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El uso de esplenocitos de ratón para evaluar la influencia de patrón Molecular asociado a patógenos en la expresión de genes reloj

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DOI:

10.3791/58022

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24 de julio de 2018

1Department of Biology, University of Hartford

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe una técnica usando esplenocitos de ratón para descubrir patrones moleculares asociados a patógenos que alteran la expresión de genes reloj molecular.

Resumen

De comportamiento de la expresión génica, los ritmos circadianos regulan casi todos los aspectos de la fisiología. Aquí, presentamos una metodología para desafiar esplenocitos de ratón con lipopolisacárido (LPS) de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), ODN1826 y muertos de calor Listeria monocytogenes y analizar su efecto en el molecular circadiana reloj. Previamente, estudios se han centrado en examinar la influencia de LPS en el reloj molecular usando una variedad de métodos in vivo y ex vivo de una gran variedad de modelos (por ejemplo, ratón, rata y humano). Este protocolo describe el aislamiento y el desafío de esplenocitos, así como la metodología para evaluar reloj gene expresión posterior al desafío mediante PCR cuantitativa. Este enfoque puede utilizarse para evaluar no sólo la influencia de componentes microbianos en el reloj molecular pero también otras moléculas que puede alterar la expresión del reloj. Este enfoque podría utilizarse para embromar aparte el mecanismo molecular de cómo interacción de PAMP-Toll-like receptor influye en la expresión de reloj.

Introducción

El reloj principal en los mamíferos, que organiza las oscilaciones de 24 h para casi todos los aspectos de la fisiología y comportamiento, se encuentra en el núcleo supraquiasmático (SCN) del hipotálamo1,2. Además de regular los procesos biológicos a nivel organismal, el reloj principal también sincroniza los relojes celulares periféricas en todo el cuerpo3,4,5. Mientras que la maquinaria del reloj molecular consiste en por lo menos tres que se enclavija retroalimentación transcripcional traslacional, el núcleo está compuesto por el período (Per1-3), Cryptochrome (Cry1-2), Bmal1, y reloj genes6,7. Además de mantener la sincronización exacta del reloj molecular del núcleo, algunos productos del gene de reloj auxiliares (p. ej., Rev-erbα y Dbp) también regulan la expresión de genes reloj no, es decir, reloj controlado genes (CCGs)6 , 7.

Relojes moleculares funcionales se han descrito en varios tejidos inmunes (p. ej., bazo y ganglios linfáticos)8 y las células (célulasp. ej., B, células dendríticas, macrófagos)8,9. Estas células detectan y responden a patrones moleculares a asociado a patógenos (PAMPs), componentes microbianos conservados, mediante receptores de reconocimiento inmune innato como Toll-like receptores (TLRs)10. Hasta la fecha, se han descrito 13 TLR funcional, que reconocen componentes microbianos como componentes de la pared celular bacteriana, proteína flagelar y los ácidos nucleicos microbianos10. PAMP, lipopolisacárido (LPS), un componente de la pared celular de bacterias Gram-negativas reconocidas por TLR4, se ha demostrado para alterar los ritmos circadianos a nivel organismal y molecular. Por ejemplo, reto en vivo de LPS indujo retrasos de fase luminosa como medida por actividad en ratones11 y condujo a la expresión de gene de reloj reducida en el SCN y el hígado por hibridación en situ y PCR cuantitativa, respectivamente, en las ratas12. Después de un en vivo con LPS, análisis de sangre periférica leucocitos13 y14 de tejido adiposo subcutáneo reveló alterada expresión de varios genes de reloj medido mediante qPCR. Por último, ex vivo desafíos LPS de macrófagos humanos y macrófagos peritoneales de ratón, también alteración reloj expresión medida por qPCR14.

Aquí, describimos un protocolo para evaluar la influencia de los PAMPs LPS, ODN1826 (oligonucleótidos sintéticos que contienen unmethylated CpG motivos) y muerto de calor Listeria monocytogenes (HKLM), reconocido por TLR4 y TLR9 TLR2, respectivamente, en expresión del gene de reloj molecular en esplenocitos de ratón. El protocolo incluye esplenectomía de ratón, splenocyte aislamiento y desafío, RNA extracción, síntesis de cDNA y qPCR para evaluar la expresión de varios genes de reloj. Este protocolo permite la adquisición oportuna de un gran número de células inmunes con muy poco animal o manipulación celular, que puede entonces ser cuestionada ex vivo con pmap varios. El reloj molecular se ha demostrado que modulan los distintos aspectos de la respuesta inmune8,15,16, por lo tanto, la interrupción del reloj molecular probablemente afectaría la correcta variación dependiente del tiempo de la respuesta inmune. Además, desde alteraciones de los ritmos circadianos pueden conducir a patologías graves17,18,19,20, puede ser de interés para los investigadores a cuestionar esplenocitos con una amplia gama de moléculas y valorar su influencia en el reloj.

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Protocolo

Durante el estudio, tratamiento y cuidado de los animales el cumplimiento de la política de los institutos nacionales de salud, estaban de acuerdo con las directrices y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal institucional Animal de la Universidad de Hartford.

1. arrastre de animales

Nota: Se utilizan ratones J B6129SF2 machos de veinte semanas de edad en el estudio.

  1. Arrastrar a ratones a una 12 h de luz (luz estándar blanca arriba) / 12 h oscuro ciclo durante 2 semanas antes del experimento.
    Nota: Aquí tiempo zeitgeber (ZT) 0 corresponde a luces y ZT12 a luces, manteniendo otros factores ambientales (es decir, alimentos, agua y temperatura) constante 21.

2. preparación de instrumentos, medio de cultivo y medio de desafío

  1. Autoclave con fórceps y tijeras de disección. Abrigo de pares de portaobjetos esmerilado en papel de aluminio y autoclave.
  2. Preparar medio de cultivo mediante la adición de suero bovino fetal (FBS) de RPMI 1640 a una concentración final de 10%. Preparar 10 mL de medio de desafío en tubos de 50 mL mediante la adición de los siguientes pmap al medio de cultivo (RPMI con 10% FBS); LPS (5 μg/mL), ODN1826 (5 μg/mL), calor-matado Listeria monocytogenes (108 HKLM/mL), u otro PAMP en su concentración sugerida.
  3. Calentar el medio de cultivo y el medio reto a 37 ° C en un baño de agua y mantener aproximadamente 70 mL de tampón de fosfato estéril salino (PBS, pH 7,2) a temperatura ambiente.
  4. Añadir 10 mL de medio de cultivo utilizando una pipeta de 10 mL y ayuda de la pipeta a un tubo de 50 mL y coloque en hielo.
  5. Agregar aproximadamente 30 mL de etanol al 70% a un 100 mL vaso de precipitados y lugar extremos de tijeras y pinzas de disección en el vaso para evitar la contaminación microbiana.
  6. Preparación tampón de lisis para aislamiento de RNA mediante la adición de 10 μl β-mercaptoetanol (bajo una campana de humos) cada 1 mL de tampón de RLT en un tubo de 50 mL. Hacer sólo la cantidad que sea necesaria (600 μl por muestra, que consta de aproximadamente 1 x 106 células).
    Nota: El RLT amortiguador es un componente del kit de extracción de RNA que apoya la Unión de la RNA a la membrana de silicona.

3. Splenocyte aislamiento y desafío

  1. Eutanasia a ratones en un momento particular zeitgeber vía narcosis por mantener en su caja original y adición de CO2 a la jaula con un caudal de 3 L/min continuar suministro de CO2 durante 1 minuto después de la respiración se detiene.
  2. Confirman muerte por dislocación cervical, colocando el pulgar y el dedo índice a ambos lados del cuello en la base del cráneo. Alternativamente, presione una varilla en la base del cráneo empujando rápidamente (con la otra mano) la base de la cola o las extremidades posteriores para causar la separación de las vértebras cervicales del cráneo22.
  3. Rociar el tronco de ratón con etanol al 70% y limpie con una toalla de papel. Coloque el ratón sobre su espalda y ligeramente inclinada hacia su lado derecho. Cortar la piel, utilizando disección tijeras, a lo largo del lado izquierdo del ratón, sobre a medio camino entre la parte delantera y patas traseras.
  4. Con unas pinzas, agarra el peritoneo y cuidadosamente hacer una incisión para no dañar el bazo. Extirpar el bazo con pinzas y coloque en un tubo estéril de 50 mL que contenga aproximadamente 10 mL de medio de cultivo en el hielo. Repita para el resto de los animales.
    Nota: El bazo es el color de un frijol, y es más largo y más planas que el riñón.
  5. Transferencia de un bazo con 2 mL de medio de cultivo para un pequeño plato de Petri estéril.
    1. Homogeneizar el bazo por molienda entre la porción helada de dos portaobjetos esmeriladas estériles. Si es posible, mantener el tema y las células en el medio durante el proceso de homogeneización.
    2. Una vez bien homogeneizado, pipeta de 2 mL de medio de cultivo con los esplenocitos a través de un tamiz de célula 40 μm nylon en un tubo de 50 mL.
    3. Repita los pasos anteriores para los bazos restantes usando nuevos pares de diapositivas helados, tubos de 50 mL con medio de cultivo y los filtros de la célula.
  6. Añada 8 mL de medio de cultivo frío a cada uno de los tubos de 50 mL que contiene los esplenocitos para un volumen total de 10 mL/tubo. Determinar el número de células por mililitro usando un hemocitómetro.
  7. Añadir aproximadamente 1 x 106 células/pozo en placas de cultivo de 6 pozos. Añadir las células a la cantidad de pozos que corresponden al número de diferentes PAMPs para el experimento e incluyen un control también. Añadir 3 mL de medio de cultivo o 3 mL de medio de desafío a los pocillos respectivos.
  8. Incubar las placas a 37 ° C en 5% CO2 para 3 h.
  9. Raspar las células de la parte inferior de la bien con una punta de pipeta 1.000 μl conectado a una micropipeta P1000. Transfiera el medio que contiene las células con el mismo 1.000 μl Punta de la pipeta en un tubo de 15 mL.
  10. Sedimenten las células mediante centrifugación a 167 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Quite el sobrenadante y lavar el sedimento celular con 5 mL de PBS.
  11. Sedimenten las células una segunda vez a 167 x g durante 5 minutos, retirar el sobrenadante y añadir 600 μl de tampón de lisis para el precipitado de células con el fin de lisar las células. Luego proceder al aislamiento de RNA.

4. aislamiento RNA y síntesis del cDNA

  1. Aislar RNA de esplenocitos utilizando el kit de extracción de RNA según instrucciones del fabricante y realizar la digestión de ADN en la columna 'opcional'.
  2. Antes de la síntesis de cDNA, determinar la concentración de RNA utilizando un espectrofotómetro microvolume para verificar que la concentración esté dentro del rango óptimo de RNA (2 μg) del kit de síntesis de cDNA.
  3. Sintetizar cDNA para cada una de las muestras mediante el kit de transcripción inversa según las instrucciones del fabricante. Utilice 10 μl de RNA para cada una de las muestras en un volumen total de reacción de 20 μl. En la terminación de la transcripción inversa (termociclador ejecutar) añada 20 μL H2O para cada reacción.
  4. Construir la curva estándar utilizando una micropipeta P10 o P20 a mRNA de unas muestras de control (por ejemplo, 5 μl de 2 muestras para un total de 10 μl) en un tubo de 0,5 mL para preparar el cDNA.
    1. Añadir 10 μl de 2 x mix master la transcriptasa reversa.
    2. En la terminación de la transcripción inversa, añadir 10 μl de H2O para el tubo de reacción, que servirá como la concentración inicial ("1") en la serie de diluciones de la curva estándar.
    3. Realizar una serie de diluciones 10 veces (1 a 10-4) mediante la adición de 45 μl de agua utilizando una micropipeta P100 o P200 en cuatro tubos de 0.5 mL señalados 10-1, 10-2, 10-3y 10-4.
      1. Añadir 5 μl de la concentración inicial "1" en el primer tubo (10-1) utilizando una micropipeta de P20, mezclar mediante pipeteo arriba y abajo varias veces, luego transferir 5 μl del tubo de 10-1 en el tubo señalado 10-2 y mezclar.
      2. Transferencia de 5 μl utilizando una micropipeta P20 del tubo 10-2 en el tubo señalado 10-3 y mezclar. Transferencia de 5 μl utilizando una micropipeta P20 del tubo 10-3 en el tubo señalado 10-4 y mezclar.

5. cuantitativo reacción en cadena de polimerasa (qPCR)

  1. Determinar la cuantificación relativa de niveles de mRNA por qPCR. Dentro de la instalación experimental, seleccione "Cuantificación – curva estándar relativa" y "TaqMan" química. Cambio el volumen de reacción de 10 μl. entrar la información relevante en el diseño de la placa (por ejemplo, gene de la blanco, curva estándar, reportero, etc.).
  2. Preparar la reacción para que contenga 0,5 μl del ensayo primer punta de prueba, 5 μl de la mezcla principal de expresión génica, 2 μl de H2O y 2.5 μl de cDNA (10-100 ng).
    1. Preparar una mezcla maestro multiplicando cada uno de los reactivos anteriores (excepto el cDNA) por el número de reacciones, asegurándose de incluirlos de la curva estándar, controles negativos, actuando cada reacción en duplicado y 2 reacciones extras que será para la variación del pipeteo.
    2. Pipeta 7.5 μl de la mezcla principal dispuesta en pozos determinados en una placa de 96 pocillos de reacción con una micropipeta o una pipeta multicanal. Pipeta de 2.5 μl de cDNA en el bien apropiado para las incógnitas y las normas y 2.5 μl de H2O en los pocillos de control negativo.
    3. Incluyen ensayos de primer punta de prueba de varios genes de reloj molecular y también incluyen un ensayo para un control endógeno (p. ej., β-actina).
  3. Con el fin de determinar los valores de expresión relativa, calcular la cantidad relativa media para cada repetición, después, para cada muestra, divida la cantidad relativa media para el gene de la blanco por la cantidad relativa promedio de β-actina.

6. estadístico análisis

  1. Usando el software de análisis estadístico, introducir datos en el programa en la opción estadísticas de columna. Seleccione un unidireccional ANOVA con prueba post-hoc de Dunnett para determinar diferencias entre los valores medios de la expresión de genes reloj después del desafío PAMP versus el control.

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Resultados

Ratones fueron sacrificados en ZT13, esplenocitos fueron aislados y cuestionada ex vivo con los PAMPs LPS, ODN1826 o HKLM. Después de 3 h, RNA fue aislado y qPCR fue utilizado para evaluar los niveles de expresión relativa de los genes de reloj molecular Clock, Per2, Dbp y Rev-erbα compararon a las células control indiscutido. Después del desafío PAMP, niveles de expresión de reloj no fueron significativamente diferentes de expresión e...

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Discusión

Dentro de este protocolo, puede utilizarse un espectrofotómetro microvolume para cuantificar y evaluar la pureza del ARN se utiliza en la determinación de la expresión génica. Los ácidos nucleicos absorben UV luz a 260 nm, típicamente las proteínas absorben la luz a 280 nm, mientras que otros potenciales contaminantes durante un procedimiento de extracción de RNA (por ejemplo, fenol) pueden detectarse en 230 nm. Por lo tanto, determinando la absorbancia (A) relación a 260/280 nm (RNA a proteína) y 260/230 nm (RN...

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Divulgaciones

El autor no tiene nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por las becas de investigación de la Facultad de la Facultad de Artes y Ciencias Dean oficina en la Universidad de Hartford.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Portaobjetos esmeriladosFisher12-550-343
Filtros celularesFisher22363547
Lipopolisacárido InvivoGenltrl-eklps
ODN1826InvivoGenTlrl-1826-1
HKLMInvivoGenTlrl-hklm
RPMI 1640Gibco11875-093
PBSGibco20012-043
RNeasy Mini KitQiagen74104 o 74106
Juego de DNasa sin RNasaQiagen79254
Placa de cultivo celular de 6 pocillosDenvilleT1006
Tubos de 50 mLCorning352070
Tubos de 15 mLCorning352097
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidadThermoFisher4368814
TaqMan Ensayos de expresión génica b-actinaThermoFisherMm00607939_s1
Ensayos de expresión génica TaqMan Per2ThermoFisherMm00478113_m1
Ensayos de expresión génica TaqMan Rev-erbaThermoFisherMm00520708_m1
Ensayos de expresión génica TaqMan Bmal1ThermoFisherMm00500226_m1
Ensayos de expresión génica TaqMan DbpThermoFisherMm00497539_m1
máquina de qPCR StepOnePlusThermoFisher
TaqMan Gene Expression Master MixThermoFisher 4369016
MicroAmp Fast Placa de reacción de 96 pocillos (0,1 mL)ThermoFisher4346907
Software de análisis estadísticoPrism 7.0a

Referencias

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