यह प्रोटोकॉल एक अर्द्ध स्वचालित दृष्टिकोण का वर्णन एक ९६ अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से hepatocyte की तरह कोशिकाओं का उत्पादन । इस प्रक्रिया को तेजी से और लागत प्रभावी, बुनियादी और लागू मानव अनुसंधान के लिए hepatocyte की तरह कोशिकाओं के गुणवत्ता आश्वासन बैचों के उत्पादन की अनुमति है ।
मानव pluripotent स्टेम सेल मानव ऊतक के एक अक्षय स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । हमारे अनुसंधान मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं (iPSCs) से मानव जिगर ऊतक पैदा करने पर ध्यान केंद्रित है । वर्तमान भेदभाव प्रक्रियाओं भ्रूण और वयस्क लक्षण का एक मिश्रण प्रदर्शित मानव hepatocyte की तरह कोशिकाओं (HLCs) उत्पन्न करते हैं । सेल phenotype में सुधार करने के लिए, हम पूरी तरह से हमारे भेदभाव की प्रक्रिया और सेल आला परिभाषित किया है, कोशिका आबादी जो बेहतर जीन अभिव्यक्ति और समारोह में प्रदर्शित की पीढ़ी में जिसके परिणामस्वरूप । हालांकि इन अध्ययनों की प्रगति के निशान, स्क्रीनिंग के लिए बहु अच्छी तरह से प्लेटों की बड़ी मात्रा में उत्पन्न करने की क्षमता श्रम गहन प्रक्रियाओं और बैच भिन्नता के लिए बैच द्वारा सीमित किया गया है. इस समस्या से निपटने के लिए, हमने pluripotent स्टेम सेल को HLCs में अंतरित करने के लिए एक अर्द्ध-स्वचालित प्लेटफ़ॉर्म विकसित किया है । स्टेम सेल बोने और भेदभाव तरल हैंडलिंग और ९६ में स्वत: pipetting सिस्टम-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । भेदभाव के बाद, सेल phenotype स्वचालित माइक्रोस्कोपी और एक बहु अच्छी तरह से luminometer का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था ।
प्राथमिक मानव हेपैटोसाइट्स (PHHs) जिगर जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए वर्तमान मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं । अपने फायदे के बावजूद, PHHs अस्थिर phenotype1के साथ परिपक्व हेपैटोसाइट्स के एक सीमित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं । मानव भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) और मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSC) जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली संसाधन के रूप में प्रस्तावित किया गया है, मानव ऊतक के एक अक्षय स्रोत का वादा, जिगर सहित2,3,4 . वर्तमान hepatocyte भेदभाव प्रक्रियाओं कोशिकाओं है कि एक्सप्रेस hepatocyte मार्करों, जीन और PHHs3,4,5,6,7के समान कार्य उत्पंन 8,9,10,11. हाल ही में, इस तरह के रिकॉमबिनेंट laminins के रूप में परिभाषित सामग्री और मैट्रिक्स का उपयोग, सेल phenotype और प्रयोगात्मक reproducibility5,12,13,14में सुधार हुआ है ।
पारंपरिक सेल संस्कृति तकनीक मैनुअल pipetting, जो दोनों समय लेने और त्रुटि प्रवण है पर काफी भरोसा करते हैं । इस परख के प्रवाह और प्लेट प्रारूप एक के साथ काम कर सकते है सीमा । तारीख करने के लिए, सबसे HLCs की पीढ़ी का वर्णन अध्ययन प्रकृति में गहन श्रम कर रहे है और इसलिए आकार में छोटे पैमाने15,16,17।
तरल हैंडलिंग और pipetting प्रणालियों में वर्तमान अग्रिमों, स्वचालित माइक्रोस्कोपी और प्रयोगशाला विश्लेषक के साथ संयोजन में, यह संभव प्रक्रियाओं जो मानव हस्तक्षेप के लिए आवश्यकता को कम करने के विकास के लिए बनाया है । हम इन प्रौद्योगिकियों का लाभ ले लिया है और एक अर्द्ध स्वचालित भेदभाव प्रणाली है जिसके साथ बुनियादी और लागू जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए मानव जिगर ऊतक की बड़ी मात्रा में उत्पंन करने के लिए विकसित की है । इस दृष्टिकोण दोनों मानव ESC और iPSC लाइनों के साथ छोटे समायोजन आवश्यक, सेल लाइन के आधार पर किया जा सकता है । उच्च सामग्री विश्लेषण के साथ इस प्रणाली के संयोजन, हम प्रदर्शित करते है कि एचएलसी phenotyping कम समय लगता है और पैमाने पर प्रदर्शन18,19,20,21हो सकता है ।
संक्षेप में, सेल संस्कृति तकनीकों के स्वचालन यहां वर्णित विश्वसनीयता में सुधार के लिए नेतृत्व किया गया है, प्रयोगात्मक समय प्रबंधन और परख प्रवाह ।
हमारे अर्द्ध स्वचालित प्रक्रिया कुशल, विश्वसनीय और किफायती है, पैमाने पर HLCs के उत्पादन की अनुमति (चित्रा 1) । प्लेट में कुएँ के बीच की कोशिकाओं की संख्या के मामले में कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं था, जिससे यह मंच कोशिका आधारित स्क्रीनिंग (चित्रा २) के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण अपनाता है. इसके अलावा, अर्द्ध स्वचालन कार्यप्रवाह उपयोगकर्ता एक बार में बड़ी संख्या में प्लेटों का उत्पादन करने के लिए सक्षम बनाता है, जो मैन्युअल प्रक्रियाओं का उपयोग करने से पहले संभव नहीं था5,12.
महत्वपूर्ण बात, स्वचालन प्रक्रिया भेदभाव पैदावार पर असर नहीं किया, HNF4α (89.2% ± 2) और ALB (92.8% ± 6) (चित्रा 3) व्यक्त कोशिकाओं के बहुमत के साथ । HLCs भी सिप P450 एंजाइमों CYP2D6 और CYP3A4 व्यक्त की और CYP1A2 और CYP3A चयापचय गतिविधि पिछले रिपोर्ट प्रयोगों के तुलनीय (चित्रा 3)5. प्रोटोकॉल के मानकीकरण के बावजूद, कोशिका प्रवाह विभेद से पहले शुद्ध एचएलसी भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है । इसलिए, अच्छी तरह से भर में एक अच्छा सेल वितरण सुनिश्चित करने के एक महत्वपूर्ण विचार है (चित्रा 1) । यह सेल लाइन पर निर्भर साबित हो गया है, इसलिए सेल सीडिंग और घनत्व अनुकूलन प्रत्येक सेल लाइन के लिए आवश्यक है स्केल अप करने से पहले ।
अपने वर्तमान रूप में, इस मंच नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए HLCs की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए उपयुक्त नहीं है, और यह सबसे अधिक संभावना सेल कारखानों और प्रतिक्रिया के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया जाएगा । हालांकि, विकसित पद्धति रोग मॉडलिंग, दवा स्क्रीनिंग और/या दवा repurposing अध्ययन के लिए मानव जिगर कोशिकाओं की तेजी से पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं । इसके अलावा, परख मल्टीप्लेक्सिंग के लिए उत्तरदाई है, यंत्रवत विश्लेषण के लिए multiparametric डेटासेट की पीढ़ी की अनुमति । आगे जा रहे हैं, हम यह भी विश्वास है कि इस तकनीक को इन विट्रो प्रणालियों में और अधिक जटिल 3 डी भेदभाव के रूप में या एक मंच के रूप में एचएलसी phenotype में सुधार करने के लिए लागू किया जा सकता इन विट्रो।
अंत में, हम मानते है कि हमारे सरल और अर्द्ध स्वचालित प्रणाली प्रयोगात्मक प्रवाह में वृद्धि, और प्रयोगात्मक भिंनता को कम करने, जिससे जैविक डेटासेट की गुणवत्ता में सुधार होगा और मानव शरीर क्रिया विज्ञान की ओर उनके एक्सट्रपलेशन ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम मुख्य वैज्ञानिक के कार्यालय (टीसीएस/16/37) और एक MRC पीएचडी छात्रवृत्ति से पुरस्कारों के साथ समर्थन किया गया था ।
405 LS Washer | Biotek | ||
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
GripTips for VIAFLO 96 | Integra | 6434 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
MultidropCombi Reagent Dispenser | ThermoFisher | 5840300 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
Operetta High-Content Imaging System | PerkinElmer | HH12000000 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Standard tube dispensing cassette | ThermoFisher | 24072670 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette | Integra | 6001 | |
PBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1.00496 EMD MILLIPORE | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:200 (mouse) |
Alpha-fetoprotein | Abcam | ab3980 | 1:500 (mouse) |
CYP2D6 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:400 (rabbit) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
IgG | DAKO | 1:400 | |
Anti-Mouse 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11001 | 1:400 |
Anti-sheep 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11015 | 1:400 |
Anti-rabbit 488 (secondary antibody) | Life technologies | A-11008 | 1:400 |