Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Summary

La identificación de interacciones físicas entre los genes y elementos reguladores es un reto, pero ha sido facilitada por los métodos de captura de conformación de cromosoma. Esta modificación al Protocolo de 4C-seq mitiga sesgo PCR minimizando la amplificación excesiva de plantillas de PCR y maximiza el mappability de Lee mediante la incorporación de un paso de síntesis de enzima de la restricción además.

Abstract

La identificación de elementos reglamentarios para un gen determinado objetivo plantea un desafío técnico significativo debido a la variabilidad en los tamaños de efecto y colocación de elementos reguladores para un gene de la blanco. Algunos progresos con la predicción de Bioinformática de la existencia y función de las modificaciones epigenéticas proximal asociada a genes activados usando sitios de unión del factor de transcripción conservado. Estudios de captura de conformación de la cromatina han revolucionado nuestra capacidad de descubrir contactos físicos cromatina entre secuencias e incluso dentro de un genoma entero. Captura de la conformación de cromatina circular juntada con la secuenciación de próxima generación (4C-seq), en particular, está diseñada para descubrir todas las posibles interacciones de cromatina física para una secuencia dada de interés (mirador), como un gene de la blanco o un regulador potenciador. Las 4C-seq estrategias directamente de la secuencia en el punto de vista pero requieren numerosos y diversos puntos de vista para ser secuenciado simultáneamente para evitar los desafíos técnicos de uniforme basan llamando a (imagen) con plataformas de secuenciación de nueva generación. Este volumen de experimentos puede no ser práctico para muchos laboratorios. Aquí, Divulgamos un acercamiento modificado para el protocolo C 4-seq que incorpora una digestión de la enzima de restricción adicional y pasos de amplificación basada en qPCR que están diseñados para facilitar una mayor captura de lecturas de diversa secuencia y mitigar el potencial de Polimerización en cadena diagonal, respectivamente. Nuestro método modificado de 4C es favorable para el laboratorio de biología molecular estándar para evaluar la arquitectura de la cromatina.

Introduction

La identificación de elementos reguladores de expresión génica se ha facilitado por el proyecto de la enciclopedia de elementos de ADN (ENCODE) que comprensivo había anotado actividad funcional para el 80% del genoma humano^1,2. La identificación de los sitios en vivo Unión de factor de transcripción, hipersensibilidad al DNaseI, y epigenético histona modificaciones de metilación del ADN en tipos de células individuales allanó el camino para el análisis funcional del candidato regulatorio elementos para la expresión del gen objetivo. Armado con estos resultados, nos enfrentamos con el desafío de determinar la interconexión funcional entre elementos reguladores y genes. Específicamente, ¿cuál es la relación entre un gen dada y su enhancer(s)? El método de captura (3C) de conformación de la cromatina aborda directamente esta cuestión por la identificación físicas y probablemente funcionales, las interacciones entre una región de interés y candidato interactuando secuencias a través de eventos capturados en cromatina fija³ . Como nuestra comprensión de las interacciones de la cromatina ha aumentado, sin embargo, es claro que la investigación de los lugares geométricos del candidato preseleccionado es insuficiente para proporcionar una comprensión completa de las interacciones del gene enhancer. Por ejemplo, codificar utiliza el método de copia (C 5) conformación cromosómica de alto rendimiento captura para examinar una pequeña parte del genoma humano (1%, piloto de 44 loci) y reportó la compleja interconexión de los loci. Genes y potenciadores con interacciones identificadas un promedio de 2 – 4 socios interactúan diferentes, muchos de los cuales fueron cientos de kilobases lejos en el espacio lineal⁴. Además, Li et al. utilizado el análisis de interacción de cromatina por Paired-End etiqueta secuenciación (ChIA-PET) para analizar las interacciones promotor de todo el genoma y encontró que 65% de los sitios de Unión II de ARN polimerasa estuvieron implicado en las interacciones de la cromatina. Algunas de estas interacciones dio como resultado grandes, genes múltiples complejos que abarcan cientos de kilobases de distancia genómica y que contiene, en promedio, 8-9 genes cada⁵. Juntos, estos resultados destacan la necesidad de métodos imparciales de todo el genoma para interrogar a las interacciones de la cromatina. Algunos de estos métodos se revisan en Schmitt et al. ⁶.

Métodos más recientes para los estudios de captura de conformación de la cromatina junto con generación de secuenciación (Hi-C y C 4-seq) permiten el descubrimiento de secuencias desconocidas interactuando con una región de interés⁶. Específicamente, captura de conformación circular cromosoma con secuenciación de próxima generación (4C-seq) fue desarrollado para identificar loci interactuando con una secuencia de interés en una manera imparcial⁷ mediante la secuenciación de ADN de cromatina capturada proximal a la región de interés en el espacio 3D. Brevemente, la cromatina se fija para preservar sus interacciones proteína-ADN nativo, troceados con una enzima de la restricción y posteriormente ligarse en condiciones diluidas captura biológicamente relevantes “enredos” de loci interactuantes (figura 1). Los enlaces cruzados se invierten para quitar la proteína, quedando así el ADN disponible para escote adicional con una segunda enzima de restricción. Una ligadura final genera círculos más pequeños de loci interactuando. Cartillas para la secuencia de interés entonces se utilizan para generar una biblioteca amplificada de secuencias desconocidas de los fragmentos circular, seguidos por la secuencia de generación siguiente aguas abajo.

El protocolo presentado aquí, que se centra en la preparación de la muestra, hace dos alteraciones principales existentes 4C-seq métodos^8,9,10,11,12. En primer lugar, utiliza un método basado en qPCR empíricamente determinar el número óptimo de amplificación ciclos para pasos de preparación de biblioteca C 4-seq y así mitiga el potencial sesgo de PCR de amplificación excesiva de las bibliotecas. En segundo lugar, utiliza un paso de recopilación de restricción adicionales en un esfuerzo para reducir la uniformidad de secuencias conocidas de “cebo” que impide precisa base llamada por el instrumento de la secuencia y, por lo tanto, maximiza la secuencia informativa, única en cada lectura. Otros protocolos de eluden esta cuestión poniendo en muchas bibliotecas de (12-15)⁸ 4 C-seq con cebo diferentes secuencias o sitios de restricción, un volumen de experimentos que no sean alcanzables por otros laboratorios. Las modificaciones aquí presentadas permiten un pequeño número de experimentos, las muestras o repeticiones para ser indexadas y agrupados en un solo carril.

Protocol

1. selección de la enzima de la restricción Identificar una región de interés (por ej., promotor del gene, polimorfismo de nucleótido único (SNP), potenciador) y obtener la secuencia del ADN de los repositorios como centro nacional para información biotecnológica (NCBI). Identificar las enzimas de restricción del candidato (REs) de la primera enzima de la restricción digestión (RE1) que no corte dentro de la secuencia de interés, que producir extremos pegajosos (termini de ADN con voladizos) después de la RE la digestión, y cuyas actividades no son inhibidas por Metilación CpG.Nota: La resolución de los datos es determinada por RE1. Una enzima con una secuencia de reconocimiento de 6 pares de base (PB) produce, en promedio, fragmentos aproximadamente 4 kilobases (kb) de longitud, mientras que una enzima con una secuencia de reconocimiento 4 bp produce fragmentos aproximadamente 250 bp de longitud, lo que permite mayor precisión identificación de secuencias de interacción. Seleccione un RE1 de las enzimas de candidatos identificadas en el paso 1.2 que produce un “Mirador” restricción fragmento al menos 500 bp largo que incluye la región de interés o, alternativamente, una región vecina.Nota: La enzima seleccionada debe tener cartilla de diseño (véase paso 2). Para la segunda digestión, identificar una enzima de restricción (RE2) con una secuencia de reconocimiento 4 bp que produce extremos pegajosos (termini de ADN con voladizos) después RE digestión, cuya actividad no es inhibida por la metilación CpG y que corta dentro de la restricción fragmento de RE1 para producir un fragmento de cebo 250 – 500 bp (figura 1).Nota: La enzima seleccionada debe tener cartilla de diseño (véase paso 2). 2. diseño y prueba de iniciadores para qPCR PCR inversa y la eficiencia de la digestión Utilice una herramienta de diseño de la cartilla como Primer3 (http://primer3.ut.ee) para el diseño de primers inversas que se dirigen hacia afuera hacia los extremos del fragmento de cebo (es decir., el primer 5′ es una “inversión” cartilla, complementaria a la hebra plus, mientras que el primer 3′ es un ” “hacia adelante cartilla, complementaria a la hebra negativa) y cerca de los sitios de restricción como sea posible para minimizar la amplificación del cebo no informativo secuencian y maximizan la eficiencia de la PCR (figura 2A).Nota: Imprimaciones deben predecirse tener mínima amplificación no específica de la DNA genomic por en silico predicciones de PCR y debe estar alineado no en otros lugares en el genoma excepto el objetivo con más de 16/18 identidad9. Como adaptadores de secuencia no se incorporan a los cebadores PCR inversos, el sitio de unión del primer es más flexible que en otros métodos de preparación de 4C; primers deben templar óptimo dentro de 50 bp del fin del sitio de restricción correspondiente. Para confirmar la especificidad de los primers PCR inversas amplificación utilizando ADN genómico purificado (gDNA) como plantilla. Imprimaciones óptimo deben producir algunos productos al usar gDNA como plantilla (ver paso 11.2 para la descripción de los productos esperados de 4C). Si se produce amplificación sustancial de gDNA, diseñar nuevas cartillas. Si no se identifican aceptable primer sets, volver al paso 1 y seleccione un cebo nuevo seleccionando nuevas enzimas de restricción. Diseño de cartillas de qPCR para amplificar los fragmentos de 70 a 200 nucleótidos (nt) de longitud para monitorizar la eficiencia de digestión de restricción (figura 2B). Diseño de un par de cebadores para amplificar a través de cada sitio de restricción (seleccionado en el paso 1) que definen la secuencia de cebo. Diseño de los cebadores para ambos RE1 (ver paso 6.5.6) y sitios de RE2 (ver paso 9.2). Diseño de un conjunto de cartillas que amplifica una región que no contiene los sitios para cada enzima de restricción como control de normalización (DNA sin cortar) RE1 y RE2 (ver también paso 6.5.6). 3. colección de células Utilizando un método que es apropiado para el cultivo de tejido o célula, obtenga una suspensión unicelular. Las células por 5 min a 200 x gde pellets, deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 μl de 1 x de tampón fosfato salino (PBS) por 107 células. 4. formaldehído Cross-linking de las células para mantener interacciones de cromatina Por 107 células, añadir 9,5 mL de 1% la microscopia electrónica (EM)-grado de formaldehído (metanol-libre) en PBS e incubar, mientras que la agitación en el eje de balancín (o similar), durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT, 18 – 22 ° C).Nota: Condiciones de fijación deberá ser optimizado para cada tipo de célula. Trabajo previo publicado en células de ratón informó de que la fijación óptimos resultados en al menos el 40% de lecturas asignadas, alinear con el cromosoma que contiene el punto de vista9 suponiendo que una región no telomeric para un cromosoma de tamaño promedio. La transferencia de los tubos de reacción para el hielo y añadir helada glicina de 1 M a una concentración final de 0,125 M (1,425 mL) para calmar la reacción de reticulación. Mezclar por inversión suave. Centrifugar durante 5 min a 200 x g, 4 º C y retire con cuidado el sobrenadante. Guarde el precipitado de células a-80 ° C o proceder de inmediato a la lisis de la célula. 5. lisis de la célula Resuspender el precipitado de células de paso 4.3 en 500 μl de ácido de 5 mM etilendiaminotetracético (EDTA) para lavar. Centrifugue a 200 x g durante 5 min a RT. descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet celular en 125 μl de 5 mM EDTA, 0,5% sodio dodecil sulfato (SDS) e inhibidores de la proteasa de 1 x, como un cóctel que contiene antidolor de 5 mg/mL, 10 mg/mL chymostatin, leupeptin 10 mg/mL y 10 mg/mL pepstatin A. de 100 xNota: Concentración de detergente tenga que ser optimizado para cada tipo de célula. Concentraciones de detergente insuficiente se traducirá en lisis celular incompleta, dejando cromatina inaccesible para las enzimas de restricción. Si es persistentemente baja en paso 6.5.6 digestión de restricción y se ha confirmado la actividad de la enzima, detergente adicional puede ser necesario. Aumentar la concentración de SDS en incrementos de 0.1%. Incubar la suspensión celular en hielo durante 10 minutos.Nota: De keratinocytes humanos primarios, lisis óptima se logró mediante una incubación de 10 min a 65 ° C, seguida por una incubación durante la noche de la de 37 ° C en un bloque de calefacción agitación con agitación (900 rpm). Asegúrese de que lisis celular completa. Mezcla 6 μl de las células con 6 μl de azul tripán en un portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos. Ver bajo el microscopio.Nota: Sobre lisis exitosa, el interior de las células aparece azul y las células no sometidas a lisis aparecerá de blancas. Si la lisis de la célula parece insuficiente, sedimenten las células a 200 x g durante 5 minutos y guarde el sobrenadante. Resuspender el precipitado y repita los pasos 5.2-5.4 o alternativamente con temperaturas de incubación diferentes (véase la nota de paso 5.3). Combinar el balín nuevamente sometidas a lisis con el sobrenadante guardado y continuar.Nota: La Inspección Visual no es una garantía de lisis suficiente. Eficiencia de la digestión debe determinarse objetivamente como en el paso 6.5.6. 6. primera restricción digestión Añadir 30 μL de 10 x buffer de la enzima de restricción (especificada por el fabricante) y 27 μL 20% Tritón X-100 (final 1.8%) a la suspensión del paso 5.4. Llevar el volumen total a 300 μL de H2O.Nota: La composición del buffer de enzima de restricción dependerá de la RE elegido en el paso 1. Quitar un 15 μL alícuota como un “Control sin digerir” y almacenar a 4 ° C. Añadir 200 U RE1 a la mezcla de reacción restantes e incubar durante una noche a la temperatura adecuada a la enzima en un bloque de calefacción agitación con agitación (900 rpm). Al día siguiente, agregar un adicional 200 U RE1 y continuar la incubación durante la noche. Quitar un 15 μL alícuota como “control de Digested” y almacenar a 4 ° C. Determinar la eficiencia de la digestión: Añadir 82.5 μl de 10 mM Tris-HCl pH 7.5 a las 15 muestras μl de pasos 6.2 y 6.4. Añadir 2,5 μl de proteinasa K (20 mg/mL) e incubar 1 h a 65 ° C. Añada 100 μl de fenol-cloroformo y mezclar vigorosamente por inversión para eliminar la contaminación residual de la proteína. Centrifugar durante 5 min, 16.100 x g a temperatura ambiente. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo. Añadir μl 6.66 de 3 M sodio acetato pH 5.2, 1 μl de glucógeno 20 mg/mL y 300 μL de etanol (EtOH) del 100%. Mezclar suavemente por inversión y lugar a-80 ° C durante 1 h. Centrifugar 20 min a 16.100 x g a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante, agregar 500 μl de 70% EtOH y centrifugar durante 5 min a 16.100 x g a TA. Quite el sobrenadante y secar el precipitado a temperatura ambiente por 2 minutos Resuspender el precipitado en 50 μl de H libre de nucleasa2O. Determinar la eficiencia de digestión por qPCR13,14 el método de ∆∆Ct. Utilice el primer set no flanqueando un sitio de restricción (ver paso 2.2.2) como el control de normalización. Proceder si la eficiencia de la digestión es > 85%. De lo contrario, las células de la pelotilla y repita los pasos 5.2, 6.5, omitiendo la incubación a 65 ° C en paso 5.3. 7. primera ligadura Calor-inactivar la enzima de restricción por incubar 20 minutos a 65 ° C. Alternativamente, si la enzima no puede ser inactivado por calor, extracción de fenol-cloroformo y etanol precipitar la muestra.Nota: Las temperaturas de inactivación recomendadas para algunas enzimas de restricción desnaturalizar las proteínas de la cromatina, y esto puede afectar negativamente la calidad de la muestra. Además, la extracción de fenol: cloroformo no es ideal, como resulta en la pérdida de muestra. Transferir a un tubo cónico de 50 mL y añadir 6 mL de libre de nucleasa H2O, 700 μl de 10 x buffer ligasa (660 mM Tris-HCl pH 7.5, 50 mM cloruro de magnesio (MgCl2), 10 mM Ditiotreitol (DTT), adenosina trifosfato (ATP) de 10 mM) y 50 U T4 ADN ligasa. Agitando la mezcla suavemente e incubar durante la noche a 16 ° C. Sacar una alícuota de 100 μl de la muestra como el ” control de ligadura ”. Determinar la eficacia de la ligadura: Añadir 2,5 μl de proteinasa K (20mg/mL) e incubar 1 h a 65 ° C. Añada 100 μl de fenol-cloroformo y mezclar vigorosamente por inversión. Centrifugar durante 5 min, 16.100 x g a TA. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo. Añadir μl 6.66 de 3 M sodio acetato pH 5.2, 1 μl de glucógeno y 300 μL del 100% EtOH. Mezclar suavemente por inversión y lugar a-80 ° C aproximadamente 1 h. Centrifugar 20 min a 16.100 x g a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante, agregar 500 μl de 70% EtOH y centrifugar durante 5 min a 16.100 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante y secar el precipitado a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado en 20 μl de agua y de carga en un gel de agarosa del 0,6% al lado de los controles de”digestión” de paso 6.5.Nota: Una muestra bien ligada debe aparecer como una banda relativamente estrecha, de alto peso molecular (figura 3). Si la ligadura es suficiente, continúe con el paso 8. De lo contrario, añadir ATP fresco (concentración final de 1 mM) y nueva ligasa; Incubar durante una noche a 16 ° C y repita los pasos 7.3 – 7.4. 8. Invierta el cross-linking y aislar la cromatina Añadir 15 μl de proteinasa K (20 mg/mL) e incubar durante una noche a 65 ° C para invertir los enlaces cruzados. Añadir 30 μl de ARNasa A (10 mg/mL) e incubar de 45 min a 37 ° C. Agregar 7 mL de fenol-cloroformo y mezclar vigorosamente por inversión. Centrifugar 15 min., 3.300 x g a TA. Transferir la fase acuosa a un nuevo tubo de 50 mL y añadir 7,5 mL de libre de nucleasa H2O (para diluir la TDT actual en el buffer ligasa, que precipita con el ADN), 1 mL de 3 M sodio acetato pH 5.6, 7 μl de glicógeno (20 mg/mL) y 35 mL de 100% EtOH. Mezclar e incubar a-80 ° C durante 1 hora. Centrifugar 20 min, 3.900 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante (pellet puede ser difícil de ver), lavar el sedimento con 10 mL de helado 70% EtOH y centrifugar 15 min, 3.300 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante y secar brevemente la pelotilla en RT. disolver la pastilla en 150 μL de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 37 ° C. Almacenar a-20 ° C o continuar con el paso 9. 9. segunda restricción digestión: Recortar los círculos Nota: Este paso crea círculos más pequeños para reducir al mínimo la sobrerepresentación de menores capturados fragmentos debido a sesgo PCR en los pasos de amplificación de corriente abajo. A la muestra de paso 8.6, añada 50 μl de 10 x buffer de la enzima de la restricción (especificada por el fabricante), 300 μL de libre de nucleasa H2O y 50 U de enzima de restricción RE2. Incubar durante una noche a la temperatura apropiada para la enzima solicitada. Sacar una alícuota de 15 μl de la muestra como el “control de digestión”. Determinar la eficiencia de digestión como se describe en paso 6.5. 10. segunda ligadura y purificación de DNA Inactivar la enzima de restricción según lo recomendado por el fabricante. Si la enzima no puede ser inactivado con calor, quitar la enzima usando un kit de purificación basada en columna.Nota: Esto se traduce en la pérdida de muestra, purificación de la columna no es ideal. Transferir la muestra a un tubo de 50 mL y añadir 12,1 mL libre de nucleasa h2O, 1,4 mL de 10 x buffer de ligadura (660 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM MgCl2; 10 mM TDT, 10 mM ATP) y 100 U T4 ADN ligasa. Incubar durante una noche a 16 ° C. Añadir 467 μl de 3 M sodio acetato pH 5.6, 233 μl libre de nucleasa H2O, 7 μl glucógeno (20 mg/mL) y 35 mL 100% EtOH. Mezclar bien e incubar a-80 ° C 1 h. Centrifugadora de 45 min, 3.900 x g a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante, agregar 10 mL de frío 70% EtOH y centrifugar 15 min, 3.300 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante y secar brevemente el precipitado a temperatura ambiente. Añadir 150 μL de 10 mM Tris-HCl pH 7.5 e incubar a 37 ° C para disolver el precipitado. Purificar las muestras con un sílice columna-basado PCR purificación kit, siguiendo las instrucciones del fabricante. Utilice 1 columna por 3 x 106 células, basadas en el número inicial de las células. Eluir las columnas con 50 μl de 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 y las muestras de la piscina. Medir la concentración por fluorimetría o espectrofotometría utilizando la absorbancia a 260 nm. La plantilla de 4C está lista para inverse PCR. Almacenar a-20 ° C o vaya directamente al paso 11. 11. PCR amplifican secuencias de interacción desconocidas mediante PCR inversa Determinar la gama linear de la amplificación mediante la realización de una PCR utilizando diluciones de plantilla de 12.5, 25, 50 y 100 ng 4C plantilla. Si lo desea, amplificación del gDNA en paralelo para comparar directamente los productos con el fin de identificar la amplificación no específica. Ejecutar reacciones de PCR utilizando una desnaturalización inicial a 94 ° C por 2 min; 30 ciclos consisten en un paso de desnaturalización a 94 ° C por 10 s, un paso de recocido a 55 ° C por 1 min y un paso de extensión a 68 ° C por 3 min; y una extensión final a 68 ° C durante 5 minutos. Separar 15 μl de cada producto PCR en un gel de agarosa 1,5% para confirmar linear de la amplificación y evaluar la calidad de la plantilla (figura 4). Amplificación de 4C plantilla debe generar bandas discretas en bajas concentraciones de ADN y un frotis en concentraciones más altas. La presencia del borrón de transferencia indica aumento de la complejidad de los amplificados C 4 trompas. Cuando esté satisfecho con la calidad y cantidad el inverso del producto de PCR generado, configurar una qPCR para determinar el número óptimo de ciclos para la amplificación: Establecer las reacciones que contienen colorantes SYBR y ROX utilizando la mezcla de reacción en la tabla 2. A menos que la amplificación no lineal en altas concentraciones en paso 11.2, uso 100 ng de la plantilla por reacción.Nota: La adición de ROX facilita la normalización de la señal fluorescente de pozo a pozo y ciclo a ciclo. Ejecutar las reacciones de PCR utilizando una desnaturalización inicial a 94 ° C por 2 min; 40 ciclos consisten en un paso de desnaturalización a 94 ° C por 10 s, un paso de recocido a 55 ° C por 1 min y un paso de extensión a 68 ° C por 3 min; y una extensión final a 68 ° C durante 5 minutos. Determinar la fluorescencia máxima (punto final) de las reacciones utilizando la trama de la amplificación. Determinar el ciclo en que las reacciones alcanzan el 25% del pico de fluorescencia (figura 5).Nota: Este es el número de ciclos que se utilizarán para ampliar las bibliotecas de C 4 (ver paso 11.4). Configurar inverse PCR como en la tabla 3 para amplificar secuencias desconocidas ligadas al cebo de la plantilla de C 4. Dividir en 16 reacciones de 50 μl antes de correr. Ejecutar reacciones de PCR utilizando una desnaturalización inicial a 94 ° C por 2 min y ciclos que consiste en un paso de desnaturalización a 94 ° C por 10 s, un recocido paso a 55 ° C por 1 min y un paso de extensión a 68 ° C durante 3 minutos usar el número de ciclos determinado en el paso 11.3.3. Recoger y las reacciones de la piscina. Purificar mediante un kit de potabilización de PCR basados en la columna de sílice. Utilizar al menos 2 columnas por 16 reacciones. Los productos PCR purificados de la piscina. Determinar la cantidad de la muestra y pureza por espectrofotometría. Rendimientos típicos son entre 10 y 20 μg con A260/A280 ~ 1.85. Si las tasas de absorción son subóptimos, volver a purificar con el fin de evitar los problemas durante la secuencia. Evaluar la complejidad de la biblioteca mediante la separación de 300 ng del producto PCR purificado en un gel de agarosa al 1,5%.Nota: Producto amplificado debería parecerse a de paso 11.2. 12. tercera restricción digestión: Recortar secuencias de cebo Nota: Este paso elimina secuencias de cebo no informativo de los productos PCR inversos para maximizar informativas secuencias capturadas en los pasos posteriores de la secuencia. Para supervisar la eficiencia de la digestión, un “monitor de digest”15 es digerida en paralelo con la concentración de DNA y la enzima equivalente. Si RE1 y RE2 son incompatibles para la digestión simultánea, por ejemplo, debido a temperaturas de incubación óptimas diferentes o almacenadores intermediarios de la reacción, esto debe hacerse como una recopilación secuencial (esto no es ideal). Obtener a un monitor de digest RE y prueba la digestión en una reacción de 50 μl.Nota: Esta es una molécula de dsDNA (por ejemplo, un plásmido, amplicon PCR o ADN sintético) que contiene el sitio RE. El único requisito es que sea fácil distinguir corte del monitor sin cortar en un gel de agarosa. Optimizar RE monitor masa enzima concentración y si es necesario. Resumen 1 μg purificada inversa del producto de PCR de 11.6 de paso y, en paralelo, el monitor RE de paso 12.1.Nota: ADN y concentración de enzima, así como el tiempo de incubación, debe ser la misma que para la recopilación de prueba en paso 12.1 por tanto el inverso producto de PCR y los resúmenes de monitor. Ajustar el volumen de reacción según sea necesario. Ejecutar el digerido RE monitor en un gel de agarosa de concentración apropiado para los fragmentos esperados. Digestión se considera suficiente cuando < 10% de la DNA sigue siendo sin cortar (figura 6). Purificar el producto PCR inverso digerido en un kit de purificación de DNA basado en la columna de sílice. Si resúmenes secuenciales están necesarios, repita los pasos – 12.4 12.1 con la segunda enzima. 13. preparación de la biblioteca de secuenciación Ligar los adaptadores compatibles con la respectiva plataforma de secuenciación de última generación. Diseño de los adaptadores para cada RE1 y RE2 para que, después de recocer los oligos, cada adaptador RE tiene el respectivo voladizo 1 cara.Nota: por ejemplo, si Hinel dIII es utilizado, el adaptador de recocido debe contener una proyección de “AGCT” 5′ fosforilado. Por otra parte, si se utilizan adaptadores estándar de T-proyección, final-reparación y cola A la biblioteca antes de la ligadura de adaptador. Recueza el adaptador respectivo RE oligos. Suspender los oligos en recocido buffer (10 mM Tris, pH 7.5, 50 mM cloruro de sodio (NaCl), 1 mM EDTA), la mezcla en cantidades equimolares a 50 μm, 95 ° C, el calor y deje que se enfríe lentamente a 25 ° C. Realizar la reacción de ligadura. Mezclar nuevamente digeridos 4 C biblioteca con un total 5 a 10 veces molar exceso de recocido adaptadores (Paso 13.1.2; relación de 50: 50 para cada adaptador de RE utilizada) en 1 x buffer ligasa y añadir 6U ligase de la DNA. Incubar según las instrucciones del fabricante. Retirar los adaptadores exceso purificando con el equipo de basados en sílice de la columna volumen de elución baja. Selección de tamaño.Nota: Selección del tamaño también se puede realizar utilizando un kit de limpieza basados en el grano y se recomienda incluso después de la purificación de la columna. Un gel de agarosa al 2% utilizando una agarosa de alta resolución, añadiendo un tinte no-UV antes de verter la fundición. Asegurar que toda el agua perdido por evaporación durante el calentamiento se sustituye por la botella o frasco de pesaje antes y después de calentar y agregar agua para recuperar la masa perdida. Ejecutar las bibliotecas adaptador de ligarse en el gel, dejando carriles vacíos entre las muestras. Suprimir las rodajas de gel correspondiente a la bp de tamaño rango 150 a 1 kb con un bisturí limpio u hoja de afeitar. Purificar las bibliotecas del gel utilizando un kit de extracción de gel. Para minimizar el sesgo de la GC en la recuperación de la DNA, se disuelven las láminas de gel a temperatura ambiente con rotación. Determinar el número de ciclos para la amplificación de PCR por qPCR utilizando la mezcla de reacción en la tabla 4. Ejecutar reacciones de PCR utilizando una desnaturalización inicial a 98 ° C por 2 min y 40 ciclos que consiste en una desnaturalización paso a 98 ° C por 10 s, un paso de recocido a 60 ° C por 1 min y un paso de extensión a 72 ° C por 3 min.Nota: El ciclo en que la fluorescencia alcanza el 25% de la máxima es el número de ciclos que se utilizarán para ampliar la biblioteca, como en paso 11.3. Amplificar las bibliotecas usando la mezcla de reacción en la tabla 5. Ejecutar reacciones de PCR utilizando una desnaturalización inicial a 98 ° C por 2 min y ciclos que consiste en un paso de desnaturalización a 98 ° C por 10 s, un paso de recocido a 60 ° C por 1 min y un paso de extensión a 72 ° C por 3 min. El número de ciclos de amplificación para cada biblioteca se determinó en el paso 13.3. Purificar bibliotecas amplificadas usando un kit de base de la columna volumen de elución baja. 14. secuenciación y análisis de datos de secuenciación Determinar las concentraciones de bibliotecas amplificadas usando un análisis fluorimétrico. Diluir las bibliotecas a la concentración adecuada de secuenciación (verifica con el servicio de secuenciación o base de su recomendación). Determinar la calidad de las bibliotecas utilizando una plataforma de análisis de ácidos nucleicos de microfluidos.Nota: El perfil del tamaño de la biblioteca debe reflejar que visto en el gel de la selección de tamaño de paso 13.2 y la concentración de la muestra determinada en este paso debe ser utilizada para la secuencia. Piscina indexadas las bibliotecas para obtener lecturas de al menos 3 millones (por lo menos 50 bp leer; único [1 X 50] o extremo apareado [2 X 50]) por muestra. Una biblioteca de alta calidad requiere por lo menos 1 millón asignado Lee9, pero habrá algunos desgaste durante la asignación. Por ejemplo, una plataforma de secuenciación que rinde aproximadamente 150 millones Lee por carril puede acomodar hasta 50 muestras en un solo carril. 15. Análisis de datos de la secuencia Demultiplexar los datos mediante el uso de secuencias de índice para asignar las lecturas a sus muestras apropiadas.Nota: Dependiendo de su conocimiento, los usuarios pueden realizar posteriores análisis computacionales de archivos sin procesar de la secuencia FASTA/FASTQ mediante interfaz de línea de comando básica o, alternativamente, el fácil de usar, basado en la web galaxia gráfica de usuario interfaz (GUI)16 . Ajuste de secuencias de adaptador y cualquier secuencia de cebo derivados incompleta RE digestión en el paso 12, por ejemplo, usando las herramientas de la rápido-X (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/). Mapa demultiplexan Lee al genoma apropiado de interés (por ej., UCSC mm10, hg19) utilizando el alineador de Burrows-Wheeler (BWA)17 u otro software de alineación resultantes en SAM los archivos de salida. Si es necesario, convertir archivos de SAM a BAM via samtools18 (véase paso 15.4). Utilice una tubería de análisis 4C-seq como Basic4Cseq19, 4 C-ker20, FourCSeq21fourSig22 para analizar los datos e identificar las interacciones.Nota: Se deben realizar análisis de datos y la evaluación de la calidad según el manual de referencia del paquete de software seleccionado. Paquetes de generan archivos de salida de cama excepto donde observado. Brevemente, Basic4CSeq19 utiliza un archivo de SAM entrada (paso 15,3) para visualizar las interacciones (txt, tiff, cama y archivos de salida de peluca) y evalúa la calidad de los datos basados en los criterios del van de Werken et al. 9 4 C-ker20 (entrada recortada FASTQ, paso 15.2) y FourCSeq21 (entrada BAM, paso 15.3) identificar interacciones diferencial entre condiciones. fourSig22 (entrado SAM) también identifica interacciones significativas y prioriza aquellos que es probable que sean reproducibles. Herramientas como la genómica reguladora enriquecimiento de anotaciones herramienta (gran)23o integración con conjuntos de datos de codificación pueden también usarse para predecir la función biológica de interacciones descubierto por 4 C-SS.

Representative Results

Queratinocitos humanos primarios fueron aislados de prepucio neonatal descartada 2 – 3, agrupados y culta en KSFM complementado con 30 μg/mL pituitaria bovina extracto, 0,26 ng/mL recombinante humana factor de crecimiento epidérmico y 0,09 mM cloruro de calcio (CaCl2 ) a 37 ° C, 5% dióxido de carbono. Las células se dividieron en dos frascos, y un matraz fue distinguido por la adición de CaCl2 a una concentración final de 1,2 mM para 72 h. 107 las…

Discussion

4C resultados tienen el potencial para revelar las interacciones de la cromatina que pueden identificar elementos reguladores desconocidos o genes de la blanco que son importantes en un contexto biológico específico^24,25,26. Sin embargo, obstáculos técnicos pueden limitar los datos obtenidos de estos experimentos. Sesgo PCR de amplificación excesiva de la plantilla en C 4 protocolos es probable. Este protocolo soluciona est…

Materials

HindIII	NEB	R0104S
CviQI	NEB	R0639S
DNA oligonucleotide primers	IDT		To be designed by the reader
50 mL conical centrifuge tubes	Fisher Scientific	06-443-19
1.7 mL microcentrifuge tubes	MidSci	AVSS1700
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher	14190-136
Formaldehyde, methanol free	Electron Microscopy Sciences	15710
Nutator	VWR	15172-203
Glycine	JT Baker	4059-00
Benchtop centrifuge
Refrigerated microcentrifuge
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	ED2SS
20% SDS solution	Sigma-Aldrich	05030
Trypan Blue	Thermo Fisher	15250061
Glass slides	Fisher Scientific	12-550-143
Cover slips	VWR	16004-094
Light microscope
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Shaking heat block
2 M Tris-HCl	Quality Biological	351-048-101
Proteinase K	NEB	P8107S
Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)	Sigma-Aldrich	P2069
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	M5661
20 mg/mL glycogen	Thermo Fisher	R0561
Ethanol	Fisher Scientific	04-355-223
Nuclease-free water	Fisher Scientific	MT-46-000-CM
qPCR cycler	Thermo Fisher	4453536
qPCR plates	Thermo Fisher	4309849
Thermocycler	Thermo Fisher	4375786
PCR strip tubes	MidSci	AVSST-FL
1 M Magnesium chloride	Quality Biological	351-033-721
Dithiothreotol	Sigma-Aldrich	43815
Adenosine triphosphate	Sigma-Aldrich	A2383
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Agarose	Sigma-Aldrich	A6013
RNase A	Thermo Fisher	EN0531
Qiaquick PCR purification kit	Qiagen	28104
MinElute PCR Purification kit	Qiagen	28004
Spectrophotometer
Expand Long Template PCR System	Sigma-Aldrich	11681834001
dNTP mix	Thermo Fisher	R0191
SYBR Green I	Sigma-Aldrich	S9430
ROX	BioRad	172-5858
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S5886
End-It DNA End-Repair Kit	Lucigen	ER0720
LigaFast Rapid DNA Ligation System	Promega	M8221
SYBR Safe	Thermo Fisher	S33102
Taq Polymerase	NEB	M0267S
UltraSieve Agarose	IBI Scientific	IB70054
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704