Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única

Summary

Aquí, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína por microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) utilizando un sustrato de ADN λ site-specifically modificado y un etiquetado proteína del punto cuántico.

Abstract

La microscopía de fluorescencia ha hecho grandes contribuciones en la disección de los mecanismos de los procesos biológicos complejos en el plano de la molécula sola. En los ensayos de molécula única para el estudio de las interacciones DNA proteína, hay dos factores importantes para su consideración: el sustrato de ADN con suficiente longitud para la observación fácil y etiquetado una proteína con una sonda fluorescente adecuada. 48,5 kb λ DNA es un buen candidato para el sustrato de la ADN. Puntos cuánticos (Qdots), como una clase de sondas fluorescentes, permiten la observación de largo plazo (de minutos a horas) y adquisición de imágenes de alta calidad. En este trabajo, presentamos un protocolo de estudio de las interacciones DNA-proteína a nivel de una sola molécula, que incluye preparar un site-specifically modificado λ DNA y etiquetado una proteína diana con Qdots recubiertas de estreptavidina. Para una prueba de concepto, elegir ORC (reconocimiento de origen complejo) en levadura de florecimiento como una proteína de interés y visualizar su interacción con un ARS (secuencia de replicación Autónoma) usando TIRFM. En comparación con otras sondas fluorescentes, Qdots tienen ventajas obvias en los estudios de molécula única debido a su alta estabilidad contra el fotoblanqueo, pero cabe señalar que esta propiedad limita su aplicación en ensayos cuantitativos.

Introduction

Las interacciones entre proteínas y ADN son esenciales para muchos procesos biológicos complejos, como la replicación del DNA, la reparación del ADN y la transcripción. Aunque los enfoques convencionales han arrojado luz sobre las propiedades de estos procesos, muchos de los mecanismos claves aún no están claros. Recientemente, con el rápido desarrollo técnicas sola molécula, algunos de los mecanismos han sido accedido^1,2,3.

La aplicación de la microscopia de la fluorescencia de una sola molécula en visualizar las interacciones DNA proteína en tiem....

Protocol

1. preparación del sustrato de ADN λ-ARS317

1. Embalaje y construcción del sustrato de ADN
   1. Digerir el ADN nativo λ mediante XhoI enzima; amplificar un cojinete de fragmento de ADN de bp 543 ARS317 de la DNA genomic de florecimiento levadura usando las cartillas que contienen 20 homóloga de la bp secuencias de aguas arriba y aguas abajo de XhoI sitio de la enzima en el ADN de lambda. Añadir 100 ng de Xhodigiere ADN λ y 10 ng de ADN fragmento a 10 μl de sistema de reacción de recombinación homóloga e incubar la reacción a 37 ° C durante 30 minutos.
   2. Para la recombinación λ DNA del paquete, añadir 25 μl de los extractos....

Results

Para visualizar la interacción entre etiquetado Qdot ORC y la ARS, se construyó primero el sustrato de ADN λ ARS317. Un fragmento de ADN que contiene ARS317 fue integrado en Xhositio (33,5 kb) de nativos λ DNA por recombinación homóloga (figura 1A). El producto de la recombinación fue empaquetado usando los extractos y las partículas de fagos empaquetados fueron cultivadas en placas de LB (figura 1B). La placa de fagos p.......

Discussion

Aquí, presentamos un protocolo para observar la interacción entre la proteína marcada Qdot y el ADN λ site-specifically modificado utilizando el TIRFM en una celda de flujo. Las medidas incluyen la modificación específica de sustrato de ADN, ADN biotinylation, cubreobjetos limpieza y funcionalización, celda de flujo la preparación y proyección de imagen de una sola molécula. Hay dos puntos clave que deben tenerse. En primer lugar, todos los pasos involucrados con λ DNA deben manipularse con cuidado para reducir posibles .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lambda DNA	New England Biolabs	N3011	Tienda 25 μ L alícuotas a -20 ºC.
XhoI enzima	Thermo Fisher Scientific	FD0694
Kit de clonación de fusión rápida	Biotool	B22611
MaxPlax Lambda Packaging Extracts	Epicentre	MP5110	La cepa bacteriana LE392MP está incluida en este paquete.
MgSO4	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10013092	Cualquier marca es aceptable.
Tris	Amresco	0497-5KG
NaCl	Beijing Chemical works	N/A	Cualquier marca es aceptable.
MgCl2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10012818
Chloroform	Beijing Chemical Works	N/A	Cualquier marca es aceptable.
NZ-amina	Amresco	J853-250G
Ácidos Casamino	Sigma-Aldrich	22090-500G
PEG8000	Beyotime	ST483
Aparato de agitación magnética	IKA	KMO2 basic
15 mL Tubo Eppendorf Eppendorf	30122151		15 mL, estéril, a granel, 500 piezas
Rnase	SIGMA	R4875-100MG
Dnase	SIGMA	D5319-500UG
Proteinasa K	Amresco	0706-100MG
Imprimaciones biotiniladas	Thermo Fisher Scientific	N/A
T4 ADN ligasa, T4 ADN ligasa, tampón de reacción (10x)	New England Biolabs	M0202
Coverslip	Thermo Fisher Scientific	22266882
Etanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009259
Hidróxido de potasio (KOH)	Sigma-Aldrich	306568-100G
Acetona	Thermo Fisher Scientific	A949-4
H2SO4	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	80120891	ácido sulfúrico
H2O2	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10011218	30% Peróxido de hidrógeno
Metanol	Sigma-Aldrich	322415-2L
Ácido acético	Sigma-Aldrich	V900798
APTES	Sigma-Aldrich	A3648
mPEG (metoxi-polietilenglicol)	Lysan	mPEG-SVA-5000
biotina-PEG (biotina-polietilenglicol)	Lysan	Biotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3	Sigma-Aldrich	31437-500G
Desecador de vacío	Tianjin Branch Billion Lung Experimental Equipment Co., Ltd.	IPC250-1
Envasadora al vacío	MAGIC SEAL	WP300
Trazador de vidrio con punta de diamante	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	70036
Corredera de vidrio	Marca de vela	7101
Tubo de entrada	SCI (Scientific Commodties INC.)	BB31695-PE/2	diámetro interior 0,38 mm; diámetro exterior 1,09 mm.
Tubo de salida	SCI (Scientific Commodties INC.)	BB31695-PE/4	diámetro interior 0,76 mm; diámetro exterior 1,22 mm.
Cinta adhesiva de doble cara	Sigma-Aldrich	GBL620001-1EA
Epoxi	LEAFTOP	9005	cinco minutos epoxi
Estreptavidina	Sigma-Aldrich	S4762
Microscopio de fluorescencia	Olympus	IX71
Bomba programable de infusión/extracción	Aparato Harvard	70-4504
Láser de 532 nm	Láser coherente	Zafiro-532-50
nm Coherente		OBIS-640-100
EMCCD Cámara	Andor	DU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging óptica de división	Hamamatsu fotónica K.K.	A12801-01
Sistema de iluminación TIRF	Olympus	IX2-RFAEVA2
60× Objetivo TIRF	Olympus	APON60XOTIRF
Divisor de haz dicroico láser de cuatro filos	Semrock	Di01-R405/488/ 532/635-25x36
Filtro de paso de banda cuádruple	Semrock	FF01-446/510/ 581/703-25
Divisor de haz dicroico	Semrock	FF649-Di01-25x36
Filtro de emisión	Tecnología Chroma Corp	ET585/65m
Filtro de emisión	Chroma Technology Corp	ET665lp
FocalCheck fluorescencia, portaobjetos de prueba de microscopio #1	Thermo Fisher Scientific	F36909
SYTOX Naranja	Thermo Fisher Scientific	S11368
Qdot705 Estreptavidina Conjugado	Thermo Fisher Scientific Q10163MP		Store a las 4 º C, no congelar.
ATP	Amresco	0220-25G	Prepare una solución de ATP de 200 mM, utilizando ddH2O, ajuste el pH a 7.0 y almacene 10 μ L alícuotas a -20 ºC.
TDT	Amresco	M109-5G	Prepare la solución 1 M utilizando ddH2O, y almacene 10 μ l alícuotas a -20 ºC.