Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido

Resumen

Ribonucleótidos están entre los nucleótidos no canónico más abundantes incorporados en el genoma durante la replicación del ADN nuclear eucariótica. Si no quitado, ribonucleótidos pueden causar mutagénesis y daño de la DNA. Presentamos dos enfoques experimentales que se utilizan para evaluar la abundancia de incorporación ribonucleótido en ADN y sus efectos mutagénicos.

Resumen

La presencia de ribonucleótidos en el ADN nuclear ha demostrado ser una fuente de inestabilidad genómica. El grado de incorporación de ribonucleótido puede evaluarse por hidrólisis alcalina y electrophoresis del gel del RNA es muy susceptible a hidrólisis en condiciones alcalinas. Esto, en combinación con el análisis de Southern blot puede utilizarse para determinar la ubicación y el filamento en la que se han incorporado los ribonucleótidos. Sin embargo, este procedimiento es solamente semicuantitativa y puede no ser lo suficientemente sensible para detectar pequeños cambios en el contenido de ribonucleótido, aunque específicos de filamento Southern blot sondeo mejora la sensibilidad. Como una medida de una de las más sorprendentes consecuencias biológicas de ribonucleótidos en el ADN, mutagénesis espontánea pueden ser analizada utilizando un ensayo de mutación adelante. Mediante genes reporteros apropiados, mutaciones raras que resulta en la pérdida de función pueden ser seleccionada y en general y las tasas de mutación específica pueden medirse mediante la combinación de datos de experimentos de fluctuación con secuencia de la DNA del gene del reportero. El ensayo de fluctuación es aplicable para examinar una gran variedad de procesos mutagénicos en fondo genético específico o condiciones de crecimiento.

Introducción

Durante la replicación del ADN nuclear eucariótica, ribonucleótidos se incorporan en el genoma por todos tres principales replicases de ADN, ADN polimerasas (Pols) α, ε y δ^1,2. Reparación de la supresión de Rnasa dependiente de H2 ribonucleótido (RER³) elimina la mayoría de estos ribonucleótidos incrustados.

Un ribonucleótido en el ADN es susceptible a la hidrólisis, como el grupo hidroxilo 2' de la molécula de azúcar puede atacar el enlace fosfodiéster adyacente, liberando un extremo con un 2' - 3' fosfato cíclico y el otro con un 5'-OH⁴

Protocolo

1. alcalina hidrólisis y filamento específico Southern Blot (figura 1)

1. Crecimiento y aislamiento de ADN genómico de la célula
   1. Aislar el ADN genómico de levadura usando una kit de purificación de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante de la levadura. Uso de las culturas que se encuentran en la fase exponencial de crecimiento entre (densidad óptica de 0.5) y 1. Resuspender el precipitado de ADN final en 35 mL de 1 x de tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM ácido de etilendiaminotetracético (EDTA)).
   2. Añadir 1 mL de 5 mg/mL Rnasa A para el ADN e incubar 30 min a 37 ° C.
   3. Precipitar el ADN con 0,....

Resultados

Tratamiento de la DNA genomic con álcalis seguido de electroforesis alcalina permite la detección semicuantitativa de la fragmentación del DNA debido a la abundancia de ribonucleótidos estable incorporados. La figura 2 muestra las imágenes de gel de la DNA de genomic tratada con o sin KOH⁵de levadura. La variante M644L de Pol2, la subunidad catalítica de la Polε, ha reducido la capacidad de incorporación de ribonucleótidos mientras que.......

Discusión

Aquí, describimos a los protocolos de dos series de experimentos que se utilizan con frecuencia para analizar cuantitativamente los ribonucleótidos incorporados durante la replicación del ADN y los efectos mutagénicos de ribonucleótidos rupturas. Aunque estos enfoques involucran el eukaryote modelo S. cerevisiae, estas técnicas se pueden adaptar fácilmente a otros microbios y eucariotas superiores incluso.

Sondeo de ribonucleótidos rupturas en el ADN mediante electroforesis en agarosa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
		YPD	20 g de dextrosa, 20 g de peptona, 10 g de extracto de levadura, en H2O desionizado hasta 1 L, añadir 20 g de agar Bacto para medios sólidos, autoclave.
Placas COM 1,3 g de			mezcla de gotas SC, 1,7 g de levadura base nitrogenada sin aminoácidos o (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrosa, 20 g de Bacto agar H2O desionizado hasta 1 L. Ajustar el pH a 5,8. Autoclave y 30 – 35 ml por plato.
Placas CAN 1,3 g de			polvo de caída SC-Ura, 1,7 g de levadura a base de nitrógeno sin aminoácidos ni (NH4)2SO4, 5 g (NH4)2SO4, 20 g de dextrosa, 20 g de agar Bacto, 25 mg de uracilo y H2O hasta 1 L. Autoclave durante 15 minutos a 121 °C; C y enfríe a 56 °C. Agregue 6 mL de solución de sulfato de canavanina al 1% esterilizada por filtro.
Placas 5-FOA			polvo de gota SC-Ura, 1,7 g de levadura base de nitrógeno sin aminoácidos ni (NH4)2SO4, 5 g de (NH4)2SO4, 20 g de dextrosa, 20 g de agar Bacto, 25 mg de uracilo y H2O hasta 800 mL. Autoclave durante 15 minutos a 121 ° C y enfríe hasta 60 °C. Agregue 200 mL de solución de 5-FOA al 0,5% esterilizada por filtro.
L-Canavanine sulfato	US Biological	C1050
5-FOA	US Biological	F5050
20 mL tubo			de vidrio Cualquier marca
Rotador de cultivo en 30 & grados; C incubadora			puede utilizar la incubadora Shaker en su lugar
Placas inferiores redondas de 96 pocillos			Estéril, de cualquier marca
Perlas de vidrio de 3 mm	Autoclave Fisher Scientific	11-312A	antes de usar
Pipetas			Cualquier marca
Ex Taq ADN Polimerasa	TaKaRa	RR001
Epicentre MasterPure ADN de levadura Kit de purificación	Epicenter	MPY80200
3 M acetato de sodio	Sigma-Aldrich	S7899
100% etanol
Qubit 2.0 Fluorímetro	Invitrogen	Q32866	modelo disponible
dsDNA BR Kit de ensayo	Invitrogen	Q32850
KOH	Sigma-Aldrich	221473
EDTA	Sigma-Aldrich	E7889
Ficoll 400	Dot Scientific Inc.
Bromocresol verde	Eastman	6356
Xileno cianol FF	International Technologies Inc.	72120
NaOH	Sigma-Aldrich	S8045
1 M Tris-HCl (pH 8.0)	Teknova	T5080
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain	Invitrogen	S11494
Transiluminador
Amersham Membrana de nylon Hybond-N+	GE Healthcare	RPN303B
3 MM CHR Papel de cromotografía	Whatman	3030-392
NaCl	Caledon	7560-1
Stratalinker 1800	Stratagene
QIAquick PCR Kit de purificación	Qiagen	28106
G-25 columna de centrifugación	GE Healthcare	27-5325-01
1 M Tampón de fosfato de sodio (pH 7,2)	Sigma-Aldrich	NaH2PO4 (S9638); Na2HPO4 (S9390)
SDS	Sigma-Aldrich	L4522
BSA	Sigma-Aldrich	A3059
Formamida	Sigma-Aldrich	47671
Contador

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