Hemos desarrollado un sistema sencillo y versátil para las garrapatas duras se alimentan de conejos de laboratorio. Nuestro protocolo no laborioso utiliza materiales fácilmente accesibles y se puede ajustar según los requerimientos de las diferentes configuraciones experimentales. El método permite cómodo monitoreo o muestreo de garrapatas durante todo el período de alimentación.
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Artículo de método
Un modelo versátil de la infestación de la señal dura en conejos de laboratorio
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Resumen
Resumen
El uso de animales vivos en la investigación de la garrapata es crucial para una variedad de propósitos experimentales incluyendo el mantenimiento de colonias de señal dura en el laboratorio. En garrapatas, todas las etapas del desarrollo (excepto el huevo) son hematófagos, y adquirir una comida de sangre cuando sus hospederos vertebrados es esencial para la realización de su ciclo de vida. Aquí se demuestra un método simple que utiliza cápsulas de fácilmente se puede abrir para la alimentación de garrapatas duras en conejos. Las ventajas del método propuesto incluyen su simplicidad, corta duración y lo más importante es versátil ajuste a las necesidades de los requisitos específicos de experimentales. El método hace posible el uso de múltiples cámaras (varios tamaños) en el mismo animal, que permite la alimentación de múltiples etapas o diferentes grupos experimentales reduciendo el requisito general de animales. Los materiales no-irritante y de fácil acceso minimiza las molestias a los animales, que pueden ser fácilmente recuperados de un experimento y ofrecidos para adopción o reutilizarse si lo permite el protocolo ético.
Introducción
Las garrapatas duras (Ixodidae) son conocidas como artrópodos alimentación lento y pueden ser atadas en un host durante varios días, o semanas, dependiendo de la especie y del desarrollo de la etapa1. Estos artrópodos hematófagos obligatorios son vectores de una gran variedad de agentes infecciosos, como bacterias, protozoos y virus y así presentan un riesgo significativo para los seres humanos y de salud animal1. Cuando estudiar biología de la garrapata o evaluación de nuevos métodos de control, el establecimiento de una marca eficaz sistema de alimentación es crucial para los experimentos de diseño efectivamente y lograr los propósitos del estudio. Recientemente, varios sistemas de alimentación artificial de la garrapata (evitando el uso de animales vivos) han desarrollado2,3,4 y deben usarse siempre que sea posible. Sin embargo, estos sistemas no han sido capaces de sustituir completamente la garrapata alimentándose de animales vivos, y no son sustitutos adecuados para muchas condiciones fisiológicas necesarias para estudios científicos. Por lo tanto, en algunos casos, el uso de los ejércitos de animales experimentales es fundamental para garantizar la pertinencia de los resultados experimentales.
Conejos Nueva Zelanda de laboratorio han demostrado ser la sede más conveniente y accesible para varios ixodid garrapatas especies5,6,7,8,9. Dos estrategias comunes de garrapatas que se alimentan de conejos se han utilizado con frecuencia: a) alimentación en orejas de conejo cubiertos con algodón paño o calcetines6,7y b) de alimentación en algodón bolsas9, nylon botellas10 o neopreno cámaras11 pegado a la parte posterior del conejo. La alimentación en las orejas del conejo no es un sistema elegante, porque las garrapatas (especialmente primeras etapas, las larvas o ninfas) pueden arrastrarse y coloque en el canal auditivo, que es incómodo para el animal y hace el seguimiento de la señal de alimentación o la recuperación de engorged garrapatas difícil. Este sistema también está limitado a sólo dos grupos de garrapata en oídos completamente cubiertos por calcetines protegidos por collares Elizabethan, que representa un malestar significativo para el animal. Otros sistemas9,10,11 son definitivamente más avanzado y muy adecuado para el mantenimiento de la colonia de garrapatas duras. Sin embargo, están limitados en el número de grupos experimentales al conejo, así como en las tamaños/formas modificables de las cámaras de alimentación. Además, estos protocolos requieren a menudo cojeando de las patas de conejo posterior para evitar el rascado y el uso de collares isabelinos para prevenir el grooming.
Aquí proponemos un método simple, no laborioso y muy eficaz para alimentar a varios grupos de garrapatas duras en cámaras cerradas pegados al conejo nuevamente cubierto por una chaqueta, eliminando la necesidad de collares isabelinos o cojeando durante el experimento. Específicamente, nuestro sistema utiliza cápsulas elásticas de una hoja de espuma Etileno vinilo acetato (EVA) cubierto por malla de mosquito y pegado al conejo depilado con pegamento látex no irritante solidificación rápida (3 minutos). Esta técnica permite múltiples cápsulas del tamaño deseado o el forma y pocas semanas después el experimento de los conejos se recuperan completamente. El sistema es adecuado principalmente para las etapas nymphal y adulto marca duro, pero con una pequeña modificación puede ser utilizado para las larvas que se alimenta tan bien. Los métodos basados en espuma de EVA para señal dura la alimentación pueden adaptarse a otros tipos de huéspedes vertebrados, por ejemplo ovejas (que se muestran como una de las alternativas en este papel).
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Protocolo
Nota: En este estudio, los conejos se mantuvieron en jaulas estándar con alimentos y agua ofreció ad libitum en la agencia francesa para la alimentación, medio ambiente y salud ocupacional y seguridad (ANSES) acreditados instalaciones en Maisons-Alfort, Francia. Animales fueron monitoreados dos veces al día por dos técnicos experimentados por reacciones anormales de la piel, problemas de salud o las complicaciones. La sala experimental fue asegurada por la estructura del interior de la puerta con cinta de doble cara para evitar el escape accidental de las garrapatas. El método funciona mejor si dos personas trabajan en equipo, pero es posible hacer solo sin ayuda por una persona experimentada. Aunque la mayoría los conejos son dóciles y tranquilas, signos de tensión pueden ocurrir durante la manipulación. Para asegurar que un conejo no herir a sí mismo por luchar, moderación manual puede lograrse manteniendo suavemente de scruff del cuello con una mano mientras la otra mano soporta cuartos traseros. Los seis meses de edad, Rambouillet ovejas hembra se mantuvieron en el centro de servicios de investigación biomédica (CRBM) en la Escuela Nacional Veterinaria de Alfort (envie), donde agua y alimentos fueron suministrados ad libitum, y se comprobó dos veces al día.
Nota: Nuestro laboratorio ha recibido permiso para usar conejos y ovejas para la señal de alimentación por el Comité de ética Animal experimentos viene Anses/envie/UPEC, permiso número 01741.01 y 11/10/16-5B, respectivamente. Puesto que utilizamos las garrapatas sólo libre de patógeno en nuestros experimentos, todos los conejos utilizados en este estudio fueron ofrecidos para su adopción a través de la Asociación de conejo blanco, París, Francia.
1. preparación de las cápsulas
- Cortar el tamaño deseado de la cápsula de la hoja de la espuma de EVA (figura 1A). Ronda exterior esquinas (figura 1B) de la cápsula para minimizar el desprendimiento accidental cuando pegado a la piel de conejo.
Nota: El grueso del marco de la cápsula debe ser aproximadamente 8 mm. uso una hoja de espuma gruesa de 5 milímetros para las larvas, ninfas y adultos especies pequeñas garrapatas Ixodes. Una hoja de espuma de 1 cm de espesor es adecuada para garrapatas adultas como Amblyomma SP., Hyalomma SP., etc. que el tamaño de la cápsula varía según los requerimientos experimentales de gran tamaño. Por ejemplo, para 20 parejas de adultos de Ixodes , 200 ninfas o 1.000 larvas, utilizamos un tamaño interior de la cápsula de 5 x 5 cm2, 6 x 7 cm2 o 7 x 9 cm2, respectivamente. - Cortar tiras de 8 mm de ancho de gancho auto-adhesivo de cinta (véase Tabla de materiales) y péguelos en el bastidor de espuma EVA preparado (figura 1C).
- Corte las tiras del tamaño mismo de lazo auto-adhesivo (véase Tabla de materiales) de la cinta y atan a los lados del gancho se une a la estructura de la espuma de EVA (figura 1D).
- Corta el tamaño apropiado de la malla de mosquito fina (malla de menos de 50 μm) con el tamaño de la estructura de espuma EVA y pegarla al lazo auto-adhesivo (Figura 1E y 1F). Si fuese necesario, corte los salientes.
Nota: Este tipo de cápsula se puede utilizar para alimentar a las ninfas y adultos de la especie de garrapata dura, mientras otro sistema de sellado de las cápsulas es necesario para la alimentación de larvas (figura 1 complementaria) para prevenir el escape accidental de las larvas mediante el sujetado gancho y lazo lateral.
2. preparación del conejo antes de infestación de la señal
- Afeite la zona de la espalda de conejo y los lados para ser utilizado con máquinas de cortar (figura 2A).
- Aplique pegamento de látex no irritante en toda la superficie de la cápsula preparada y esperar 1 minuto (figura 2B).
- Pegue la cápsula presionando sobre la piel (especialmente en las esquinas) con los dedos durante unos 3 minutos (figura 2 y 2D).
Nota: Al pegar más de una cápsula, asegúrese de mantener al menos 5 mm espacio entre ellas (Figura 2E y 2F). Generalmente evitamos la región de la columna vertebral, pero puede utilizarse si es necesario. - Levantar ligeramente las cápsulas para comprobar visualmente su adhesión a la piel. Si las regiones no inscritos se encuentran, aplique el pegamento con una espátula y presione durante otros 3 minutos.
- Aplique cinta protectora en las patas traseras del conejo para evitar daños de la chaqueta (figura 2G).
Nota: Este paso es opcional y es principalmente para prevenir el daño de la chaqueta, no dañar a la cápsula de la garrapata. - Poner en la chaqueta de conejo colocando las patas delanteras a través de las aberturas y apretar el cuello, hacer conejo su respiración sigue siendo cómoda. No coloque las patas traseras a través de los cerramientos elástico en este paso y dejar la cremallera abierta (figura 2H).
3. infestación de la señal
- Colocar las señales en una jeringa de plástico (1 ó 5 mL dependiendo del número de los individuos) con el extremo de la aguja cortada y tapada con algodón (figura 1G). Si una pequeña cantidad de garrapatas infestadas, use pinzas.
Nota: Para mantenimiento de Colonia garrapata permite la garrapata congestionan female(s) a poner huevos con incubación posterior dentro de la jeringa (5 o 10 mL) cubierta por la malla de mosquito envuelta por una banda de goma12 para evitar la manipulación laboriosa de las larvas en el momento son aplicado al host (figura 1H). También, completamente congestionan las larvas pueden permitir mudar en la jeringa (suplementario figura 1I; 5 o 10 mL) para la infestación directa del conejo con ninfas. - Coloque la jeringa en la cápsula a través de la apertura del ángulo e inocular las garrapatas empujando el émbolo de la jeringa. Gire lentamente el émbolo hacia la piel de conejo para quitar las garrapatas restantes Unidas al émbolo y al mismo tiempo tirar hacia fuera de la cápsula (figura 2).
Nota: Si algunas de las personas arrastran fuera de la cápsula, devolverlos con unas pinzas. - Ligando la cinta de gancho y lazo para cerrar la cápsula.
- Coloque las patas traseras del conejo en la parte posterior elásticas recintos de la chaqueta y zip cerrados.
Nota: Asegúrese de que un índice puede encajar en el cuello de la chaqueta y el conejo para asegurar comodidad y también para evitar la masticación en la chaqueta. - Devuelva el conejo en la jaula (figura 2J).
Nota: El tiempo de la infestación a colección de garrapatas repletas varían entre especies de garrapatas diferentes y las etapas de desarrollo. Por ejemplo, scapularis de Ixodes ricinus de Ixodesy la duración de la alimentación de adultos, ninfas y larvas es 6-9, 3, 4 y 2-3 días, respectivamente. Una lista de referencias para 29 señal dura diferentes ciclos de vida en condiciones de laboratorio se puede encontrar en Levin y Shumacher (2016)9.
4. recolección y control de garrapatas
- Tomar el conejo de la jaula a la banca y abra la chaqueta.
- Frenar suavemente el conejo con las manos. Abrir la cápsula soltando la cinta de gancho y lazo (figura 2 K y 2 L) y recoger las garrapatas por cepillado la congestionan las larvas (figura 1 complementaria) o ninfas a un plato de plástico o con unas pinzas para los adultos (figura 2L ). Si parcialmente alimentado (no lleno), las garrapatas están necesarias, utilice un twister de garrapata o fórceps para separarlos.
Nota: Si mantiene las colonias de garrapatas por favor ver la nota en el paso 3.1. Mantener la garrapatas engorged en apropiado húmedas y la temperatura según la especie de garrapata particular. - Si es necesario, vuelva a conectar la cinta de gancho y lazo para cerrar la cápsula.
5. recuperación del conejo
- Retire completamente la malla de mosquito de la cápsula y dejar la chaqueta en el conejo (figura 2M).
- Esperar 3-4 semanas y tratar de quitar la cápsula con cuidado cortar una de las esquinas (figura 2N). Si la cápsula está firmemente conectada, repita este paso una semana más tarde.
- Quite la chaqueta y dejar que recupera el conejo en la jaula.
Nota: Una vez que la cápsula está apagado, revise la piel del conejo para las reacciones anormales. Aunque normalmente no se requiere tratamiento, se puede utilizar una loción emoliente en caso de irritación. - Si permiten el protocolo y los experimentos, el conejo recuperado (figura 2O) puede reutilizar u ofrecido para su adopción.
Nota: Los conejos han demostrado que adquieren resistencia de la garrapata una vez expuesta a infestaciones de garrapatas repetido13; por lo tanto, reinfestations no se recomiendan a menos que el experimento requiere.
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Resultados
Aquí proponemos por primera vez un método detallado paso a paso de la señal dura alimentación en espuma EVA cápsulas aplicados a la parte trasera de un conejo depilado, cubierto por una chaqueta (figura 1 y figura 2). Este protocolo es adecuado para varios tipos de experimentos cuando grupos diferentes de garrapatas en el mismo host son necesarios y también pueden utilizarse para la cría masiva de garrapatas dura...
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Discusión
El paso más importante en este conjunto del protocolo es pegar la cápsula firmemente a la piel afeitada. Por esta razón, una presión constante durante al menos 3 minutos es fundamental, especialmente en las esquinas. Al inocular las garrapatas en la cápsula, es importante aplicar profundamente en la esquina opuesta a la abierta para evitar escape de garrapatas durante el sellado. Al planificar los experimentos, asegúrese de que todas las cápsulas están cubiertas por la chaqueta para evitar daño por masticación o arañazos...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos la asistencia técnica de Evelyne Le Naour, Instituto Nacional de investigaciones agrícolas (INIA), Alain Bernier (INRA) y Océane Le Bidel (ANSES). consuelo Almazán fue apoyado por una beca del laboratorio de excelencia, integradora biología de las enfermedades infecciosas emergentes (LabEx IBEID), Instituto Pasteur. Los conejos y las ovejas fueron compradas por ANSES. Parte de este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de la subvención de salud RO1AI090062 y parque. El Dr. Jeffrey L. Blair es reconocido por revisar el manuscrito.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Conejos de Nueva Zelanda (2,5-3,5 kg) | Charles River | Código de cepa 571 | |
| Ovejas Rambouillet | Proveedor local-granja libre de garrapatas | Hembra 6 meses de edad | |
| Espuma EVA de 5 mm de espesor | Tienda de cosplay | EVA-PE451kg (950 mm x 450 mm) | 10 mm PE45 kg de espuma de la tienda de cosplay se puede usar para las especies de garrapatas adultas grandes |
| Hoja de espuma 9 "X 12" 6 mm-Blanco | Amazon | FOAMSHT6-20 | 6 mm-Espuma EVA se puede pedir a través de Amazon como alternativa a la espuma de Cosplay Shop |
| Chaquetas de conejo de longitud completa | Aparato de Harvard, Inc. | 620077 - mediano, 6270078 - grande | |
| Pegamento de látex no tóxico | Reparador de lágrimas | Tela & Adhesivo | |
| Jersey ortopédico tubular de algodón | BSN Medical | 9076 (12-15 cm de ancho) | |
| Malla antimosquitos | Loisirs Creatifs | Tejido de malla de nailon con filtro muy fino | Cualquier material de malla para mosquitos o cortinas con un tamaño de malla inferior a 50 μ m es adecuado. |
| Leucoplasto | BSN medical S.A.S | LF 72361-02 | |
| Cinta adhesiva de velcro | AIEX store AIEX | 39.37 pies/12m Rollo de cinta autoadhesiva de gancho y bucle, 20 mm de ancho, color blanco | Fullfiled by Amazon |
| Pegamento de secado rápido | Fixtout | Superpegamento |
Referencias
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- Kröber, T., Guerin, P. M. In vitro feeding assays for hard ticks. Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).
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