Una novedosa técnica quirúrgica como base para In Vivo parcial ingeniería hígado de rata

Resumen

Establecemos una novedosa técnica quirúrgica para un modelo de perfusión en vivo solo lóbulo hepático de rata como requisito previo para el estudio adicional en vivo hígado parcial en el futuro de la ingeniería.

Resumen

Ingeniería de órganos es una nueva estrategia para generar sustitutos de hígado órgano que potencialmente pueden ser utilizados en el trasplante. Recientemente, en vivo hígado ingeniería, incluyendo en vivo órgano descelularización seguido de repoblación, ha surgido como un enfoque prometedor sobre ingeniería ex de vivo hígado. Sin embargo, no se logró la supervivencia postoperatoria. El objetivo de este estudio es desarrollar una nueva técnica quirúrgica en vivo perfusión selectiva del lóbulo hepático en las ratas como requisito previo para la ingeniería en vivo hígado. Generamos un circuito bypass sólo a través del lóbulo lateral izquierdo. Entonces, el lóbulo lateral izquierdo es inundado con solución salina heparinizada. El experimento se realizó con 4 grupos (n = 3 ratas por grupo) basado en tiempos diferentes de la perfusión de 20 min, 2 h, 3 h y 4 h. supervivencia, así como el cambio macroscópico visible del color y la ausencia histológico determinada de células de la sangre en el tríada portal y los sinusoides, es tomado como un indicador para el establecimiento de un modelo de éxito. Después de la perfusión selectiva del lóbulo lateral izquierdo, observamos que el lóbulo lateral izquierdo, de hecho, dio vuelta de rojo a amarillo débil. En una evaluación histológica, células de la sangre no son visibles en la rama de la vena porta, la vena central y los sinusoides. El lóbulo lateral izquierdo cambia a rojo después de la reapertura de los vasos obstruidos. 12/12 ratas sobrevivieron el procedimiento más de una semana. Somos el primer para divulgar un modelo quirúrgico para la perfusión sola lóbulo hepático en vivo con un período de supervivencia larga de más de una semana. En contraste con el informe previamente publicado, la ventaja más importante de la técnica presentada aquí es que la perfusión del 70% del hígado se mantiene a lo largo de todo el procedimiento. El establecimiento de esta técnica proporciona una base para en vivo parcial ingeniería hepática en ratas, como descelularización y recelularización.

Introducción

Las indicaciones para el trasplante de órganos están ampliando constantemente. Por el contrario, están disminuyendo las tasas de donación de órganos y la calidad general de los órganos, llevando a una creciente demanda de injertos. Continuó aumentando el número de candidatos ha añadido a la lista de espera de trasplante de hígado (p. ej., en los Estados Unidos, 11.340 pacientes fueron agregados en el año 2016, en comparación con 10.636 en 2015)¹. A pesar de considerables esfuerzos, el número de órganos disponibles necesidades clínicas. Debido a la incidencia creciente de enfermedad hepática, muchos pacientes con enfermedades hepáticas de fase final muere en lista de espera de trasplante ante un órgano de donante disponible. Para satisfacer la enorme demanda de injertos de donantes, alternativas, utilizando tejido del hígado principios de ingeniería están siendo activamente persiguen². Hoy en día, una técnica biológica desarrollada recientemente de ingeniería hepática potencialmente podría superar esta escasez.

Ingeniería hígado consta de dos pasos: la generación de un andamio acelular, seguido de una repoblación del andamio. Para obtener un andamio biológico de hígado acelular, el hígado explanted es inundada por el sistema vascular con detergentes iónicos o no iónicos, que se puede quitar el material celular del hígado. En la mayoría de los estudios anterior, un andamio biológico de hígado acelular fue alcanzado por la perfusión del hígado con una combinación de dodecil sulfato de sodio y TritonX100. Como resultado, todas las células fueron quitadas, mientras que se mantuvo la estructura de la matriz extracelular. Las matrices de soporte de órgano fueron resembrados con células maduras, hepatocelular, así como líneas de células endoteliales y hepatocitos primarios con o sin la aplicación simultánea de las células endoteliales o células madre mesenquimales (MSC). Enfoque de los investigadores más en vivo ex hígado ingeniería^{3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14}. Sin embargo, en la mayoría de los estudios anterior, sólo pequeños trozos de cubos repoblado andamio fueron transplantadas en sitios diferentes de implantación heterotópica. En algunos estudios, andamios repoblación parciales fueron trasplantados como injertos auxiliares. Sin embargo, la máxima supervivencia divulgada fue sólo 72 h^8,14. Lo que sabemos, trasplante ortotópico de un injerto completo higado repoblado aún no ha sido realizado o publicado sobre. La función a largo plazo y trasplante de órganos modificados son todavía en su infancia. Por lo tanto, es necesario un enfoque alternativo a la ex vivo hígado ingeniería.

En vivo hígado ingeniería puede representar una alternativa para el estudio hepático repoblación bajo condiciones fisiológicas. Las ventajas de en vivo hígado ingeniería comparado con ingeniería ex de vivo hepática son múltiples. En vivo repoblado parcial hígado andamio está sometido a perfusión sanguínea fisiológica con la temperatura adecuada, suficiente oxígeno, nutrientes y factores de crecimiento en contraste con perfusión ex vivo con medio de cultivo artificial. Además, el hígado normal parcial restante mantiene la función hepática, principalmente, lo que permite la supervivencia a largo plazo. Puesto que un injerto de hígado implantado ex vivo diseñado es todavía incapaz de sostener la supervivencia a largo plazo de animales de experimentación por su función hepática⁸, imaginamos que en vivo parcial hígado engineeringwould en última instancia convertirse en un modelo prometedor para estudiar más la evolución de la ingeniería hígados con más observaciones de supervivencia de ex vivo.

Recientemente, un grupo de investigación (Pan y colegas) presentó, por primera vez, una técnica de en vivo hígado ingeniería¹⁵. Alcanzaron la perfusión aislada del lóbulo inferior derecho hígado en ratas vivas a pesar de los desafíos técnicos y anatómicos. Ellos reportaron los primeros resultados intraoperativos de en vivo repoblación mediante una línea de celular de hepatocitos primarios de rata. Sin embargo, el modelo de perfusión quirúrgica en vivo de Pan et al. tiene desventajas. Alcanzaron la perfusión sola lóbulo hepático en ratas a costa de bloquear totalmente la vena porta y vena cava inferior, que puede causar grave daño al animal. Las ratas experimentales fueron sacrificadas después de sólo 6 horas de tiempo de observación intraoperatoria. Por lo tanto, la técnica de perfusión en vivo lóbulo hepático necesita mejora para lograr la supervivencia postoperatoria.

Desarrollamos un modelo de supervivencia nuevo para en vivo lóbulo hepático de la perfusión, basado en estudios previos de la Anatomía hepática de rata¹⁶, la técnica de canulación de la vena porta para monitoreo hemodinámico en ratones¹⁷y Bioingeniería hígado ^{18 , 19}. los pasos claves para el procedimiento se ilustración en la figura 1A - 1E.

Esta técnica es adecuada para aquellos que quieran utilizar este modelo de perfusión experimental en vivo para la investigación básica en el tratamiento de órgano parcial por infusión de drogas, descelularización en vivo como una resección química para las enfermedades de órgano (p. ej. , cáncer de hígado), en vivo el cultivo de células en una matriz decellularized comparar ex vivo bidimensional y tridimensional de la célula cultura sistemas^{20,21,22,23 , 24 , 25 , 26}y en vivo hígado ingeniería descelularización y repoblación.

Protocolo

La vivienda y todos los procedimientos realizados fueron conforme a legislación de bienestar animal alemán. Toda la gasa, cubierta de ropa e instrumentos quirúrgicos son esterilizado y preparado antes de la operación. Todos los procedimientos se llevan a cabo en condiciones estériles.

1. preparación de la rata para el procedimiento quirúrgico

1. Colocar la rata en una cámara de inducción y anestesiar la rata con isoflurano vaporizado de 4% y oxígeno al 100% en 0,5 L/min durante aproximadamente 3 minutos, hasta que la rata está totalmente anestesiada.
2. Sacar a la rata de la cámara de inducción y medir su peso corporal.
3. Afeitarse la piel de la región quirúrgica en el abdomen.
4. Coloque la parte trasera de animales en la cámara de isoflurano para un 2 minutos adicionales profundizar la anestesia.
5. Colocar la rata en la mesa de operación en posición supina.
6. Fijar la máscara de la anestesia en la región de la boca de la rata y que el animal anestesiado con un flujo de gas continuo de isoflurano vaporizado el 2% y el 100% de oxígeno a un flujo de 0.5 L/min.
7. Fijar las extremidades con trozos de cinta.
8. Aplique ungüento veterinario en ambos ojos para evitar la sequedad.
9. Administrar buprenorfina 0,05 mg/kg por vía subcutánea, para aliviar el dolor durante el período de operación.
10. Desinfección del campo quirúrgico del abdomen con 3 rondas de tintura de yodo seguido de 2 rondas de alcohol al 70%.
11. Lugar esteriliza gasas alrededor del área donde se realizará la incisión para dejar sólo el campo de la operación del abdomen expuesto.
12. Proceder a realizar la operación cuando está ausente el reflejo del pellizco del dedo del pie retiro de la rata.

2. laparotomía de la rata

1. Hacer una incisión de piel y músculo abdominal transversal usando tijeras y un coagulador eléctrico.
2. Fijar y sacar el proceso del xiphoid hacia la cabeza mediante una sutura de polipropileno 4-0.
   Nota: Preste atención al levantar el proceso del xiphoid verticalmente para exponer mejor el hígado, pero proceda con precaución para evitar la restricción respiratoria severa y la asfixia.
3. Abrir la cavidad peritoneal tirando de ambos lados de las paredes abdominales hacia la cabeza con dos ganchos subcostal para exponer el hígado.
4. Cubrir el duodeno y el intestino en la cavidad abdominal con una gasa humedecida para evitar que se sequen.
5. Levante lóbulos medianos derecho e izquierdos utilizando una gasa humedecida y mantenerlos contra el tórax para exponer mejor el hilio del hígado.
6. Lugar la rata bajo un estereomicroscopio (aumento de X 8).
7. Deje caer alguna solución salina tibia en el abdomen y en la superficie del hígado y los intestinos cada varios minutos, para evitar que se sequen durante todo el procedimiento.

3. establecimiento de un pasaje de derivación dentro de lóbulo Lateral izquierdo

1. Disecar la vena porta izquierda y ligan con una sutura de seda 6-0 en la base (figura 2A).
2. Bloque de la izquierda de la arteria hepática, el conducto biliar izquierdo junto con la vena media izquierda del portal, la arteria hepática media izquierda y la izquierda mediana vía biliar con micro pinzas para evitar un flujo de la solución en el lóbulo medio izquierdo (figura 2B).
3. Separar el lóbulo lateral izquierdo cortando los ligamentos circundantes del lóbulo con micro tijeras.
4. Bloquear la lateral izquierda de la vena hepática por fijación en la base del lóbulo lateral izquierdo con micro pinzas (figura 2).
   Nota: Asegúrese de no apretar la vena porta izquierda así por error.
5. Utilice abrazaderas de mosquito la ligadura de la vena porta izquierda y mantener la vena con la tensión adecuada para la canulación más adelante.
6. Cuidadosamente hacer una incisión en la pared frontal de la vena porta izquierda pinchando con un aguja-vivienda 24-G catéter ( Figura 3A).
   Nota: Para crear un puente, son necesarios puntos de acceso vascular en la izquierda de la vena porta y la vena hepática izquierda. Para este paso, es preferido para crear el acceso vascular por punción de los vasos con una aguja en lugar de hacer una incisión más grande con unas tijeras. Esto reduce el riesgo de sangrado y posterior estenosis.
7. Retirar el catéter y tomar la aguja de la sonda para obtener una sonda de aguja-libre 24-G.
8. Conectar el catéter a un tubo de perfusión, de que el otro extremo se conecta a una jeringa de 20 mL con 15 mL de 40 U/mL heparinizada solución salina en una bomba de perfusión.
9. Encienda la bomba para perfundiendo el tubo para expulsar el aire hacia fuera del tubo y la sonda de aguja-libre.
10. Apague la bomba de perfusión.
11. Una vez más, inserte el catéter sin aguja en la vena porta izquierda a través de la incisión pinchada en la vena (figura 3B).
    Nota: Debido a espacio limitado para la fijación del catéter, no se fija en este punto. Por lo tanto, el cirujano debe usar cuidado para evitar el desplazamiento del catéter canulado.
12. Cuidadosamente hacer otra incisión en el margen de la región expuesta de la vena hepática lateral izquierda pinchando con un catéter de aguja-vivienda de 22 o 24 G (figura 3).
    Nota: Se recomienda que el catéter sea ligeramente más pequeño que la nave.
13. Retirar el catéter y tomar la aguja por el catéter para obtener un catéter sin aguja 22-G.
14. Encienda la bomba de perfusión perfusión salina heparinizada en el lóbulo lateral izquierdo vía 24-G canulado sin aguja catéter de la vena porta izquierda a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min.
15. Utilice una gasa seca para absorber el líquido que hacia fuera-fluye residuos alrededor de la zona de incisión de la vena hepática lateral izquierda.
16. Canule la vena hepática lateral izquierda vía el pinchado de la incisión de la vena con el catéter de aguja 22-G, para generar una toma de fluidos para minimizar la contaminación intraabdominal (figura 3D).
    Nota: Es técnicamente difícil fijar el catéter canulado en el lóbulo hepático. Por lo tanto, el cirujano debe prestar atención a evitar el desplazamiento del catéter. Por otra parte, sin la canulación de la vena hepática izquierda lateral con un catéter, residuos líquidos también pueden ser absorbido en la región de la incisión de la vena con una gasa seca.
17. Mantener perfundiendo el lóbulo lateral izquierdo con solución salina heparinizada para alrededor de 20 minutos (Grupo 1) y luego solamente con solución salina para 2 h, 3 h o 4 h (Grupo 2, grupo 3 y grupo 4, respectivamente).
18. Apague la bomba para detener la perfusión.

4. a fisiológica reperfusión del lóbulo Lateral izquierdo

1. Sacar ambos catéteres de la vena porta izquierda y el lateral izquierdo de la vena hepática.
2. Cerrar la incisión de la vena porta izquierda con una sutura de poliamida 11-0.
3. Cerrar la incisión de la vena hepática izquierda lateral con una sutura de poliamida 11-0 también.
4. Suelte el lateral izquierdo de la vena hepática.
5. Suelte la media izquierda de la vena porta, conducto biliar izquierdo y arteria hepática izquierda.
6. Corte la ligadura de la vena porta izquierda a reabrir la vena.

5. cierre de la pared Abdominal

1. Cerca de la capa muscular de la pared abdominal por la sutura interrumpida con una sutura absorbible Poliglactina 910 de 4-0.
2. Cerrar la capa de la piel de la pared abdominal por la sutura interrumpida con una sutura de polidioxanona absorbible 4-0.
3. Después de cerrar el abdomen, desinfectar la incisión de la piel con alcohol 70%.

6. postoperatorio tratamiento de la rata

1. Coloque el animal en una cubierta térmica de colchón para la reanimación durante unos 10 minutos y luego ponerlo en una jaula nueva.
2. Administrar buprenorfina 0,05 mg/kg por vía subcutánea 2 x día por 3 d consecutivo postoperatoriamente liberar el dolor.

Resultados

Doce hombre (edad 12 - 13 semanas) las ratas de Lewis fueron utilizadas para evaluar el efecto de la perfusión selectiva del lóbulo hepático El experimento se realizó en cuatro grupos (n = 3 ratas por grupo). Con períodos diferentes de la perfusión de 20 minutos, 2 horas, 3 horas y 4 horas, siguiendo los pasos descritos anteriormente, logra con éxito en vivo de la perfusión del lóbulo único.

En Vivo...

Discusión

Bloqueando y canular la vena porta izquierda con un catéter como una entrada de fluido y la vena hepática izquierda lateral con otro catéter como un fluido, con éxito generamos un puente fluido en vivo dentro del lóbulo lateral izquierdo, lo que indica que Aunque la técnica es muy difícil debido al tamaño pequeño de los vasos para la canulación y a un alto riesgo de causar hemorragias, es factible. Incluso las ratas en período de perfusión larga de 4 horas sobrevivieron por lo menos 1 semana, mostrando que las r...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Bomba
Perfusor VI	B. Braun,
Catéter	Terumo	SR+DU2419PX	24G, 0,74 veces; 19mm
Versatus-W  Catéter	Terumo	SR+DU2225PX	22G, 0,9 veces;
Micro instrumento
micro tijeras	F & middot; S· L	Nº 14058-09
micro serrefine	F· S· L	No.18055-05
Aplicador de micro abrazaderas	F· S· L	Nº 18057-14
Micropinzas rectas	F· S· L	Nº 00632-11
Micropinzas curvas	F· S· L	Nº 00649-11
micro portaagujas	F· S· L	Nº 12061-01
			quirúrgicos generales
sisjeras estándar	F· S· L
	& middot; S· Pinza
	F· S· Pinza
	F· S· L
portaagujas	F· S· Sutura
4-0 prolene	ethicon
4-0 ETHICON*II	ethicon 6-0 ethicon
		de seda
11-0	ethicon

de perfusión catéter Melsungen Versatus-W quirúrgico de 25 mm instrumentos pinza para mosquitos F dentada L dentada L L de poliamida