Modelado enfermedad del Charcot-Marie-diente In Vitro por transferencia primaria Motoneurons de ratón

Resumen

El objetivo de esta técnica es preparar una cultura altamente enriquecida de primarias motoneuronas (MNs) de murine de la médula espinal. Para evaluar las consecuencias de las mutaciones que causan enfermedades de MN, Describimos aquí el aislamiento de estos aislados MNs y su transfección por magnetofection.

Resumen

Neurodegeneración de espinales motoneuronas (MNs) está implicada en un amplio espectro de los trastornos neurológicos como esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, atrofia muscular, que son asociados con atrofia muscular. Cultivos primarios de MNs espinales se han utilizado extensamente para demostrar la implicación de genes específicos en este tipo de enfermedades y caracterizar las consecuencias celulares de sus mutaciones. Esta cultura de modelos un MN primaria protocolo deriva de la obra seminal de Henderson y colegas hace más de veinte años. En primer lugar, detalle un método de disección de los cuernos anteriores de la médula espinal de un embrión de ratón y aislar el MNs de los vecinos las células utilizando un gradiente de densidad. A continuación, presentamos una nueva forma de transferencia eficiente MNs con plásmidos de expresión utilizando magnetofection. Finalmente, ilustramos cómo solucionar y immunostain primaria que mns mediante mutaciones de neurofilamentos que causan la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2, este protocolo muestra un enfoque cualitativo a la expresión de proteínas de interés y estudiar su participación en MN el crecimiento, mantenimiento y supervivencia.

Introducción

Enfermedades neuromusculares abarcan una gran variedad de patologías clínicamente y genéticamente distintos que se caracterizan por la alteración del músculo o del sistema nervioso. Debido a los avances en tecnologías de secuenciación, se han identificado cientos de genes responsables de estas enfermedades raras durante la última década (lista disponible en el centro de enfermedad Neuromuscular, http://neuromuscular.wustl.edu/index.html). La variedad de mutaciones identificadas indica que diferentes mutaciones en un solo gen pueden producir diferentes fenotipos y enfermedades^1,2,3<....

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales fueron aceptados por el Comité de ética de la institución.

1. preparación de la solución

1. Preparar 10 mL de BSA dializaron en medio L-15 el 4%.
   1. Albúmina de suero bovino en polvo al 4% (w/v) se disuelven en 10 mL de medio de L-15.
   2. Añadir la solución en una casete de diálisis 20 mL con corte 20 kDa. Dializan contra 500 mL de medio de L-15 durante 3 días en agitación a 4 ° C. Cambiar el medio L-15 cada día.
   3. Filtrar la solución a través de 0,22 μm membrana y Alicuotar en tubos de 15 mL. Almacenar los tubos a-20 ° C.
      Nota: Este protocolo usa las siguientes....

Resultados

Después de 24 horas en la cultura, motoneuronas (MNs) ya deben mostrar un crecimiento axonal importante (por lo menos 6 veces más que el tamaño del soma). En los días siguientes, axones deben seguir creciendo y la exhibición de ramificación (figura 2). Habrá diferentes morfologías debido a las especificidades del subtipo. Por ejemplo, media columna MNs que inervan los músculos axiales tienen axones más cortos y más ramificadas que columna lateral motor MNs qu.......

Discusión

Uno de los puntos críticos de este protocolo es que se disecan los embriones de ratón en una ventana de tiempo preciso durante el desarrollo (E12.5) para optimizar la cantidad de MNs obtenida al final. Además, para un rendimiento óptimo, la disección debe realizarse por la mañana o temprano por la tarde. Antes de E12.5 (por ejemplo, en E11.5), la disección es difícil, especialmente con respecto a la eliminación de las meninges. Después de E12.5, el número de MNs obtenidas cae significativamente. Para controlar l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MaterialPlato de
disección de silicona Instrumentación	sistemas vivos	DD-90-S-BLK-3PK	Sylgard
cubreobjetos redondos	NeuVitro, Knittel vidrio	GG-12-Pre	12 mm
Slide a Lyzer casetes	ThermoFisher Scientific	66030	20,000 MWCO ; 30 mL
Unidad de filtro	Millipore	SCGVU02RE
GP Filtros de jeringa estériles	Millipore	SLGP033RS
placa de 4 pocillos	ThermoFisher Scientific	167063	Nunclon Delta pinza
placa	tratada FST de Dumont	11252-20	#5
tijera	FST de Dumont	14060-10	de tijera
	fina FST de Dumont	10035-20
bisturí	FST by Dumont	10316-14	micro-cuchillo bisturí Placa de
Petri	Greiner	663102	ø x h = 100 x 15
mm Tubo de polipropileno de 15 mL	Falcon	352096
	Watman Círculo	1001125	, 125 mm de diámetro
portaobjetos de cámara de vidrio	Lab-Tek	154526	4 cámaras
Plásmido pCAGEN	Addgene	#11160
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Soluciones y medios
Albúmina	sérica bovinaSigma-Aldrich	A9418
L-15 medio	ThermoFisher Scientific	11415056
L-15 medio, sin fenol rojo	ThermoFisher Scientific	21083027
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634
Putrescina	Sigma-Aldrich	P5780
Conalbúmina	Sigma-Aldrich	C7786
Selenito de sodio	Sigma-Aldrich	S5261
Progesterona	Sigma-Aldrich	P8783
Poly-DL-Ornitina	Sigma-Aldrich	P8638
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020
tripsina 2,5%, 10x	ThermoFisher Scientific	15090046
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
PBS sin Ca Mg	ThermoFisher Scientific	14190144	sin Mg2+ Ca2+
bicarbonato sódico	ThermoFisher Scientific	25080094
Medio de cultivo de células neuronales	ThermoFisher Scientific	A3582901	Neurobasal Plus
HBSS	Sigma-Aldrich	H6648-500ML
HEPES tampón 1 M	ThermoFisher Scientific	15630056
Medio radiante de densidad	Sigma-Aldrich	D1556	Optiprep
medio de suplemento	ThermoFisher Scientific		A3582801 B-27 Plus
Suero de caballo inactivado por calor ThermoFisher	Scientific	26050-088
L-Glutamina 200 mM	ThermoFisher Scientific	25030024
2-mercaptoetanol	ThermoFisher Scientific	31350010
penicilina/estreptomicina	ThermoFisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Name	Company	>Número de catálogo	Comments
Immuno fluorescencia
PBS, 10x	ThermoFisher Scientific	X0515	sin Mg2+ Ca2+
Paraformaldehído (PFA)	Sigma-Aldrich	441244
normal suero de cabra	Sigma-Aldrich	G6767
glicina	Sigma-Aldrich	G7126
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Colina Acetil Transferasa (CHAT)	Chemicon	Ab144P
Neurofilamento H no fosforilado (SMI32)	Biolegends	SMI-32P	IF a 1/1000
Islote-1	DSHB	40.2D6
Islote-2	DSHB	39.4D5
Hb9	DSHB	81.5C10
Medio de montaje Vectashield	Vector Lab	H-1000
Beta3 tubulina (clon Tuj1)	Biolegends	801201	IF a 1/1000
Lc3b	Tecnología de señalización celular	#2775	IF a 1/200

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