanks Ca2 +libre; 0Ca2 + Hanks'; ver tabla 1) montado en el escenario de un microscopio invertido. Deje los vasos se colocan en la parte inferior de la cámara de grabación de al menos 5 minutos antes de la experimentación.
  2. Analizar visualmente a través de la cámara de grabación para identificar arteriolas > 200 μm de longitud y posee un extremo abierto a través del cual el buque puede ser canulado (identificación del tipo de embarcación es explorado en la sección de resultados). Coloque el vaso en el centro del campo de visión. Si no hay recipientes adecuados están presentes, transferir otra alícuota de homogeneizado de buque en la cámara de grabación según el paso 2.1.
  3. Ancla un extremo de la embarcación utilizando pinza fina y un resbalón de alambre de tungsteno pequeño (75 μm de diámetro y ~ 2-4 mm de longitud) sobre el buque (véase la figura 1(i)). Para ello sostener el cable en la pinza y coloque las pinzas por encima de la cámara de grabación.
    1. Identificar la sombra correspondiente de las pinzas debajo del microscopio, baje el fórceps en el baño hasta que el alambre se hace evidente. Coloque el alambre sobre el recipiente aproximadamente 200 μm del extremo abierto y el alambre perpendicular al eje longitudinal de la nave de la gota.
      Nota: El peso del alambre de tungsteno es suficiente para ocluir el vaso distal parando el flujo del contenido luminal durante la canulación y presurización.
  4. Mover la arteriola en una posición adecuada dentro de la cámara de grabación que se encuentra horizontalmente a través de la bañera con el extremo abierto en consonancia con la cánula de presurización (ver figura 1(ii-iv)). Para ello, empujar suavemente la oclusión hoja de alambre de tungsteno con una sección adicional del alambre en la pinza; No toque la arteriola como irreversible se adherirá a las pinzas.
  5. En caso necesario (para segmentos de larga arteriola), agregar adicional tungsteno alambre se desliza sobre el buque tales que la distancia entre los extremos ocluidos y abiertas del vaso no más de 200 μm; Esto ayuda a prevenir la arteriola mover fuera del campo de visión sobre presurización. Si el barco tiene cualquier ramas laterales, también éstos deben ocluidos con engobes de alambre de tungsteno adicional. Si un rama lateral no puede ser ocluido deseche el recipiente.
  6. Inundar la cámara de 0Ca2 + Hanks a 37 ° C para remover el tejido retiniano extraño y para calentar el baño a temperatura fisiológica.
    Nota: Un sistema de calentador de perfusión y en la línea de baño gravedad estándar se puede utilizar para este propósito (ver figura 1A). 0Ca2 + Hanks' se utiliza para facilitar el proceso de canalización, desde retiro de externo Ca2 + se asegura de que las arteriolas permanecen dilatadas.
  7. Fabricación de cánulas de presurización desde el vidrio de borosilicato los capilares (punta diámetro ~ 3-10 μm, dependiendo del diámetro del recipiente a ser canulado; embarcaciones más pequeñas requieren más cánulas; vea la Tabla de materiales) con un tirador del microelectrodo y parte posterior llenado con solución de 0Ca2 + Hanks. Asegúrese de que la caña de la cánula se afila suavemente hacia la punta para facilitar la canulación.
  8. Montaje de la cánula en un porta pipeta conectada a una jeringa de 10 mL a través de un conector y un grifo de 3 vías; se utiliza para presurizar el sistema, la presión se registran utilizando un manómetro en el lado-brazo del conector en Y (ver figura 1B).
    Nota: Una pipeta de 'ayudante' es necesaria para ayudar en el proceso de canalización. Fabricar la pipeta de un capilar de vidrio de borosilicato tirado en un extractor de microelectrodo hasta un diámetro de la punta de 0, 5 - 2 μm. pesadamente Fuego Polaco la pipeta (a menudo hasta que cierre) utilizando un microforge.
  9. Coloque con cuidado la pipeta auxiliar perpendicular al eje largo de la nave cerca el extremo abierto con un manipulador mecánico de 3 ejes (ver figura 1). Coloque la pipeta ayudante justo por encima de la nave, pero no tocar lo.
  10. Coloque la pipeta de canulación en el extremo abierto del recipiente (ver figura 1 y 2A(i)) utilizando un micromanipulador fina; Coloque la punta inmediatamente adyacente a la abertura, evaluada mediante el ajuste del plano de enfoque en el microscopio (a 20 X). Cuando tanto el final de la nave y la punta de la cánula están enfocadas al mismo tiempo la posición correcta de la cánula para la canulación (ver figura 2A(ii)).
  11. Avanzar la cánula de presurización en la abertura del recipiente usando los controles de eje x de la fina instrumental quirúrgico (ver figura 2A(iii)). Evaluar el éxito de la canulación moviendo la cánula a lo largo del eje y. Si la cánula queda en el recipiente es canulado con éxito (ver figura 2A(iv)). Si la cánula se mueve fuera de la nave, la cánula es probable que sea por encima de la embarcación; Si es así, repita paso 2.10-2.11 con la cánula en un plano inferior en el eje z.
  12. Con canulación exitosa Baje suavemente la pipeta de ayudante en la embarcación para refrenar la arteriola. Guía de la pared arteriolar en la cánula de presión con la pipeta de ayudante, al mismo tiempo como la pipeta de la canulación se avanza más en el lumen del vaso a una distancia de aproximadamente 30-50 μm (véase la figura 2A(v, vi)).
    Nota: Este procedimiento requiere movimiento simultáneo y controlado de dos manipuladores (pipeta ayudante hacia la cánula mientras que la cánula se mueve en el lumen del vaso) y se requieren extensa práctica para lograr una alta tasa de éxito.
  13. Cambiar la solución de baño normal madejas que contienen 2 mM Ca2 + (véase tabla 1) a 37 ° C. Por lo general esto causa un leve estrechamiento de la arteriola y la formación de un sello hermético alrededor de la cánula de presurización. La pipeta de ayudante entonces alejada de la embarcación.
  14. Permite un sello hermético ver el vaso usando una cámara USB (y software de adquisición de imagen) conectado al microscopio y ajustar el enfoque para maximizar el contraste entre los límites de la nave y los espacios externos e intramural (véase a 15 minutos Figura 2B). Imagen de la nave en el 0.5 - 5 marcos/s.
  15. Después de 1 minuto de grabación en 0 mmHg, aumentar la presión intraluminal al nivel deseado cerrando el grifo de 3 vías conectado a la cánula de presurización (ver figura 1B) y aplique una pequeña cantidad de presión positiva para el sistema a través de la jeringa. Observar el cambio en el manómetro de la presión.
    Nota: La presión puede añadirse de manera paso sabio hasta 100 mmHg y un valor por ejemplo 40 mmHg (aproximar la presión arteriolar retiniana en vivo)23. El buque debe dilatar rápidamente confirmando la canulación exitosa. Tenga en cuenta que la vasoconstricción inducida por la presión (es decir, la respuesta miogénica) desarrollarán posteriormente durante un período de 15 minutos, pero debido al pequeño tamaño de estos buques, esto puede no siempre ser visualmente perceptible.
  16. Vigilar cuidadosamente el recipiente durante la presurización inicial obvio si hay fugas. Fuentes de escape pueden originarse en ramas laterales troceados o sellado inadecuado de la cánula en el interior de la arteriola.
    1. Ver contenido intraluminal dejando el vaso. Fugas más pequeñas, menos obvios pueden ser evidentes con el tiempo como una caída de presión en el manómetro. Si es posible, ocluir la abertura con engobes de alambre de tungsteno adicional teniendo cuidado de no para molestar a la cánula. Excluir preparados con evidente fuga de mayor análisis.
  17. Aplique el medicamento de interés abluminally al recipiente antes o siguiente, presurización de 15 min dependiendo de los objetivos del experimento (el anterior permite efectos sobre el desarrollo del tono miógeno debe ser determinada, mientras que este último permite el análisis de los efectos en estado estacionario tono miógeno). Un sistema de entrega de drogas típico está representado en la Figura 3A.
    1. Coloque el punto de entrega perpendicular a la porción de recipiente de interés (como se ilustra en la figura 1) a una distancia ~ 500 μm de la nave de interés teniendo la precaución de asegurar que la salida es óptimo angulada para superfuse completamente el área (véase Figura 3B). Aseguran que cambios en la perfusión no molestan físicamente el buque.
  18. Tras la realización de un experimento, aplique una solución de 0Ca2 + Hanks' que contiene 10 μm wortmannin (inhibidor de la cinasa de la cadena ligera de miosina) para máximo dilatar los vasos para determinar el diámetro del pasivo.
    Nota: La fuerza del sello de la canalización se puede probar en la conclusión del experimento al aumentar la presión intraluminal a > 100 mmHg. La mayoría de buques permanecerá unida incluso a esta alta presión indicando un sello hermético.
  19. Cabo análisis fuera de línea con detección de bordes para rastrear cambios en el diámetro arteriolar (véase Tabla de materiales para el software sugerido). Normalizar el diámetro de la arteriola al diámetro pasivo para la comparación entre los vasos.

3. Ca2 + imagen

Nota: Arteriolas retinianas aisladas están preparadas para convencional (microfluorimetry) y confocal Ca2 + proyección de imagen como sigue (con el equipo detallado en la Tabla de materiales).

  1. Preparar homogenados retiniana en un tubo de ensayo de vidrio de 5 mL como se describe en la sección 1. A 1 mL de homogeneizado de retina añadir Fura-2:00 (microfluormetric Ca2 + grabación) o Fluo-4:00 (Ca2 + proyección de imagen confocal) para dar una concentración final de 5 μm (proteger de la luz); colorantes indicadores cargan preferentemente en las células musculares lisas.
  2. Mantener a temperatura ambiente en oscuridad durante 2 h sacudiendo el lado del tubo cada 15-20 min para volver a suspender el tejido retiniano. Posteriormente, diluir el homogenado 1:4 con solución de HCl para reducir la carga de tinte.
    Nota: Los recipientes permanecen viables por hasta 6 h (cuando se almacena a 4 ° C y en la oscuridad); sin embargo se recomienda que los experimentos se iniciaron tan pronto como sea posible para reducir el impacto de la compartimentalización del tinte en organelos internos o extrusión del tinte con el tiempo.
  3. Transferencia de 1-2 mL de homogeneizado de retina a una cámara de grabación con fondo de cristal (parcialmente llenada con LCH) montada en el escenario de un microscopio invertido conectado a un sistema de microscopía confocal o Ca2 + microfluorimetry.
    1. Anclar las arteriolas perpendiculares a la dirección del flujo a través de la cámara de grabación, con combinaciones de alambre de tungsteno (50 μm de diámetro, 2-4 mm de longitud) espaciada ~ 100-200 μm aparte a lo largo de la longitud del vaso (ver figura 3) usando una técnica similar a la descrita en el paso 2.3.
  4. Inundar el baño con solución de Ca2 + Hanks normal a 37 ° C. Coloque el punto de entrega de drogas como se indica en la figura 3 y aplicar medicamentos a los buques como se describe en el paso 2.17.
  5. Para el Ca2 + proyección de imagen convencional, iluminar el vaso con la luz de 340/380 nm a través de un objetivo de inmersión UV de aceite (por ejemplo, 100 X, NA 1.3) y recoger la fluorescencia emitida a 510 nm mediante un fotón contando tubo fotomultiplicador (PMT).
  6. Al final de cada experimento, medir la fluorescencia del fondo por Temple el recipiente con una solución que contiene el MnCl (ver tabla 1). Coeficientes de corrección de fondo de la fluorescencia (R-F340/F380) para análisis o convertir al intracelular Ca2 + uso de ([Ca2 +]i) Rmax medidas (ver tabla 1, aplicada antes de amortiguamiento y Rmin 24) y la ecuación de Grynkiewicz25.
  7. Para el Ca2 + proyección de imagen confocal, excitar vasos Fluo-4 cargado de 488 nm y captura de las emisiones de fluorescencia resultante a 490 535 nm en cada línea de scan (xt) el modo o modos de exploración xyt (512 x 512 píxeles, agujero de alfiler sugerido 300 nm). Normalizar las mediciones de la fluorescencia en tiempo t = 0s (F/F0). Evaluar los cambios en la [Ca2 +]i durante aplicaciones de drogas o presurización offline en regiones específicas de interés (ROIs) utilizando el software de análisis de imagen.
  8. Si es necesario, realizar Ca2 + proyección de imagen con presión miografía.
    Nota: Las descripciones anteriores se han optimizado para los recipientes sin presión; sin embargo es posible combinar Ca2 + proyección de imagen con presión miografía como sigue.
    1. Aislar las arteriolas según sección 1. Carga con tintes de Ca2 + indicador según el paso 3.1-3.2. Transferencia de las arteriolas a la cámara de grabación y canule según la sección 2. Tenga cuidado de limitar la exposición a la luz durante el procedimiento de montaje.
    2. Medida de Ca2 + según paso 3.5 o 3.7 por encima. Presurizar el recipiente y repetir la medición de Ca2 +. Medida simultánea del diámetro del vaso es dependiente en el modo de Ca2 + medición y equipo utilizado.
      Nota: Para la medición de Ca2 + confocal puede ser necesario a la presurización de pre y post de regiones separadas de imagen debido al blanqueo de la dye durante largas exposiciones a la luz.

4. electrofisiología de Patch-Clamp de

Nota: Celulares y un canal de grabación es posible de células individuales del músculo liso arteriolar todavía incrustadas dentro de sus arteriolas de la matriz como sigue (con el equipo detallado en la Tabla de materiales).

  1. Aislar y arteriolas retinianas en la cámara de grabación de anclaje tal como se describe en los pasos 1, 2,3 y 3,3. Para la grabación de la abrazadera del remiendo, el alambre de tungsteno se desliza es espaciados aparte de 200-800 μm a lo largo de la nave.
  2. Retire la lámina basal alrededor de la arteriola y desacoplar eléctricamente las células adyacentes del músculo liso y células endoteliales subyacentes antes de la fijación con abrazadera del remiendo. Para ello, superfuse el buque con una serie secuencial de soluciones enzimáticas (tabla 1) a 37 ° C durante el tiempo necesario.
    Nota: La duración de la exposición de la enzima está optimizada para las arteriolas retinianos de la rata (proteasa, ~ 8 min; colagenasa, ~ 12 minutos) y depende de la velocidad de flujo del sistema de entrega de drogas (~ 1 mL/min en nuestra instalación) y las actividades de la unidad del lote de las enzimas que se utilizan.
  3. Evaluar el nivel de digestión en la separación visual de endotelial y capas de músculo liso durante la colagenasa paso tal como se muestra en la figura 4. Una vez que se observa separación de las capas (como se muestra en la Figura 4B), aplicar DNasa solución (~ 4 min) entonces terminar la digestión por el reemplazo de la solución de baño con solución de Ca2 + madejas normales.
  4. Quite cualquier hebra restante de lámina basal y periférica neuropilos barrer cuidadosamente las puntas cerradas de Pinzas finas a lo largo de la superficie del vaso.
  5. Tire y Polaco Capillares de vidrio de (Tabla de materiales), llenar con solución (tabla 1) de la pipeta y coloque firmemente en el soporte de la pipeta de la headstage de la abrazadera del remiendo. Coloque la pipeta en un ángulo de 45° en relación con la cámara de grabación y avanzar hacia el vaso usando el ajuste grueso en un micromanipulador motorizado.
  6. Seleccione una célula de músculo liso que sobresale de la pared del vaso y cuya superficie está libre de suciedad visible (ver Figura 4B). Coloque la punta de la pipeta patch verticalmente sobre la célula de interés y bajar poco a poco con el movimiento lento bellas de las amalgamas dentales para hacer contacto con la membrana del músculo liso.
    1. Evaluar el contacto entre la célula y pipeta visualmente de movimiento celular y un cambio en la resistencia de pipeta medida usando el protocolo de prueba de la membrana (sello) en el software de adquisición (5-10 paso negativo de mV de 0 mV, frecuencia 25 KHz; ver figura 5A(i)) .
  7. Cuando la resistencia del sello ha aumentado 5 veces (por ejemplo, pasando de 2 a 10 MΩ; Figura 5A (ii)) se aplica presión negativa transitoriamente a la parte posterior de la titular de la pipeta a través de un conector, grifo de 3 vías, jeringa y tubo atado titular de la pipeta (montado de una manera similar a la utilizada en la presurización de las arteriolas, ver figura 1B).
  8. Repetir aplicaciones de presión negativa hasta un gigaseal (> 1 resistencia de GΩ; según lo indicado por la prueba de la membrana en el software de adquisición) es formado (figura 5A(iii)). Tenga en cuenta que este proceso puede tomar de 1 a 5 min. Si un gigaseal no forma, elegir una célula diferente a la abrazadera del remiendo usando una pipeta patch fresco.
  9. Aplique una explotación potencial a la celda mediante el software de adquisición según el experimento que se realiza (normalmente 0-40 y -80 mV).
  10. Estudiar la actividad de canal único (en celdas) en la configuración actual. Alternativamente, generar parches de adentro hacia fuera rápidamente los tramos la pipeta patch desde la superficie de la célula después de la formación gigaseal.
    1. Como los extremos libres de la membrana pueden volver a templar bajo estas condiciones retirar la pipeta del baño a través de rápido movimiento vertical del manipulador (ajuste grueso). Volver rápidamente a través del menisco para quitar la membrana reformada dejando sólo el parche dentro de la punta de la pipeta.
  11. La frecuencia de muestreo en el software de adquisición a 5 KHz y activar el modo de grabación continua a la actividad de registro de canal. Aplique los cambios de voltajes si es necesario mediante el software o el amplificador.
  12. Si es necesario, se aplican medicamentos a parche de membrana vaso como se describe en el paso 2.17.
  13. Si se requiere el estiramiento de la membrana, se aplica presión negativa a la parte posterior de la pipeta con la jeringa unida a un manómetro mediante un grifo de 3 vías y conector.
  14. Analizar grabaciones de un canal para probabilidad abierta y conductancia unitaria según procedimientos estándar26.
  15. Para toda celda actual grabación pipetas de extracción y pulido según la Tabla de materiales, llenar con solución de pipeta conteniendo anfotericina B (Añadir 3 mg de anfotericina B a 50 μl de DMSO, añadir 3-6 μl de esto 1 ml de solución de la pipeta de la célula entera, someter a ultrasonidos para mezclar) y formar un sello según pasos 4.6-4.9.
  16. Debido a la inclusión de la anfotericina B no hay ruptura de la membrana dentro de la punta de la pipeta para obtener acceso de células enteras. Controlar el acceso, que se ganó poco a poco, usando el protocolo de prueba de la membrana en el software de adquisición (paso de-20 mV de -40 mV, frecuencia de muestreo 25 KHz; ver figura 5B).
  17. Montaje automatizado de capacitivas transitorios en algunos software da mediciones en tiempo real de acceso a resistencia y capacitancia de la celda (alternativamente la relativa disminución de los transitorios puede evaluarse por el ojo). Una vez que la resistencia de acceso cae a < 15 MΩ, realizar compensaciones de resistencia serie (figura 5) los discos selectores parámetros celulares (resistencia capacitancia y serie) en el amplificador.
    1. Para ello, utilice los valores de ajuste automático para configurar inicialmente los cuadrantes (ver figura 5(ii)) entonces incrementar el dial de compensación de la resistencia serie (predicción y corrección si está disponible en el amplificador) volver a ajuste de las compensaciones de células enteras reduciendo la capacitiva transitorios (ver figura 5(iii)).
    2. Teniendo cuidado de no sobre compensar (como se muestra en la figura 5(iv)). Por lo general, es posible compensar la resistencia en serie en un 75% en el modo de parche perforado (requiere compensación de lag para ajustarse al máximo).
  18. Si no se dispone de ninguna conexión automatizada, comienzan fijando los parámetros celulares marca pF 15 y 15 mΩ (valores típicos para estas células) y luego ajustar para producir las salidas como se muestra en la figura 5(ii). El dial de compensación de la resistencia de la serie ~ 75% de aumento y reajustar los parámetros celulares cuadrantes según la figura 5(iii).
  19. Antes de comenzar la experimentación tenga en cuenta la medición de capacitancia celular en el primer ajuste automático o desde el disco después de compensación manual.
    Nota: Este valor se utiliza para normalizar las corrientes al tamaño de la célula. Compensar la resistencia de serie deba ajustarse durante la experimentación como acceso puede seguir mejorando debido a la incorporación de la anfotericina B en el parche.
  20. Aplicar medicamentos a los buques como se describe en el paso 2.17. Aplicar protocolos de voltaje (pasos o rampas) según los requisitos experimentales.
    Nota: Típico paso los protocolos, 0.1 - 1 s de duración, se aplican de la explotación potencial de 10-20 mV incrementa cada 5-10 s para producir una familia de corrientes activados por voltaje. Como alternativa utilizar protocolos de rampa para medir corrientes en una serie de tensiones en un 'barrido' por incrementando lentamente el voltaje (100-200 mV/s) de por ejemplo, -80 a + 80 mV (aplicado cada 5-10 s) con muestreo fuera de línea de la corriente en 10 intervalos de mV durante la rampa.
  21. Es posible combinar Ca2 + la proyección de imagen con abrazadera del remiendo como sigue la grabación. Aislar las arteriolas según sección 1. Carga con Ca2 + indicador tintes según pasos 3.1-3.2. Montar en la cámara de grabación según la sección 4. Tenga cuidado de limitar la exposición a la luz durante estos procedimientos.
    Nota: Hasta la fecha no ha sido posible combinar la abrazadera del remiendo con estudios miografía de presión debido a la pérdida de la membrana basal y la integridad de la embarcación durante el proceso de disociación enzimática

Resultados

La figura 6A muestra un dibujo esquemático del árbol vascular retiniano de rata. Los rangos de diámetro de la primera orden (30-45 μm) (20-30 μm) de segundo orden y las arteriolas pre capilares (8-20 μm) ha sido confirmada experimentalmente en nuestro laboratorio por proyección de imagen confocal de rata immunohistochemically de retina preparativos de montaje en conjunto con para la actinia del músculo liso de α (Figura 6B). Sobre la disociación de la retina, primarias, secundarias y pre-capilares arteriolas pueden identificarse partiendo de su calibre y el arreglo de las células del músculo liso vascular. Las arteriolas de primero y segundo orden aparecen visualmente similares bajo microscopía de campo brillante, pero pueden ser distinguidas sobre la base de su tamaño (figura 6). Las arteriolas pre capilares son los vasos más pequeños en la preparación y son fácilmente reconocibles debido a su disposición más dispersa de las fibras de músculo liso vascular. Las arteriolas aisladas pueden diferenciarse claramente de los capilares y las vénulas en el aislamiento. Los capilares son evidentes como una red de vasos de calibre pequeño (4-10 μm de diámetro), mientras que las vénulas son delgadas paredes y carecen de cobertura de la célula de músculo liso (figura 6). Primarias, secundarias y pre-capilares arteriolas son adecuadas para presión miografía, Ca2 + proyección de imagen y abrazadera del remiendo estudios.

La figura 7 muestra un experimento miografía de presión donde una arteriola retiniana primaria rata ha sido canulada y la presión intraluminal elevada a 40 mmHg. La arteriola se mantiene esta presión para permitir el desarrollo de tono miógeno antes de la adición de 0Ca2 + Hanks que contiene 10 wortmannin μm para obtener el diámetro pasivo del buque. La Figura 7A muestra fotomicrografías de la arteriola en varios puntos del tiempo durante el curso del experimento. Un registro de tiempo completo curso mostrando los cambios en el diámetro del vaso con el tiempo han sido trazados en figura 7B usando software de encargo hecho de detección de bordes27. Inmediatamente después de la presurización se dilata el recipiente, que es seguido por una constricción activa miógeno que alcanza un nivel de estado estacionario después de 15 minutos además de 0Ca2 + Hanks'/ wortmannin solución dilata el recipiente a un nivel similar al observa inmediatamente tras el paso de presión inicial. Como se describió anteriormente, drogas pueden aplicarse a los vasos antes o siguiente presurización para investigar los mecanismos que subyacen el desarrollo y mantenimiento del tono miógeno en estos vasos. Usando este acercamiento, previamente hemos demostrado que activados por estiramiento transitorio del Receptor potencial vaniloides 2 (TRPV2) canales y tipo L y T voltaje Ca2 + juega un papel central en facilitar el desarrollo del tono miógeno en primera y segundo orden rata arteriolas retinianas20,21,22. También hemos informado que grande conductancia Ca2 + activa canales de potasio (canales BK)19,28 y Kv1 con voltaje-bloqueado K+ canales ley para oponerse a la actividad miogénica en estos buques, ya que la adición de inhibidores específicos para cada uno de estos canales provoca vasoconstricción (figura 7).

La figura 8 muestra ejemplos de convencional y confocal Ca2 + proyección de imagen en arteriolas retinianas antes y la siguiente exposición el péptido vasoconstrictor, endotelina-1 (Et-1). En fura 2 basado en grabaciones convencionales (figura 8A), Et-1 (10 nM) provoca un aumento bifásico en [Ca2 +] en la capa del músculo liso arteriolar retiniana, que consta de un componente transitorio inicial seguido de una baja sostenida componente. Anteriormente hemos caracterizado los componentes transitorios y sostenidos como siendo debido a la Ca2 + liberación desde el retículo endoplásmico y Ca2 + afluencia desde el espacio extracelular, respectivamente29. Basadas en fluo-4 Ca2 + proyección de imagen confocal proporciona un cuadro más detallado de los efectos de la Et-1 en el nivel celular. En estos experimentos, resulta evidente que el liso graduales cambios en global [Ca2 +] observado en nuestros resultados de estudios microfluorimetry de Et-1 estimula la activación repetitiva asincrónica [Ca2 +] oscilaciones en las células del músculo liso arteriolar retiniana vecinas a lo largo de la pared del vaso (figura 8B, C; 30).

Figura 9 se muestran ejemplos de grabaciones de abrazadera de parche solo canal y celulares de las células del músculo liso arteriolar retiniana. Hasta la fecha, hemos realizado dos solo en la célula y dentro-fuera del canal parche abrazadera grabaciones22,28. Figura 9A, B por ejemplo, mostrar una abrazadera del remiendo de en celda de grabación antes y siguiente tramo de membrana (generado mediante la aplicación de presión negativa en la pipeta del parche). Este especial contiene dos canales que se activan por estiramiento mecánico. Previamente hemos demostrado que estas corrientes pueden ser inhibidas mediante de anticuerpos de bloqueo de poro TRPV2 canal22. La conductancia unitaria de los canales (249,71 pS) también es consistente con estas corrientes es mediadas por el TRPV231.

Celulares activados por voltaje las corrientes pueden ser evocadas mediante protocolos de paso de voltaje. Figura 9 muestra una familia de activados por voltaje tipo K+ corrientes con ese enfoque. Estas corrientes se hacen evidentes cuando otras grandes corrientes presentan en estas células (por ejemplo, BK y Ca+-activa las corrientes Cl– ) se bloquean mediante agentes farmacológicos específicos32,33. Las corrientes a través de canales iónicos dependientes de voltaje no - o débil se examinan típicamente usando protocolos de rampa de voltaje. Hemos utilizado estos protocolos para identificar y caracterizar las corrientes de TRPV2 activadas por hipotónica estiramiento22 y canal de agonistas (figura 9) en las células del músculo liso arteriolar retiniana.

La figura 10 muestra presión dual miografía y confocal Ca2 + proyección de imagen aplicada en una arteriola retiniana primaria rata. Presurización desencadena aumento de la frecuencia de [Ca2 +]i oscilaciones en las células de músculo liso individuales similares a los observados con Et-1. Previamente hemos demostrado que estas oscilaciones son desencadenadas por la adición de Ca2 + chispas (localizada Ca2 + sala de eventos) y contribuir a la generación de tono miógeno20.

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Figura 1 . Disposición experimental para presión miografía en arteriolas retinianas rata. Equipo Experimental A) incluyendo microscopio invertido, calentador en línea para la solución de baño, mecánico de 3 ejes y micro manipuladores, manómetro, titular de la cánula y mesa de aire. B) diagrama esquemático que muestra el arreglo óptimo de la cannulating pipeta y vaso de interés en la cámara de grabación. Este diagrama también muestra la configuración básica del equipo de presurización. Diagrama esquemático de la C) se muestra el proceso de anclaje y mover el vaso usando resbalones de alambre de tungsteno adicional en pinza fina. (i) Colocar 1st recibo para ocluir el vaso tal. (ii, iii) Utilice hojas adicionales para empujar la oclusión slip (dirección indicada por la flecha) y acompañando a buque en la orientación óptima que se muestra en la (iv). D) diagrama esquemático mostrando la colocación óptima de oclusión resbalón de alambre de tungsteno, pipeta de ayudante y la cánula en relación con el buque como arreglado antes de la canulación. La salida del sistema de suministro de drogas se coloca a una distancia de ~ 500 μm desde el buque para reducir artefactos de movimiento durante el uso de drogas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2 . Proceso de canulación para la presión miografía. A) fotomicrografías mostrando una arteriola retiniana anclada abajo en la sala de grabación antes de (i), durante (ii)-(v) y siguiente canulación (vi). Flecha azul indica la dirección del movimiento de la cánula mientras la flecha verde indica la dirección del movimiento de la pipeta de ayudante. B) microfotografía que muestra la región óptima para el registro de la actividad miogénica durante la presurización como resaltado en rojo. Nota, ajuste de luz y de enfoque para aumentar el contraste de las paredes de los vasos permite el mejor seguimiento de los bordes de los vasos para análisis automatizado. Indica la barra de escala 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3 . Entrega de la droga. A) equipo utilizado para el suministro de medicamentos que muestran depósitos de solución conectados a un múltiple de múltiples canales de entrega controlada por grifos de 3 vías y unido a un manipulador mecánico de 3 ejes. B) diagrama que muestra la posición vertical óptima de la entrega de drogas múltiples en relación con la cámara de grabación. C) microfotografía de un buque anclado abajo en la sala de grabación que muestra el posicionamiento ideal de la salida de la entrega de drogas. Barra de escala representa 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4 . Digestión enzimática de las arteriolas retinianas para abrazadera del remiendo de grabación. Micrografías de una arteriola retiniana antes (A) la luz y después de la digestión enzimática (B). Tenga en cuenta la separación física (indicada por las flechas) de las células musculares lisas (SMCs) de las células endoteliales subyacentes (ECs). Las células de músculo liso adecuadas para afianzar con abrazadera del remiendo se indican con un asterisco. Barra de escala representa 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5 . Solo canal y grabación de células enteras patch clamp. Ilustración A) de las corrientes de prueba observada durante el protocolo de 'sello de prueba' cuando: () la pipeta patch entra el medio baño exterior, (ii) la punta entra en contacto con la membrana de plasma de células de músculo liso vascular y (iii) la succión es aplicado a la parte posterior de la pipeta para permitir gigaseal formación. Después de compensación de capacitancia de pipeta usando el amplificador de abrazadera del remiendo, corrientes solo canal ahora pueden grabarse en la configuración en el celular o un parche de membrana puede ser suprimido por rápidamente retirar la pipeta para crear un parche de 'revés'. B) actual cambios asociados con el desarrollo de acceso eléctrico para el interior de la célula durante el uso de la anfotericina B toda célula perforada patch clamp técnica (i): (ii) como acceder particiones de anfotericina B en la membrana, resistencia a caídas y transitorios de capacitancia sacados durante hiperpolarizantes pasos de voltaje (de -40 a -60 mV) a ser más grande; (iii) una vez acceso resistencia (Ra) ha caído a < 15 MΩ, que toma generalmente 5-10 min después gigaseal formación, la experimentación es posible. Antes de C) grabación de celulares, acceso a resistencia y capacitancia de la celda deben ser compensados mediante los cuadrantes correspondientes del amplificador de abrazadera del remiendo. Valores de la capacitancia de resistencia y de la célula de acceso proporcionados por funciones automatizadas en software de patch-clamp se pueden utilizar para ayudar a guiar este proceso: () muestra la capacidad transitoria antes de compensación de la región resaltada en b.III; (ii) muestra la reducción en la capacidad transitoria se observa normalmente cuando el acceso a resistencia y capacitancia se compensan; (iii) compensación de la resistencia serie entonces debe ser corregido a 75% y a la resistencia y compensaciones de capacitancia a punto tal que el transitorio resultante debe ser relativamente igualan en amplitud por encima y por debajo del nivel de la meseta de la corriente durante el paso. (iv) debe tener cuidado para asegurar que la resistencia de acceso no está más compensada (indicado por la presencia de 'llamada' de la transitoria), que puede ocurrir a veces si acceso sigue mejorando durante el transcurso del experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6 . Identificación de las arteriolas retinianas aislado de rata. Ilustración A) mostrando el arreglo del árbol microvascular retiniana de rata. B) imágenes confocales de arteriolas de retina de rata y las vénulas en preparativos de montaje plano teñido de αSMA (rojo, los núcleos se tiñen de azul, barras de escala representan 50 μm). Micrografías de luz C) del aislado 1 °, 2 ° y las arteriolas pre capilares y red capilar vénula (barras de escala representan 10 μm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7 . Grabaciones miografía presión arteriolar. Imágenes de A) de una demostración de cannulated arteriola retiniana (i) descanso de diámetro (aproximadamente 35,6 μm), (ii) la dilatación sobre presurización, (iii) desarrollo de vasoconstricción miogénica y (iv) la dilatación debido a la adición de 10 μm wortmannin en 0Ca2 + Solución de hanks. Escala bar representa 10 μm. B) parcela de tiempo curso del diámetro del recipiente para el experimento completo que se muestra en la A (muestreada en 2,5 fotogramas/s). Diámetro C) traza de una arteriola diferentes bajo estado estacionario tono miógeno (μm diámetro 38.7) mostrando los efectos de la correolide Kv1 de inhibidor de la canal (10 μm) y el canal BK inhibidor iberiotoxin (100 nM) (muestreada en 0,5 fotogramas/s). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 8 . Efectos de la Et-1 en la [Ca2 +] me actividad en arteriolas retinianas rata de señalización. A) convencionales basados en fura-2 grabación mostrando los efectos de la Et-1 (10nM) global [Ca2 +]. Basal [Ca2 +]yo era 82 nM en esta arteriola de 1 °. B) xt confocal Fluo 4 basado en imágenes que muestran los efectos de la Et-1 [Ca2 +] en el nivel celular. Parcela C) de la intensidad de fluorescencia normalizada (F/F0) medida en las células como se indica en B. Esta figura ha sido modificada desde Tumelty et al. 30 con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 9 . Solo canal y grabaciones de la abrazadera del remiendo de celulares de las células del músculo liso arteriolar retiniana de rata. A, B) grabaciones de canal en la célula de la membrana misma parche antes (A) y durante (B) la aplicación de presión negativa (-45 mmHg) para el parche de pipetear. Dos canales están presentes en el parche (12,81 actual unitario pA; conductancia unitaria 249.71 pS) que muestran un incremento sustancial en la activación en condiciones de estiramiento. Regiones seleccionadas de los paneles superiores (i) aparecen en un tiempo más rápido en los paneles inferiores (ii). Familia C) de las corrientes de canal tipo K+ (i) grabados en el modo de células enteras en presencia de inhibidores de BK y Ca2 +-activa los inhibidores de canal Cl– , provocados en respuesta a 20 mV tensión incrementos de entre -80 mV a + 80 mV (ii). Corrientes de células enteras de D) (i) sacadas por rampas de tensión entre -80 mV y + 80 mV antes (línea negra) y durante la aplicación (línea roja) del TRPV2 canal agonista delta-9-tetrahidrocannabinol (THC-Δ9). El protocolo de rampa de voltaje utilizado se muestra en el panel inferior (ii). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 10 . Ca2 + proyección de imagen confocal antes y después de la presurización de una arteriola retiniana rata. Análisis representativo xt confocal (i) de las células del músculo liso arteriolar retiniana bajo (A) sin presión y (B) presión condiciones de regiones separadas de la nave misma. (ii) cambios en la fluorescencia normalizada (F/F0) grabado en las células individuales a - e, como se indica en (i), trazado contra el tiempo. Los asteriscos indican individual subcelular Ca2 + chispas que aumentan en frecuencia después de la presurización y summate para activar celulares Ca2 + oscilaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Compuesto (mM)Bajo Ca2 + Hanks0Ca2 + HanksMadejas de normalEnzima proteasa de aislamientoEnzima colagenasa de la aislamientoEnzima DNasa de aislamientoSolución de saciarSolución de RminSolución de RmaxAdjunto solución extracelular de la célulaCelular une pipeta soluciónSolución extracelular de células completasSolución de la pipeta de la célula entera
Pureza del agua (resistencia)≥ 15 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥18 MΩ.cm≥ 15 MΩ.cm≥18 MΩ.cm
NaCl140140140140140140140140140140
kCl6666666666138
D-glucosa555555555555
MgCl2 1.31.31.31.31.31.31.31.31.31.31.31.31
HEPES10101010101010101010101010
CaCl2 0.120.10.10.1102220.2
EGTA40.5
MnCl10
Ionomycin0.01
KOH140130
Ácido D-glucónico130130
NaOH10
Penitrem A0.00010.00010.0001
4-aminopiridina10
Nimodipina0.010.01
Fluoxetine0.1
ácido 9-anthracenecarboxylic1
Anfotericina B300-600 μg mL-1
Proteasa tipo XIV~0.01% (0.4-0.6 mg/40 mL)
Colagenasa tipo 1A0,1% (6 mg/60 mL)
DNasa I20 KU (20 μL de 1 acción MU/mL en 20 mL)
pH7.47.47.47.47.47.47.47.47.47.47.47.47.2
Graduado conNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHNaOHTrisTrisNaOHKOH

Tabla 1. Composición de soluciones utilizado en experimentación incluyendo ejemplos de externo y soluciones de pipeta monocanal (TRPV2) y célula de todo corrientes (tipo a).

Discusión

Los protocolos descritos anteriormente requieren práctica pero deben ser con un mínimo de resolución de problemas. En un día normal obtener arteriolas utilizables de 6-8 desde el aislamiento y lograr experimentos exitosos de 3-4. Si se encuentran problemas, sin embargo, hay algunos pasos que pueden tomarse para ayudar a mejorar las tasas de éxito. En ocasiones hemos encontrado, especialmente en ratas jóvenes (< 8 semanas), que el rendimiento de las arteriolas puede ser bajo. Para evitar este problema, sugerimos que el tejido retiniano (10-30 s a 500 x g) entre cada uno de la trituración de la centrifugación los pasos en pasos 1.12-1.14. Esto a menudo ayuda a mejorar el rendimiento de los barcos pero también aumentará la cantidad de restos de células dentro de la preparación.

Cuando canular vasos estudios miografía de presión es importante comprobar las arteriolas cuidadosamente para cualquier ramas laterales que pueden haber sido troceados cerca del sitio de la bifurcación. Esto representa una causa frecuente de fugas y pérdidas de presión durante la experimentación. El principal problema que puede surgir con los [Ca2 +] protocolos es el nivel de carga de tinte. Carga de tinte pobre conduce a proporciones bajas de señal a ruido, mientras se sobrecarga el resultado en la interrupción de la normal homeostasis de Ca2 + . Para reducir la probabilidad de que cualquiera de estas cuestiones, puede extraerse una pequeña alícuota de homogeneizado de retina y vasos aislados controlar periódicamente durante el protocolo de carga. Cuando la empresa experimentos de patch-clamp, la tasa de éxito de formación gigaseal es bien depende en gran medida de cómo la lámina basal ha sido digerida. Cuando inicialmente prueba este protocolo o utilizando nuevos lotes de enzimas puede ser necesario ajustar la concentración/duración de la digestión de la enzima. Supervisar cuidadosamente la separación de las capas endoteliales y músculo liso garantizará suficiente digestión quitar bastante basal laminal para acceder. También es necesario evitar la digestión excesiva, que puede manifestarse como el buque comienza a constrict monitoreo cuidadoso. Si esto ocurre, las células musculares lisas son a menudo demasiado frágiles para la grabación de patch clamp. Aplicación de enzimas, es importante incluir DNasa I para asegurar el retiro de cadenas de ADN liberados de las células dañadas durante el proceso de aislamiento. Fragmentos de ADN son pegajosos y causar el fórceps para adherirse a la arteriola durante las etapas finales del proceso de limpieza (paso 4.4), a menudo dando por resultado pérdida del buque. Limpieza de los vasos es técnicamente difícil y se realiza mejor a gran aumento (20 X) con movimientos suaves de barrido de pinzas cerradas del diámetro más fino posible punta. Entre barridos, limpie la pinza de rodillo del laboratorio.

Como se destacó antes, una motivación clave en el desarrollo de los protocolos descritos en este manuscrito era entender mejor por qué el flujo sanguíneo se interrumpe durante enfermedades vasculares de la retina. La mayor parte de nuestro trabajo hasta la fecha se ha centrado en la enfermedad de ojo diabética28,33. Las arteriolas pueden ser aisladas de las retinas de modelos experimentales de roedores de la diabetes mediante los métodos descritos en la sección 1. Cuando experimentando en arteriolas retinianas aisladas de animales diabéticos, es importante intentar replicar estrechamente las condiciones hiperglucémicos por barcos en vivo. Por esta razón, normalmente sería elevar los niveles D glucosa en nuestras soluciones experimentales a 25 mM y aislamiento. Engrosamiento de las membranas del sótano vasculares es un fenómeno bien reconocido en los vasos retinianos en diabetes34,35. Tratándose de animales con diabetes prolongada (duración de la enfermedad de > 1 meses), las concentraciones de la enzima mayor o tiempos de digestión a menudo se necesitan para permitir la aplicación de métodos de grabación de patch-clamp.

Una importante limitación del uso de ex vivo aislados arteriolas retinianas a estudiar fisiología vascular retiniana y Fisiopatología es la pérdida de los neuropilos de retina circundante. Aunque la eliminación de las células neuronales y gliales retinianas permite fácil acceso a las células del músculo liso vascular retiniano para estudios de fisiología celular, la respuesta de los vasos a mediadores vasoactivos puede cambiar dramáticamente en la ausencia y presencia de retina tejido. Las acciones de la adenosina tri-fosfato (ATP), por ejemplo, proporcionan una buena ilustración de este punto. En aislados arteriolas retinianas, además de ATP los disparadores de la rata una robusta constricción de los vasos36, mientras que en la presencia de un neuropilos intacto, los vasos se dilatan37. Por lo tanto, siempre que sea posible, generalmente tratamos de validar los resultados claves de los preparativos de la arteriola aislados utilizando ex vivo retinal todo-montajes y mediciones en vivo de vaso diámetro y sangre flujo16,37 . De la nota, nuevos métodos han surgido recientemente para el estudio de las pequeñas arteriolas y capilares en toda perfundidos porcina retinas ex vivo38,39. Estas preparaciones suelen mejorar grandemente nuestra comprensión de cómo los neuropilos retina regula tono arteriolar y capilar retiniano y cómo cambios en la hemodinámica retiniana modulan la actividad neuronal en la retina.

Aunque los procedimientos descritos en este documento se centran en el uso de arteriolas retinianas aislado de rata para fisiología comprensión de la célula del músculo liso arteriolar, actualmente estamos desarrollando protocolos para permitir también el estudio de la función endotelial de la célula en estos vasos. En trabajos previos, hemos tenido éxito en la modificación de la digestión enzimática de segmentos arteriolares retinianos para producir tubos de células endoteliales viables que son susceptibles de Ca2 + imagen y patchclamp estudios de grabación. Canulación de las arteriolas aisladas en ambos extremos, permitiendo intramural entrega de drogas, en el futuro podría también activar dependiente del endotelio respuestas vasodilatadoras investigarse en estos vasos.

Divulgaciones

Dr. Joanna Kur es ahora un empleado de Medtronic (ciudades gemelas, Minnesota, USA), su actual trabajo no entra en conflicto con la presentada aquí.

Agradecimientos

Desarrollo de los protocolos descritos en este trabajo fue apoyado por subvenciones de los organismos de financiamientos siguientes: BBSRC (BB/I026359/1), lucha para la vista (1429 y 1822), la Fundación de investigación de Diabetes Juvenil (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), British Heart Foundation (PG/11/94/29169), HSC R & D División (STL/4748/13) y MRC (MC_PC_15026).

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vasos de precipitadosFisherbrand15409083O cualquier producto equivalente
Tijeras curvasFisher Scientific50-109-3542O cualquier producto equivalente
Pipeta de plástico desechable / de transferenciaSarstedt86.11746mL es mejor, pero otros tamaños son aceptables; Retire la punta para ampliar la apertura
Microscopio de disecciónBrunel Microscopes LTDO cualquier producto equivalente
PinzasWorld Precision InstrumentsDumont #5 14095Cualquier pinza fina equivalente
Pipeta PasteurFisherbrand 11546963Pulida al fuego para reducir la fricción pero no lo suficiente como para estrechar la punta
Placa de PetriSigma-AldrichP7741O cualquier producto equivalente de 10 cm
Tetinade pipeta Fisherbrand12426180 O cualquier producto equivalente
Suministro de agua purificadaMerekMilli-Q Sistema Integral de Purificación de AguaO cualquier sistema equivalente
Tubo de ensayo de fondo redondoFisherbrand14-958-10 B5 mL; cualquier producto equivalente
Pinzas dentadasFisher Scientific17-467-230O cualquier producto equivalente
Cuchillas de un solo filoAgar ScientificT585O cualquier producto equivalente
SylgardDow Corning184O cualquier superficie flexible 
Bastidor de tubos de ensayoFisherbrand Derlin10257963O cualquier producto equivalente
Miografía
a presión manipulador mecánico de 3 ejesScientificaLBM-7 x2 (o cualquier producto equivalente)
Grifería de 3 víasCole-ParmerUY-30600-02O cualquier producto equivalente
Mesa de aireTechnical Manufacturing Corporation Bancolimpio o cualquier producto equivalente
Software de análisis Image Jhttps://downloads.imagej.net/fiji/Software de imagen gratuito
Plugin de análisisMyotraker https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002Plugin personalizado para imageJ Disponible gratuitamente para descargar
Pipeta de canulación de vidrioInstrumentos de percisión del mundoTW150F-4O cualquier producto equivalente
ComputadoraDellOptiplex 7010O cualquier producto equivalente
Termómetro digitalRS206-3722O cualquier producto equivalente
Fluo-4-AMThermo Fisher ScientificF14201Hacer 1 mM de culata en DMSO
PinzasWorld Precision InstrumentsDumont #7 14097Cualquier pinza fina equivalente
Fura-2-AMThermo Fisher ScientificF1221Hacer 1 mM de culata en DMSO
Cámara de grabación con fondo de vidrioWarner Instruments64-0759O cualquier producto equivalente
Vidriode pipeta auxiliarInstrumentos de percusión mundialIB150F-3O cualquier producto equivalente
Calentador en línea Hechoa medidaCalentador en línea de solución comercial equivalente SH-27B de Harvard Apparatus
Microscopio invertidoNikonEclypse TE 300O cualquier producto equivalente
ManómetroRiesterLF1459O cualquier producto equivalente
Extractorde microelectrodosInstrumentos SutterP97O cualquier producto equivalente
Microforge +  Microscopio Olympus CX 31GlassworksFine Point F-550O cualquier producto equivalente
MicromanipuladorSutter instrumentsMP-285O cualquier producto equivalente
Colector de suministro multicanal Automate ScientificPerfusion PencilO cualquier producto equivalente
Relleno de pipetas BD Plastipak1mLJeringa calentada y estirada al diámetro interno de la pipeta
Soporte de pipetaMolecular Devices1-HL-UO cualquier producto equivalente
Bomba de succiónInterpetAP1Bomba de aireación convertida por fuelle invertible
JeringaBD Plastipak20mL Luer-lokO cualquier producto equivalente
Alambre de tungstenoAdventW55881875μ m de diámetro
Tygon TubingVWRtamaños variosO cualquier producto equivalente
Cámara USB  Logitech HD Pro Webcam C920O cualquier producto equivalente
Software de captura de vídeoHypercamversión 2.28.01O cualquier producto equivalente
Baño de aguaGrantSub Aqua 12 PlusO cualquier producto equivalente
x20 lenteNikon20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17O cualquier producto equivalente
x4 lenteNikon4x/0.10, WD 30, ∞/-O cualquier producto equivalente
Conectores en Y WorldPercision Instruments14012O cualquier producto equivalente
Abrazadera
de 3 víasCole-ParmerUY-30600-02O cualquier producto equivalente
manipulador mecánico de 3 ejesScientificaLBM-7 O cualquier producto equivalente
la mesa de aire Banco limpioO cualquier producto equivalente
Anfotericina BSigma-AldrichA24113 mg disueltos diariamente en 50 μ L de DMSO (sonicato para disolver)
AmplificadorDispositivos MolecularesAxopatch 200aO cualquier producto equivalente
Convertidor digital analógicoAxonDigidata 1440AO cualquier producto equivalente
Colagenasa Tipo 1ASigma-AldrichC9891 0,1 mg/ml en HCL
ComputadoraDellOptiplex 7010O cualquier producto equivalente
Termómetro digitalRS206-3722O cualquier producto equivalente
DNAse IMillipore260913Material de trabajo 1 MU mL-1 (10 MU diluido en 10 mL LCH) 
Jaula de FaradayHecho aCualquier producto comercial equivalente
Pinzas finasDumontNo. 7Cualquier pinza superfina
Cámara de grabación con fondo de vidrioWarner Instruments64-0759O cualquier producto equivalente
HeadstageMolecular DevicesCV203BUO cualquier producto equivalente
Calentador en línea Hechoa medidaEquilavent comercial SH-27B Solución Calentador en línea de Harvard Apparatus
Microscopio invertidoNikonEclypse TE 300O cualquier producto equivalente
Extractor de microelectrodosSutter instrumentsP97O cualquier producto equivalente
Microforge +  Microscopio Olympus CX 31GlassworksFine Point F-550O cualquier producto equivalente
MicromanipuladorSutter instrumentsMP-285O cualquier producto equivalente
Colector de suministro multicanal Automatice ScientificPerfusion PencilO cualquier producto equivalente
Software de parcheoMolecular DevicesPclamp v10.2O cualquier producto equivalente
Pipeta filler BD Plastipak1mLJeringa calentada y estirada hasta el diámetro interno de la pipeta Soporte de
pipetaMolecular Devices1-HL-UO cualquier producto equivalente
Proteasa Tipo XIVSigma-AldrichP5147 0,01 mg/ml en HCL
Pipeta monocanal de vidrioWorld Percision instrumentsIB150F-3O cualquier producto equivalente
Bomba de succiónInterpetAP1Bomba de aireación convertida por fuelle invertible
JeringaBD Plastipak20mL Luer-lokO cualquier producto equivalente
Alambre de tungstenoAdventW55741850μ m de diámetro
Tygon TubingVWRvarios tamañosCualquier producto equivalente para adaptarse a
cámara USB  Logitech HD Pro Webcam C920O cualquier producto equivalente
Baño de aguaGrantSub Aqua 12 PlusO cualquier producto equivalente
Pipeta de celda enteravidrio Warner InstrumentsGC150TF-7.5O cualquier producto equivalente
x20 lenteNikon20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17O cualquier producto equivalente
x4 lenteNikon4x/0.10, WD 30, ∞/-O cualquier producto equivalente
x40 lente Nikon40x/0.55, WD 2.1, ∞/1.2O cualquier producto equivalente
Conectores en Y WorldPercision Instruments14012O cualquier producto equivalente
Ca2+ de imagen
víasCole-ParmerUY-30600-02O cualquier producto equivalente
de 3 ejes manipulador mecánicoScientificaLBM-7 O cualquier producto equivalente
Software de adquisición Cairn Investigación Ltda.Motor de adquisición V1.1.5O cualquier producto equivalente; microfluorimetría
Mesa de aireCorporación Técnica de Fabricación Bancolimpio O cualquier producto equivalente Software de
análisis para imágenes confocalesImage Jhttps://downloads.imagej.net/fiji/Software de imagen gratuito
ComputadoraDellOptiplex 7010O cualquier producto equivalente
Microscopio confocalLeica GeosystemsSP5 O cualquier producto equivalente; confocal
Termómetro digitalRS206-3722O cualquier producto equivalente
Pinzas finasDumontNo. 7Cualquier pinza superfina
Cámara de grabación con fondo de vidrioWarner Instruments64-0759O cualquier producto equivalente
Calentador en línea Hechoa medidaEquilavent comercial SH-27B Solución Calentador en línea de Harvard Apparatus
Invertido microscopioNikonEclipse TE2000O cualquier producto equivalente; microfluorimetría
Monocromador Cairn Investigación Ltda.OptoscanO cualquier producto equivalente; microfluorimetría
Colector de suministro multicanal Automate ScientificPerfusion PencilO cualquier producto equivalente
Relleno de pipetas BD Plastipak1mLJeringa calentada y estirada al diámetro interno de la pipeta
Software para microscopio confocalLeica GeosystemsLAS-AF versión 3.3.O cualquier producto equivalente; confocal
Bomba de aspiraciónInterpetAP1Bomba de aireación convertida por fuelle inversor
JeringaBD Plastipak20mL Luer-lokO cualquier producto equivalente
Alambre de tungstenoAdventW55741850μ m de diámetro
Tygon TubingVWRvarios tamañosCualquier producto equivalente para adaptarse Baño
de aguaGrantSub Aqua 12 PlusO cualquier producto equivalente
Lente Nikon x100N.A. 1.3 aceiteO cualquier producto equivalente; microfluorimetría
lente x20Nikon20x/0.40 WD 3.8, ∞/0.17O cualquier producto equivalente; microfluorimetría
Lente x20Leica GeosystemsHCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, ∞/0.17/DO cualquier producto equivalente; lente confocal
x4Nikon4x/0.10, WD 30, ∞/-O cualquier producto equivalente; microfluorimetría
lente x63Leica GeosystemsHCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS ∞/0.17/EO cualquier producto equivalente; conectores Y confocales
World Percision Instrumentos14012O cualquier producto
equivalentePipetasEspecificaciones y ajustes para la fabricación de pipetas para experimentación
Helper pipetaWorld Percision instrumentsIB150F-3Diámetro interior: 0,86 mm
Rampa: 261
Presión: 300
Calor: 280
Tirón : 0
Velocidad: 56
Tiempo: 250
Nº de ciclos: 4
Diámetro de la punta: 0.5-2 μ m
Pulido: sí
Resistencia final: >10 MΩ
Pipeta de canulaciónWorld Percision instrumentsTW150F-4Diámetro interior: 1,17 mm
Rampa: 290
Presión: 300
Calor: 280
Tirón: 0
Velocidad: 58
Tiempo: 150
Nº de ciclos: 4
Diámetro de la punta: 3-10 μ m
Pulido: no
Resistencia final: < 1 MΩ
Parcheo en celdaInstrumentos World PercisionIB150F-3Diámetro interior: 0,86 mm
Rampa: 261
Presión: 300
Calor: 280
Tirón: 0
Velocidad: 56
Tiempo: 250
Nº de ciclos: 4
Diámetro de la punta: 0,5-2 μ m
pulido: sí
resistencia final: >5 MΩ
Parcheo de celda completaWarner InstrumentsGC150TF-7.5Diámetro interior: 1.17 mm
Rampa: 296
Presión: 200
Calor: 287
Tirón: 0
Velocidad: 50
Tiempo: 250
Nº de ciclos: 4
Diámetro de la punta: 2-3 μ m
Pulido: útil pero no necesario
Resistencia final: 1-2 MΩ
de parcheCorporación de fabricación técnica de medida la grifos de 3

Referencias

  1. Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Diabetes. 44, 603-607 (1995).
  2. Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects. American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).
  3. Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis? Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).
  4. Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease). Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).
  5. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).
  6. Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
  7. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).
  8. Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).
  9. Delaey, C., Van de Voorde, J. Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation. Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).
  10. Metea, M. R., Newman, E. A. Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling. Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).
  11. Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. Regulation of retinal blood flow in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).
  12. Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).
  13. Shepro, D., Morel, N. M. Pericyte physiology. The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).
  14. Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network. Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).
  15. Matsushita, K., Puro, D. G. Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes. Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).
  16. Needham, M., et al. The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).
  17. Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles. Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).
  18. Delaey, C., Van de Voord, J. Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).
  19. Kur, J., et al. Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).
  20. Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles. British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).
  21. Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).
  22. McGahon, M. K., et al. TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).
  23. Guidoboni, G., et al. Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).
  24. Scholfield, C. N., Curtis, T. M. Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina. Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).
  25. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).
  26. Sakmann, B., Neher, E. Single Channel Recording, Second Edition. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).
  27. Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis. PLoS One. 9, e91791(2014).
  28. McGahon, M. K., et al. Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle. Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).
  29. Curtis, T. M., Scholfield, C. N. Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle. Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).
  30. Tumelty, J., et al. Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).
  31. Huynh, K. W., et al. Structural insight into the assembly of TRPV channels. Structure. 22 (2), 260-268 (2014).
  32. McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).
  33. McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes. Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).
  34. Ljubimov, A. V., et al. Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).
  35. Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).
  36. Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells. Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).
  37. Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).
  38. Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level. Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).
  39. P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo. Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).

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