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Artículo de método

Evaluación funcional de las vías olfatorias en los renacuajos de Xenopus de vida

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DOI:

10.3791/58028

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11 de diciembre de 2018

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* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso en vivo. Se describen metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de Xenopus larvas en condiciones normales de cría o después de la lesión.

Resumen

Los renacuajos de Xenopus ofrecen una plataforma única para investigar la función del sistema nervioso. Proporcionan múltiples ventajas experimentales, tales como accesibilidad a numerosos métodos de proyección de imagen, técnicas electrofisiológicas y ensayos de comportamiento. El sistema olfativo del renacuajo Xenopus es particularmente idóneo para investigar la función de sinapsis establecidas durante el desarrollo normal o reformado después de la lesión. Aquí, describimos las metodologías para evaluar el procesamiento de la información olfativa en la vida de las larvas de Xenopus . Esbozamos una combinación de medidas en vivo de las respuestas de calcio presinápticos en glomérulos del bulbo olfativo con ensayos de comportamiento olfativo guiado. Métodos pueden combinarse con la transección de nervios olfativos para el estudio de la configuración de la conectividad sináptica. Los experimentos se presentan animales de tipo salvaje y genéticamente modificados expresando reporteros GFP en células del sistema nervioso central. Aplicación de los enfoques descritos a los renacuajos genéticamente modificados puede ser útil para desentrañar las bases moleculares que definen comportamiento vertebrado.

Introducción

Los renacuajos de Xenopus constituyen un excelente modelo animal para estudiar la función normal del sistema nervioso. Transparencia, un genoma completamente secuenciado1,2y accesibilidad a las técnicas quirúrgicas, electrofisiológicos y de imagenológicos son propiedades únicas de las larvas de Xenopus que permiten investigar las funciones neuronales in vivo3 . Algunas de las múltiples posibilidades experimentales de este modelo animal son ilustrados por los estudios cuidadosos en renacuajo sistemas sensorial y motor4,

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Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de ética de investigación animal de la Universidad de Barcelona.

Nota: Los renacuajos de X. tropicalis y X. laevis son criados según los métodos estándar13,14. Agua de renacuajo es preparado agregando sales comerciales (véase Tabla de materiales) al agua obtenida por ósmosis inversa. Conductividad se ajusta a ∼700 μs y ∼1, 400 μs para los renacuajos de X. tropicalis y X. laevis , respectivamente. Las larvas pueden obtenerse ya sea por monta natural o fecundac....

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Resultados

En este trabajo presentamos una combinación de dos enfoques complementarios para realizar el estudio en vivo de la funcionalidad del sistema olfativo renacuajo Xenopus : i) un método para la proyección de imagen presináptica Ca2 + cambios en los glomérulos de la vida los renacuajos con un indicador fluorescente de calcio y ii) un olor guiado ensayo conductual que puede utilizarse para investigar la respuesta a olores específicos de transmitidas por el agua. Pu.......

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Discusión

Este documento describe técnicas que son útiles para investigar la funcionalidad de las vías olfatorias en la vida de los renacuajos de Xenopus . El protocolo actual es particularmente útil para aquellos laboratorios que trabajan o tienen acceso a Xenopus; sin embargo, también es interesante para aquellos investigadores que estudian las bases celulares y moleculares de la regeneración neuronal y reparación. Resultados obtenidos en Xenopus pueden combinarse con datos recogidos en otros modelos v.......

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por becas del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO; SAF2015-63568-R) cofinanciado por Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER), con premios de investigación competitiva de la M. G. F. Fuortes Memorial Fellowship, del fondo de becas de Stephen W. Kuffler, Laura y Arturo Colwin verano investigación beca Fondo , la beca de Fischbach y el gran fondo de generación del laboratorio biológico marino y el nacional Xenopus recursos RRID:SCR_013731 (Woods Hole, MA) donde se llevó a cabo una parte de este trabajo. También agradecemos a CERCA programa / Generalitat de Catalunya para apoyo institucional. A.L. es Serra Húnter.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sales para acuarios (Instant Ocean Salt)TecniplastXPSIO25R
Tricaine (Etil 3-aminobenzoato metanosulfonato)Pinzas Sigma-AldrichE10521
#5 (punta 0,025 x 0,005 mm)World Precision Instruments501985
Tijeras Vannas (punta 0,015 x 0,015)World Precision Instruments501778
Whatman papel de filtro cualitativoFisher ScientificWH3030917
X. laevis tubb2-GFPNational Xenopus Resource (NXR), RRID:SCR_013731NXR_0.0035
X.tropicalis NBT-GFPCentro Europeo de Recursos de Xenopus (EXRC) RRID:SCR_007164
CellTracker CM-DiIThermoFisher ScientificC-7001
Calcio Verde Dextrano, Sal de Potasio, 10.000 MW, AniónicoThermoFisher ScientificC-3713
Capilares de borosilicato para microinyecciónInstrumento SutterB100-75-10O.D.=1,0 mm., D.I.=0,75 mm.
ExtractorSutter InstrumentP-97
MicroinyectorParker InstrumentsPicospritzer III
Sylgard-184Sigma-Aldrich761028-5EA
Micropipetas MicrofilWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Microscopio verticalZeissAxioImager-A1
Master-8 estimuladorA.M.P.I.
Cámara CCDHamamatsuImage EM
ElectroválvulasWarner InstrumentsVC-6 Sistema
Dow Corning Grasa de alto vacíoVWR Scientific636082B
Clorhidrato de tubocurarinaSigma-AldrichT2379
Cámara CCDZeissMRC-5Cámara controlada por Zen software
lentede cámara Thorlabs MVL8ML3Existen múltiples posibilidades que deben adaptarse al modelo de cámara utilizado Resina
epoxicomponentes
Colectorde perfusión Warner Instruments MP-6
Micromanipulador para la entrega local de solucionesNarishigeMN-153
Mini pinzas magnéticasWarner InstrumentsMAG-7, MAG-6
Tubo de polietilenoWarner Instruments64-0755O.D.=1,57 mm., D.I.=1,14 mm.
de seis canales Colector de RS

Referencias

  1. Hellsten, U., et al. The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis. Science. 328 (5978), 633-636 (2010).
  2. Session, A. M., et al. Genome evolution in the allotetraploid frog Xenopus laevis. Nature. 538 (7625), 336-343 (2016).
  3. Zhang, L. I., Tao, H. ....

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