El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.
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Artículo de método
Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II
En este artículo
Resumen
Resumen
Globales defectos en la transcripción del RNA polimerasa II podrían dominados por transcriptómicos estudios análisis de RNA de estado estacionario. De hecho, la disminución global en la síntesis de ARNm ha demostrado ser compensado por una disminución simultánea en la degradación del mRNA para restaurar los niveles de estado estacionario normales. Por lo tanto, la cuantificación del genoma de la síntesis de mRNA, independientemente del decaimiento del mRNA, es el mejor reflejo directo de la actividad transcripcional de RNA polimerasa II. Aquí, discutimos un método usando el etiquetado metabólico no perturbar de ARN naciente en Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae). En concreto, las células se cultivan para el minuto 6 con un uracilo analógico, 4-tiouracilo y el etiquetado ARN recién transcrito es purificado y cuantificado para determinar las tasas de síntesis de los ARNm individuales. Por otra parte, utilizando etiquetado Schizosaccharomyces pombe células como estándar interno permite comparar la síntesis de mRNA en S. cerevisiae de diferentes cepas. Usando este protocolo y montaje de los datos con un modelo cinético dinámico, se pueden determinar las tasas de decaimiento de ARNm correspondiente.
Introducción
Las células responden a estímulos endógenos y exógenos, a través de la alteración de la dinámica de su programa de expresión génica. En los últimos años un enorme desarrollo de metodologías de genoma permite la descripción precisa y completa de transcriptoma cambios en diferentes condiciones. En la mayoría de los estudios de transcriptómicos, microarray hibridación o alto rendimiento de secuenciación se utilizan para cuantificar niveles de ARN de una fracción de RNA total de estado estacionario. Cambios transcripcionales bajo una perturbación específica pueden mostrar una amplia gama de resultados posibles, con un amplio espectro de genes ser para arriba - u o o cambi....
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Protocolo
1. célula de cultivo y el agotamiento de la rapamicina de una subunidad de la SAGA
- Para cada cepa de S. cerevisiae y repetición, incluyendo tipo o cepas de control, inocular una colonia solo de un plato fresco en 5 mL de medio YPD (2% peptona, extracto de levadura 1% y 2% de glucosa).
- Cultivar células de S. cerevisiae durante la noche a 30 ° C con agitación constante (150 rpm).
- Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) y diluir la cultura a un OD600 de aproximadamente 0,1 en 100 mL de medio YPD y dejarla crecer hasta que el OD600 es alrededor de 0,8.
- En paralelo, inocular una so....
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Resultados
Cuando se realiza el etiquetado metabólico del ARN recién transcrito, varios aspectos que controlar: el tiempo y la eficiencia de la rotulación, la proporción de espiga en, el protocolo de extracción y la eficacia de Biotinilación (incluyendo signal to noise ratio), entre otros. Estas condiciones han sido extensivamente y metódicamente demostradas por otros7,10,11. Aquí nos centramos principalmen.......
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Discusión
Mientras todavía están mejorando herramientas de genoma para analizar cambios en la transcripción, el único análisis de transcriptoma a través de la cuantificación de los niveles de estado estacionario del ARN podría no reflejan cambios en la actividad de RNA polimerasa II. De hecho, niveles de ARNm están regulados no sólo por la síntesis de ARN, sino también por su maduración y degradación. Para medir la síntesis de mRNA desacoplado de la degradación del mRNA, distintos protocolos se han desarrollado en los últimos años.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a Laszlo Tora por su apoyo y V. Fisher, Schumacher K. y F. El Saafin para sus discusiones. T.B. fue apoyado por una beca Marie Curie ITN (PITN-GA-2013-606806, NR-NET) y la Fundación arco. Este trabajo fue financiado por los fondos de la Agence Nationale de la Recherche (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). Este estudio fue apoyado también por ANR-10-LABX-0030-INRT, un fondo del Estado francés a cargo de la Agence Nationale de la Recherche en el marco programa Investissements Avenir ANR-10-IDEX-0002-02.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4-Tiouracilo | Sigma-Aldrich | Gato# 440736 | |
| Rapamicina | Euromedex | Cat# SYN-1185 | |
| Countess II FL Contador de células automatizado | ThermoFisher | N/A | |
| Kit de purificación de ARN RiboPure, levadura | ThermoFisher | Cat# AM1926 | |
| NanoDrop 2000 Espectrofotómetro | ThermoFisher | ND-2000 | |
| TURBO Kit sin ADN | ThermoFisher | AM1907 | |
| EZ-Link HPDP Biotina | ThermoFisher | Cat# 21341 | |
| Tiolutina | Abcam | ab143556 | |
| µ MACS Kit de estreptavidina | Miltenyi Biotec | Cat# 130-074-101 | |
| Transcriptor Transcriptasa Inversa | Roche | 03 531 295 001 | |
| SYBR Green I Master | Roche | 4707516001 | |
| GeneChip Levadura Genome 2.0 | ThermoFisher | 900555 | |
| GeneChip Estación de fluidos 450 | ThermoFisher | 00-0079 | |
| GeneChip Escáner 3000 7G | ThermoFisher | 00-0210 |
Referencias
- Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
- Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
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Reimpresiones y permisos
