Caracterización dinámica de microbioma-citometría de flujo basado en flujos de trabajo de cultivos puros de las comunidades naturales

Summary

Análisis cytometric del flujo ha demostrado ser valioso para investigar cultivos puros y monitoreo de la dinámica de la comunidad microbiana. Presentamos tres flujos de trabajo integrales, de muestreo para análisis de datos, para cultivos puros y comunidades complejas en medio claro, así como en matrices difíciles, respectivamente.

Abstract

La investigación de cultivos puros y monitoreo de la dinámica de la comunidad microbiana es esenciales para entender y controlar los ecosistemas naturales y aplicaciones técnicas impulsadas por microorganismos. Próxima generación métodos de secuenciación se utilizan ampliamente para resolver microbiomes, pero son generalmente recursos y tiempo intensivo y entregar información sobre todo cualitativa. Análisis de microbioma cytometric del flujo no sufre de las desventajas y puede proporcionar la abundancia relativa de la subcomunidad y absoluto celular números en línea. Aunque no entrega información filogenética directa, puede mejorar la profundidad de análisis y resolución de métodos de secuenciación. En contraste con usos médicos en la investigación y ajustes de rutina, citometría de flujo es aún no ampliamente utilizada para análisis de microbioma. Información faltante en tuberías de análisis de datos y preparación de muestra puede crear una barrera de entrada para los investigadores retos microbioma análisis que a menudo aplicaciones de citometría de flujo manual. Aquí presentamos tres flujos de trabajo integrales para cultivos puros, comunidades complejas en claro las comunidades medianas y complejas en matrices difíciles, respectivamente. Describir los procedimientos de muestreo y fijación y optimizado tinción protocolos para los conjuntos de la muestra respectiva. Elaborar el análisis de citometría con una compleja investigación centrada y un aplicación enfocada Banco superior dispositivo, describir la célula clasificación procedimiento y proponer paquetes de análisis de datos. Además propone importantes controles experimentales y los flujos de trabajo presentados se aplican a los conjuntos de la muestra respectiva.

Introduction

Microorganismos desempeñan un papel vital en muchos aspectos del ser humano vivo. Son los principales impulsores bióticos de la carbón de planetas, nitrógeno, fósforo y azufre los ciclos¹y acto degradante^2,3 así como sintetizar⁴ biocatalizadores en varias industrias, tales como tratamiento de aguas residuales ⁵ o biotecnología⁶. Incluso constituyen el microbioma humano, que directamente influye en la salud y metabolismo^7,8. Por lo tanto, la información sobre la estructura, función y comportamiento dinámico de los microorganismos, en respuesta a su entorno inmediato, es necesaria si queremos comprender y manipular estos sistemas. Next generation sequencing (NGS) es la tecnología establecida para la resolución de estructura y función de microbioma⁹. Sin embargo, el análisis y evaluación de datos NGS no puede ceder información cuantitativa y es todavía costoso, desperdiciador de tiempo y de ninguna manera dispuesto a proporcionar resultados in situ dentro de corredores de rendimiento. Algunas bacterias Mostrar tiempos de generación por debajo de 1 h y causa cambia constantemente las estructuras comunitarias en determinados entornos¹⁰. Siguiendo esta dinámica, utilizando métodos de secuenciación excedería la capacidad financiera y personal de laboratorios más científicos.

Por el contrario, citometría de flujo puede proporcionar comunidad huellas similares a datos NGS, manteniendo una eficacia más alta de tiempo, mano de obra y costo. Aquí, presentamos técnicas de citometría de flujo capaces de seguir la dinámica microbiana de la comunidad en línea en el nivel unicelular. A diferencia de NGS, citometría de flujo no proporciona la afiliación filogenética o información sobre genes funcionales, pero ofrece a un número cuantitativo de células. Mediante citometría de flujo, las comunidades microbianas pueden resolverse en subcomunidades con distinta dispersión de la luz y las propiedades de fluorescencia (forward scatter (FSC) y lado scatter (SSC) proporcionan indicaciones de tamaño y granularidad, respectivamente). El enfoque presentado utiliza predominante células tamaño - y cantidad de ADN información relacionada que se asocian a ciertos tipos de células y Estados fisiológicos (crecimiento). El contenido de ADN se cuantificó usando el UV-excitable 4', tinte del 6-diamidino-2'-phenylindole (DAPI), que se une a las regiones ricas A T del ADN y puede incluso resolver diferentes niveles cromosómicos. Combinando la fluorescencia DAPI y FSC sub-comunidades más de 50 pueden ser distinguidos y monitoreados por cambiantes abundancias en el tiempo¹¹. Las variaciones de abundancia de subcomunidad pueden correlacionarse con cambios en el entorno micro ambiental, tales como pH y producto títulos¹², con parámetros globales, como el tiempo^13,14, o en caso de intestino o saliva microbiomes con ciertos tratamientos médicos¹⁵. Estas correlaciones revelan subcomunidades claves responsables de funciones particulares en la red metabólica de toda la comunidad. La subcomunidad clave puede entonces ser específicamente promovido suprimida mediante la alteración de los micro-ambientes circundantes u ordenados secuenciación posterior¹⁵ o proteómicos de investigación¹⁶.

Sin embargo, citometría de flujo de la comunidad microbiana no es todavía ampliamente establecido debido a un número bastante bajo de aparatos de citometría de flujo capaces de resolver correctamente las poblaciones de microbios o comunidades. Además, la falta de experiencia, comunidad análisis tuberías y evaluación efectiva de datos constituyen una barrera de entrada para los investigadores retos análisis de microbioma. Hemos establecido flujos de trabajo integrales para abordar estas cuestiones. Para ilustrar su aplicabilidad general, les presentamos en tres conjuntos de muestra ejemplar (archivo complementario 1-S1), es decir, yo) un cultivo puro (PC) para aplicaciones biotecnológicas cultivados en medios claramente definidos (Pseudomonas putida KT 2440 en nivel de glucosa), ii) una comunidad de laboratorio complejas en medio claro (comunidad de lodos activados (ASC) en agua residual sintética) y iii) una compleja comunidad de entornos naturales en una matriz densa (comunidad de biogás (AC) en ensilaje de maíz).

Varios factores influyen en la elección de protocolo para cada uno de estos conjuntos de la muestra. Congelación, renuncia a la utilización de productos químicos tóxicos pero se limita principalmente a entornos de laboratorio debido al uso de nitrógeno líquido para baño de descarga. La estabilización de formaldehído y etanol posterior fijación permite el muestreo a granel sin necesidad de preparación de la alícuota y ha demostrado para ser estable durante largos períodos. Sin embargo, ricos en proteínas las muestras como la saliva humana¹⁵ pueden ser problemáticas, porque flóculos de proteína, denaturized por el formaldehído pueden causar desfavorable señal a proporción de ruido. El secado de la muestra se llevará más tiempo (aproximadamente 1 h en total) de los procedimientos en esta comparación, pero se puede realizar en sitio sin productos químicos tóxicos. Produce pellets estables en tubos, que pueden ser fácilmente enviados sin precauciones peligro de enfriamiento o adicional. Además, un montón de métodos de fijación alternativos han sido propuesto¹¹. Aconsejamos fuertemente para poner a prueba la estabilidad resolución y fijación de los diferentes protocolos de introducción de un nuevo conjunto de muestra.

Utilizamos dos citómetros de flujo diferentes para analizar los conjuntos de: i) una investigación muy sofisticado y caro, centrado en el clasificador de células y ii) un aplicación enfocada Banco analizador superior que parece más apropiado para aplicación in situ⁵. El BC se midió con el analizador superior del Banco, mientras que el PC y el ASC se midieron con el clasificador de células. El análisis de la muestra ejemplar tres sistemas requieren procedimientos diferentes para reproducibilidad optimizado, muestra estabilidad y comodidad de flujo de trabajo. El siguiente protocolo especificará las secciones para los tres sistemas diferentes.

Protocol

1. muestreo y fijación

1. Cultivo puro: congelamiento de^15,17
   1. Tomar 2 mL de suspensión celular, centrifugar durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y 5.000 x g y descartar el sobrenadante.
      Nota: La suspensión de la célula muestreada se describe en la archivo adicional 1-S1.
   2. Resuspender las células en 1 mL de tampón fosfato salino (PBS; 6 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM NaH₂PO₄, 145 mM NaCl y bidestilada H₂O, pH 7,2) además contiene glicerol 15% (v/v) como agente crioprotectores.
   3. Incubar por 10 min en hielo y choque congelación en nitrógeno líquido para posterior almacenamiento a-80 ° C.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las muestras son estables durante al menos un mes.
2. Activa comunidad de lodo: estabilización de formaldehído + etanol fijación^5,10,18
   1. Tomar 4 mL de la suspensión celular, centrifugar durante 20 min a 15 ° C y x 3.200 g y descartar el sobrenadante.
      Nota: La suspensión de la célula muestreada se describe en la archivo adicional 1-S1.
   2. Añadir 4 mL de formaldehído al 2% en PBS e incubar 30 min a TA.
      1. Prepare 8% formaldehído solución de paraformaldehído al evitar la conservación metanol aditivo añadido al formaldehído en forma líquida. Agregar 4 g de paraformaldehído a 50 mL de PBS a 70 ° C. Añadir aproximadamente 125 μl de solución de NaOH de 10 M. Revolver hasta que el paraformaldehido ha disuelto totalmente y dejar luego enfriar a RT. ajustar el pH a 7.0 con aproximadamente 100 μl 37% HCl. congelación de la solución de formaldehído en alícuotas de 15 mL para almacenamiento. No use más de 10 días descongeladas alícuotas.
         PRECAUCIÓN: Formaldehído debe ser manejados y dispuestos con cuidado debido a sus propiedades tóxicas y mutagénicas. Utilice siempre guantes al manipularlo. Utilizar una campana de escape mientras que disuelve el paraformaldehido para prevenir la exposición a gases tóxicos.
   3. Centrifugar la muestra 10 min a 15 ° C y x 3.200 g y descartar el sobrenadante.
   4. Agite la muestra en 4 mL de etanol al 70% y almacenar a-20 ° C.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las muestras son estables durante al menos 2 meses. Dependiendo de las propiedades de la muestra, el paso de centrifugación en 1.2.1 puede realizarse también durante 10 min a 4 ° C para ahorrar tiempo.
3. Comunidad de biogás: secado
   1. Utilice una punta de pipeta de 1000 μl recortadas a muestra 200 μL de digestato viscoso en un tubo de 2 mL.
   2. Añadir 1.700 μl de tampón PBS y mezclar bien.
   3. Colocar los tubos en un baño de ultrasonidos a 35 kHz y 80 W de potencia de salida eficaz durante 1 minuto para disolver agregados de células grandes y separar las células se peguen restos de células de la planta.
   4. Homogeneizar la muestra y filtrar la muestra a través de un filtro de malla de 50 μL, dividir el filtrado en cuatro alícuotas de aproximadamente 400 μl.
      Nota: Preparación de alícuotas en este momento ofrece dos ventajas importantes. En primer lugar, pequeños volúmenes son más fácil y rápido desecar mecánicamente (centrífuga) y térmico (secado), pero muestreo de pequeños volúmenes de generalmente lodo biogás gruesa puede ser muy difícil. Muestras segundo, adicionales pueden utilizarse para celular posterior clasificación, medidas de seguridad o controles.
   5. Centrifugue las porciones dos veces durante 10 minutos a 10 ° C y 4.000 x g y descarte el sobrenadante totalmente ambas veces para mecánicamente desecar la muestra lo mejor posible.
   6. Secar las muestras en una centrifugadora de vacío caliente durante 40 minutos a 35 ° C, kPa aproximadamente-97 y 2.500 x g para crear pellets estables. Almacenar los pellets a 4 ° C en la oscuridad.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí. Las pastillas son estables durante al menos 6 meses.

2. coloración

Nota: Tinción DAPI ha demostrado para ofrecer parcelas de punto de alta resolución y por lo tanto es particularmente ventajoso cuando se analizan las comunidades. La concentración de DAPI en la solución de tinción debe ser optimizado para garantizar una intensidad de la fluorescencia de la puerta del celular bien por encima del nivel de ruido, pero por debajo de los granos. El óptimo depende de la opción de sensibilidad y grano del instrumento puede variar entre conjuntos de la muestra debido a contenido G/C de los microorganismos contenidos y generalmente debe analizarse para conjuntos de muestra recientemente introducido. Pruebas concentraciones entre DAPI de 0,24 μm y 1 μm DAPI se recomienda para la configuración presentada. Otros colorantes pueden utilizarse para aplicaciones específicas. El uso de un SYBR Green I protocolo de tinción se recomienda al celular absoluta precisión de conteo se priorice sobre la huellas dactilares de^6,de análisis (archivo complementario 1-S1)¹⁵. Incluye menos pasos de manipulación y centrifugación de muestra y es aplicable con las células fijas y vitales. El uso de células vitales reduce aún más las medidas de manejo de muestra por saltarse la fijación y por lo tanto requiere solamente una centrifugación para la cosecha de la célula. Esto reduce al mínimo la pérdida potencial de la célula y error de medición en consecuencia sistemática. El PBS, buffer de permeabilización y coloración de la solución utilizada durante todos los pasos siguientes deben filtrarse a través de filtros de jeringa de 0,2 μm para reducir la carga adicional de la partícula en la muestra. La tinción de una muestra que contiene Escherichia coli BL21 (DE3) como una norma biológica con cada piscina de muestra se recomienda.

1. Cultivo puro
   1. Descongelar las muestras, centrifugar durante 5 min a RT y 5.000 x g y descartar el sobrenadante.
   2. Resuspender el precipitado de células en PBS helado mediante pipeteo repetido y ajustar OD_700nm a 0.035 (ruta de acceso longitud_cubeta = 0,5 cm).
   3. Preparar las células para la tinción.
      1. Centrifugar 1 mL de suspensión celular ajustado durante 5 minutos a RT y 5.000 x g y descartar el sobrenadante.
      2. Resuspender las células en 1 mL de buffer de permeabilización que contiene ácido cítrico de 0,3 M y 4,1 mM Tween20 y mezclar bien.
      3. Incubar la muestra durante 10 min en hielo para crear permeables las membranas celulares para posterior tinción.
      4. Centrifugue la muestra durante 5 min a RT y 5.000 x g y descartar el sobrenadante.
   4. Añadir 1 mL de solución que contiene 0.68 μm DAPI en tampón de 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ (289 mM Na₂HPO₄, 128 mM NaH₂PO₄ con bidestilada H₂O, pH 7) la coloración, mezclar y Incubar durante al menos 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
      Nota: Ajuste preciso OD es crucial para garantizar mediciones comparables debido a la fluorescencia de DAPI varía con la densidad celular si la concentración de DAPI se mantiene constante. El sobrenadante debe eliminarse con cuidado debido a una pelotilla generalmente frágil para prevenir la pérdida de la célula.
      PRECAUCIÓN: Utilice y deseche DAPI con cuidado debido a sus propiedades mutagénicas.
2. Comunidad de lodos activados
   1. Homogeneizar la muestra fija y transferir 0.6 mL en un tubo de vidrio. Añadir 1,4 mL de PBS y someter a ultrasonidos durante 10 min a temperatura ambiente como se describe en el paso 1.3.3. Centrifugar la muestra 10 min a 4 ° C y 3.200 x g y eliminar el sobrenadante. Añadir 2 mL de PBS y mezclar bien. Someter a ultrasonidos durante 5 minutos.
   2. Ajustar el OD_700nm a 0.035 (ruta de acceso longitud_cubeta = 0,5 cm) con PBS.
   3. Preparar las células para la tinción.
      1. Centrifugar la muestra 10 min a 4 ° C y 3.200 x g y eliminar el sobrenadante.
      2. Resuspender las células en 1 mL de buffer de permeabilización que contiene ácido cítrico de 0,11 M y 4,1 mM Tween20 y mezclar bien.
      3. Incubar por 20 min a temperatura ambiente para crear permeables las membranas celulares para posterior tinción.
      4. Centrifugue la muestra otra vez por 10 min a 4 ° C y x 3.200 g y eliminar el sobrenadante.
   4. Añadir 2 mL de solución de tinción que contiene 0,68 μm DAPI y 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ almacenador intermediario, mezclar bien e incubar por lo menos 60 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
      Nota: Se recomienda el uso de tubos de vidrio, como ciertos microorganismos tienden a adherirse a las paredes del tubo de plástico y pueden perderse durante el proceso. Incubar durante la noche también es posible y generalmente simplifica los procedimientos de laboratorio.
      PRECAUCIÓN: DAPI debe ser manejados y dispuestos con cuidado debido a sus propiedades mutagénicas.
3. Comunidad de biogás
   1. Suspender el sedimento de células secas en PBS.
      1. Añadir 800 μl de PBS, homogeneizar y remojar la pastilla durante 15 minutos.
      2. Aspirar la fase líquida con una pipeta μL 1.000 y mover el sedimento empapado a la sección cilíndrica de pared del tubo con la punta de la pipeta. Debe quedar allí.
      3. Mueva la punta de la pipeta en un movimiento circular para el sedimento a lo largo de las paredes del tubo.
      4. Lavar la mezcla resultante de las paredes del tubo de suministro de la fase líquida de la punta de la pipeta a lo largo de la pared del tubo.
      5. Agite la suspensión aspirando y suspender la pipeta tres veces.
   2. Lavar la muestra con PBS dos veces.
      1. Centrifugar durante 5 min a 10 ° C y 4.000 x g y descartar el sobrenadante.
      2. Añadir 1.500 μl de PBS y mezclar bien.
      3. Repita los dos pasos anteriores una vez.
   3. Colocar los tubos en un baño de ultrasonidos durante 1 min como se describe en el paso 1.3.3 y, posteriormente, filtrar cada muestra a través de un filtro de malla de 50 μL en un tubo de vidrio individuales.
   4. Diluir 2 mL de la muestra a OD_700nm 0.035 (ruta de acceso longitud_cubeta = 0,5 cm) con PBS.
   5. Preparar las células para la tinción como se explica en el paso anterior 2.2.3.
   6. Añadir 2 mL de solución de tinción con DAPI de 0,24 μm y 417 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄ de tampón, mezclar bien e incubar durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad.
      PRECAUCIÓN: DAPI debe ser manejados y dispuestos con cuidado debido a sus propiedades mutagénicas.

3. la medida

Nota: Los conjuntos de ejemplares de la muestra se analizaron con dos citómetros de flujo diferentes. El PC y el ASC se analizaron con un clasificador de investigación más compleja, altamente ajustable y fácilmente personalizable, centrado en la célula. Para el análisis de PC, este dispositivo fue equipado con un láser set hasta como se describe en la anterior publicación¹⁶, en definitiva un azul (488 nm, 400 mW) y una radiación ultravioleta (334-364 nm, 100 mW) láser de ion argón. Para el análisis de la ASC, nuevos azul (488 nm, 400 mW) y ultravioleta (355 nanómetro, 150 mW) láseres de semiconductor se instalaron. En ambos casos, el láser azul inducida por el FSC (bandpass filtro 488 nm ± 5 nm, filtro de densidad neutra 1.9) y el SSC (bandpass filtro 488 nm ± 5 nm, filtro de densidad neutra 1.9, gatillo). Estas características ópticas son relacionadas con tamaño de celda y densidad celular, respectivamente. Los láseres UV excitaron la fluorescencia de DAPI (bandpass filtro de 450 nm ± 32.5 nm) para la cuantificación del contenido de ADN celular. El sistema neumático se ejecutó a 56 psi (barra 3.86) con la sobrepresión muestra a máximo 0,3 psi y 70 μm. Se registraron todos los parámetros como alturas de pico en lugar de áreas de pico para mejorar la resolución de la medición. El seguimiento a largo plazo de la comunidad de biogás se realizó con la cubeta de flujo menos compleja, base, analizador top Banco. Un láser de semiconductor ultravioleta (355 nm, 50 mW) fue utilizado para inducir el FSC (bandpass filtro 355 nm ± 5 nm) y SSC (bandpass filtro 355 nm ± 5 nm, gatillo) señales y excitar la fluorescencia de DAPI (bandpass filtro de 455 nm C). El agua utilizada para el búfer de vaina de ambos dispositivos es bidestilada y 0,1 μm filtrado. El PBS utilizado para dilución de la muestra deben filtrarse a través de filtros de jeringa de 0,2 μm para reducir el ruido de la partícula en las mediciones lo más posibles.

1. Pura cultura y comunidad de lodos activados
   1. Comenzar el instrumento, láser, ordenador y software y preparación para análisis de muestras.
      1. Encienda el láser y para que 15 minutos llegar a la temperatura de funcionamiento y asegurar la estabilidad de la viga.
      2. Llene el tanque de la vaina con 10 x buffer de la vaina (19 m m KH₂PO₄, 38 mM KCl, 166 mM Na₂HPO₄, 1,39 M de NaCl con bidestilada H₂O) diluido con agua destilada bi H₂O a 0.2 x solución de trabajo (para la clasificación de la célula: 0.5 x solución de trabajo).
      3. Cebe el sistema fluídico con 56 psi sobre la presión y el depósito de residuos con la aspiradora de 6 psi aproximadamente.
      4. Operar el equipo de mínimo 15 minutos en el modo de autolimpieza para enjuagar el puerto de la muestra, tubo y boquilla.
   2. Calibrar con cuentas estándar.
      1. Preparar las mezclas de grano para la calibración en el lineal (1 μm μm azul + 2 verde amarillo fluorescente) y logarítmica (0,5 μm y 1 μm azul fluorescente). Diluir la suspensión de grano de las suspensiones stock originales para alcanzar concentraciones iguales.
      2. Continuamente medir la mezcla de grano lineal y ajuste los picos del grano a una plantilla de calibración predefinidos mediante la manipulación de la boquilla posiciones óptica pre-calibrar el instrumento en el rango lineal del laser.
      3. Cambie a la gama logarítmica y medir continuamente la mezcla de grano logarítmica. Ajuste de los picos del grano a su plantilla de calibración preestablecida a la consonancia fina el hardware del instrumento. Hacer los ajustes finales a la posición de grano usando el ajuste de ganancia de los tubos de fotomultiplicador (PMTs).
      4. Compruebe la posición del ruido instrumental y posiblemente ajustar para adaptarse a la plantilla de calibración.
         Nota: Una plantilla de calibración fija la posición de los granos debe ser preparado antes de un proyecto de medición y no se puede cambiar (véase la archivo adicional 1-S4)! Ruido instrumental puede ser inducida por las partículas en la muestra o el ruido electrónico de la PMT y se registrarán siempre en algún grado. No es recomendable ocultar el ruido completamente por ganancia ajuste o diagrama de desplazamiento. La abundancia y la posición de los eventos de ruido pueden ser una valiosa fuente de información y por lo tanto deben estar contenidas en los datos en bruto. Muestras intensiva muy partícula podrían requerir el retiro subsecuente del ruido por razones de análisis de datos y trazar. Control de la calibración en intervalos regulares durante un día de medición para garantizar la estabilidad del instrumento y por lo tanto, comparabilidad de la muestra.
   3. Medir una muestra que contiene el biológico estándar como se describe en 2.1.4 (DAPI manchado Escherichia coli BL21 (DE3), muestreados y fija durante la fase estacionaria (16 h) según el protocolo ASC se describe en 1.2). Verifique la posición del pico en relación con su plantilla de calibración predefinidos (véase la archivo adicional 1-S5).
      Nota: La coloración rutinaria y la medición de la norma biológica con cada piscina de muestras también servirá como un control interno para el procedimiento de tinción. Si el dispositivo está calibrado con perlas y la norma biológica no ajusta su plantilla de calibración predefinidos, el procedimiento de tinción probablemente necesita repetirse.
   4. Adquisición de la muestra.
      1. Ejecute la solución de tinción durante 10 minutos enjuagar el puerto de la muestra y el tubo y asegurar la estabilidad de la fluorescencia de DAPI en muestras subsecuentes.
      2. Filtrar la muestra teñida con un filtro de malla de 50 μm antes de la medición para prevenir obstrucciones de la boquilla del citómetro o flujo capilar.
      3. Añadir la mezcla de grano logarítmica a la muestra para monitorear la estabilidad del instrumento y prever la posibilidad de una comprobación de calibración retrospectivo. Las muestras deben contener entre 1.000 y 2.500 eventos en cada una de las puertas de dos bolas.
      4. Crear una puerta de la celda en el software del instrumento durante las primeras medidas de prueba de un nuevo conjunto de muestra. Esta puerta debe contener las células manchadas y excluir el ruido y los granos.
      5. Mezcle las muestras y medir a una velocidad máxima de eventos de 3.000 s^-1 hasta 250.000 células (comunidades) o 50.000 (cultivos puros) se detectan en la puerta de la celda.
         Nota: Estos conteos son elegidos en base a la experiencia con los sistemas de la muestra. Pueden utilizarse diferentes números para cambiar de puesto el equilibrio entre la eficacia de la medida y la detección de la subcomunidad de baja abundancia en cualquier dirección.
         Solución de problemas: Cambios repentino intra-medición del grano y posición de la celda puede ser causada por las burbujas de aire atrapadas en la boquilla. Esto requiere la eliminación y limpieza de la boquilla y enjuague del sistema fluídico con tampón de vaina. El instrumento debe ser reajustado después de volver a montar la boquilla (comienzo con paso 3.1.2).
      6. Enjuague el instrumento completamente con el almacenador intermediario de la vaina antes de cierre y cambio de muestras.
2. Comunidad de biogás
   1. Puesta en marcha del instrumento, láser, Computadoras y software para prepararse para el análisis de la muestra.
      1. Enjuague por lo menos 6 mL de tampón de la vaina (bidestilada H₂O) a través de la tubería y el puerto de la muestra en un tubo Unido libremente utilizando la función "primer fluido vaina" del software del instrumento.
      2. Medir la bidestilada H₂O en 5 μl s^-1 para enjuagar el sistema fluídico hasta menos de 200 eventos s^-1 se detectan en el regular caudal de 0,5 μl s^-1.
   2. Calibrar el sistema.
      1. Preparar la mezcla de grano (0.5 μm y 1 μm azul fluorescente). Diluir la suspensión de cuentas de las soluciones stock originales para alcanzar concentraciones iguales.
      2. Continuamente medir la mezcla de grano en el rango de₄ registro y ajuste los picos del grano a su plantilla de calibración predefinidos mediante la manipulación de las posiciones flujo cubeta y láser ópticas. Hacer los ajustes finales a la posición del grano con el ajuste de ganancia de la PMT.
   3. Control de la calibración con el estándar biológico tal como se describe en el paso 3.1.3.
   4. Adquisición de la muestra.
      1. Diluir 400 μL de la muestra teñida en 1.600 μl de PBS, medir y monitorear el conteo de eventos para realizar una prueba de concentración.
         Nota: Las tasas de dilución ajustado pueden ser necesarias para otras fuentes de muestra. El número de eventos no debe exceder 1.200 eventos s^-1 en muestras ricas de partícula para evitar la pérdida de resolución en la dispersión hacia adelante (ejemplo negativo en archivo adicional 1-S2). Cultivos puros se pueden medir con hasta 2.000 eventos s^-1.
      2. Crear una puerta de la celda en el software del instrumento durante estas primeras medidas de prueba. Esta puerta debe contener las células manchadas y excluir ruido y granos.
      3. Diluir la muestra según los resultados de la prueba de concentración en máxima 1.200 eventos total s^-1 y añadir la mezcla de grano a la muestra para monitorear la estabilidad del instrumento y prever la posibilidad de una comprobación de calibración retrospectivo. Las muestras deben contener entre 1.000 y 2.500 eventos en cada una de las puertas de dos bolas.
      4. Mezclar y medir la muestra hasta 250.000 células (comunidades) o 50.000 (cultivos puros) se detectan en la puerta de la celda.
      5. Enjuague el instrumento con agua destilada bi H₂O antes de conmutación de muestras y parada.

4. célula clasificación

Nota: La célula clasificación procedimiento requiere adicional establecido y se realiza según protocolos publicados¹².

1. Puesta en marcha y calibrar el instrumento, como se describe en pasos 3.1.1-3.1.3, pero uso un 0,5 x solución de trabajo del buffer de vaina.
2. Establecer la frecuencia DD y DD amplitud al buscar la ruptura de la gotita.
3. Montar las placas de deflexión, cobrarles y decidir para el 2-4-manera o modo de ordenación.
4. Realizar la calibración de retardo de caída interna con 2 granos de color verde amarillo μm para definir el intervalo de tiempo que tarda una partícula o viajar desde el interrogatorio punto (láser hits celular) hasta la última gota a la corriente.
5. Clasificar 20 cuentas 6 veces en un portaobjetos de vidrio y cuenta con un microscopio para verificar la calibración de retardo de caída.
6. Preparar la clasificación plantilla de la puerta.
7. Uso el "modo único y una gota: alta pureza 99%" a un ritmo no superior a los 2.500 total eventos s^-1 para ordenar 500.000 células en máximo 4 puertas a la vez (modo de ordenación de 4 vías).
8. La cosecha de las células por centrifugación (20.000 x g, 6 ° C, 25 min.) y la congelación de la pelotilla a-20 ° C para la secuenciación y posterior aislamiento de ADN.
   Nota: Evitar clasificar las células en las puertas con menos del 5% abundancia relativa, como el tiempo de clasificación es inversamente proporcional a la abundancia relativa. Los pasos individuales se describen en detalle en el manual de clasificador de células. El número de células necesario es pesadamente dependiente en los casos de uso y protocolos de extracción. Numerosos métodos se han aplicado: ddPCR (1.000 células^17,19), ARNr 16S o secuenciación de amplicones mcrA (500.000 células^6,10,15) y proteómica (hasta 1.1 x 10⁷ células ^16,17). La célula clasificación será particularmente ventajosa cuando se combina con un enfoque de metagenómica debido a la baja diversidad en la subcomunidad ordenados.
   PRECAUCIÓN: No toque las placas de desviación durante el proceso de clasificación debido a altos voltajes.

5. Análisis de datos

Nota: La medición de cytometric rinde "citometría de flujo estándar".fcs ficheros con una estructura de datos generalmente uniforme. Sin embargo, citómetro diferentes fabricantes utilizan versiones ligeramente adaptadas e instrumentos más viejos podrían son anteriores a 2010 Introducción del FCS última 3.1 estándar. Esto puede conducir a la trama de punto problemas, que impiden la comparación directa de los resultados obtenidos con diferentes instrumentos de escalamiento. Sin embargo, los puntos de datos individuales siempre se almacenan en las líneas de una matriz, con la correspondiente dispersión y valores de intensidad de fluorescencia en las diferentes columnas. El microbioma presentado análisis tuberías utilizan el celular distintivo tamaño y contenido de ADN para describir subcomunidades microbianas. Estos parámetros están correlacionados con la intensidad de canales de fluorescencia FSC y DAPI (clasificador celular: FL-4, analizador: FL-1) y racimos de la subcomunidad al visualizar en dos dimensiones parcelas de fluorescencia FSC vs DAPI. Estas parcelas de punto permiten la interpretación y análisis de datos de citometría de flujo y se escalan generalmente logarítmica. Que de .fcs archivos utilizando las soluciones de software o de terceros propietarios citómetro se puede mostrar y son la base para el automatizado (citometría histograma imagen comparación, CHIC) y semiautomático (Cytometric Barcoding, CyBar) análisis de la comunidad.

1. Histograma de la citometría de imagen comparación
   Nota: El código, documentación detallada y un manual para este paquete están disponibles en http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html. También han sido publicados²⁰.
   1. Instalar y cargar el paquete de R, el directorio de trabajo que contiene los archivos de .fcs y una lista de archivos ejecutando:
      > fuente ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCHIC")
      > library(flowCHIC)
      > # Establezca el directorio de trabajo en la ruta donde se encuentran sus archivos de FCS
      > # Escriba la ruta de acceso en las citas
      > setwd("")
      > # Obtener una lista de los nombres de los archivos de FCS en el directorio de trabajo
      > archivos <-list.files(getwd(),full=TRUE,pattern="*.fcs")
      > # Obtener una lista de los nombres de los archivos de FCS incluidos en el paquete
      > archivos <-list.files(system.file("extdata",package="flowCHIC"),
      + full = TRUE, patrón = "*.fcs")
      > # Leer el primer archivo de FCS como flowFrame
      > marco < - leer. FCS(files[1],Alter.Names=true,Transformation=false)
      > # Obtener una lista de los nombres de parámetro/canal
      > unname(frame@parameters@data$name)
   2. Crear imágenes para los datos crudos de citometría mediante la ejecución de la función de paquete de "fcs_to_img":
      > # Crear las imágenes de histograma usando parámetros por defecto
      > fcs_to_img(files)
   3. Ejecutar la función de paquete de "img_sub" para definir subconjuntos de las imágenes de histograma:
      > # Crear el histograma subconjuntos de la imagen usando los parámetros por defecto
      > img_sub (archivos, ch1 = "FS. Log",CH2="FL.4.log")
   4. Calcular los valores de solapamiento y XOR para llevar a cabo el análisis de imágenes mediante la ejecución de la función de paquete de "calculate_overlaps_xor":
      > # Guardar los nombres de todas las imágenes subconjunto como una lista
      > subconjuntos <-list.files(path=paste(getwd(),"chic_subset",sep="/"),full=TRUE,pattern="*.png")
      > Calcular la superposición y las imágenes XOR y escribir valores en dos nuevos archivos
      > resultados <-calculate_overlaps_xor(subsets)
   5. Crear no métrico (NMDS) escala multidimensional parcelas para análisis de similitud por ejecutar la función de paquete de "plot_nmds":
      > # Mostrar una trama NMDS de las muestras
      > plot_nmds(results$overlap,results$xor)
2. El código de barras de citometría de
   Nota: El código, documentación detallada y un manual para este paquete están disponibles en http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/flowCyBar.html. También han sido publicados^11,12.
   1. Desarrollar una plantilla de la puerta principal para el uso en todas las muestras.
      1. Cargar los archivos .fcs en el software de análisis utilizando la funcionalidad arrastrar y soltar.
      2. Haga doble clic en una medición y elija los parámetros de ejes x e y de las listas desplegables correspondientes para abrir una parcela de fluorescencia FSC vs DAPI.
      3. Utilice el polígono herramienta de dibujo para reproducir la puerta de celda utilizada anteriormente para controlar el número de células analizadas en pasos 3.1.4.5 y 3.2.4.4 y por consiguiente el nombre. Arrastre la entrada de la puerta de la célula en la lista de muestra en el grupo de muestras todos a lo de la piscina.
      4. Haga doble clic en la puerta de la celda y corregir la asignación de eje para visualizar los eventos de puerta de la célula.
      5. Definir la subcomunidad en el conjunto de la muestra con la herramienta de puertas elípticas siguiendo las directrices publicadas¹² y utilizar el escaneo de la SSC u otro tercer parámetro²¹ para garantizar la integridad de la plantilla de la puerta. Piscina, controlar y ajustar la asignación de la subcomunidad en las otras muestras.
   2. Exportación de la abundancia relativa de la subcomunidad en un archivo .txt para uso en la escritura de R.
      1. Abra el editor de tabla con la ficha edición.
      2. Agregar columnas para cada subcomunidad que fue definido en el paso 5.2.1.5 y establecer la estadística de la salida a la "frecuencia del padre" y ponerles nombre.
      3. Crear la tabla en el "editor de tabla" después de elegir el formato y destino del ahorro.
         Nota: El software de análisis proporciona directamente la abundancia relativa de la subcomunidad. También puede obtenerse a través de la división de la cuenta del evento en la puerta de cada subcomunidad por la cuenta del evento en la puerta de la celda. Los valores tienen que ser guardados en una matriz delimitado en un archivo .txt que no puede contener ningún campo de n.a. y debe cumplir algunos requisitos adicionales para ser leído por el código de R (véase el manual y las preguntas frecuentes para obtener instrucciones específicas).
   3. Instalar y cargar el paquete de R y carga los datos mediante la ejecución de:
      > fuente ("https://bioconductor.org/biocLite.R")
      > biocLite("flowCyBar")
      > # Escriba la ruta de acceso en las citas
      > setwd("")
      > Conjunto de datos de carga #
      > data(Cell_number_sample)
      > # Mostrar datos
      > Cell_number_sample [, -1]
   4. Normalizar la abundancia relativa mediante la ejecución de la función "normalizar" de paquete:
      # Normalizar datos, impresión de 2 dígitos
      Normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
   5. Crear un código de barras de la normalizada y un boxplot de las abundancias originales mediante la ejecución de la función de paquete de "cybar_plot":
      Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      # Parcela con parámetros por defecto
      cybar_plot(Normalized_mean,Cell_number_sample[,-1])
   6. Crear una trama NMDS de la abundancia relativa original.
      > Normalized_mean <-normalize(Cell_number_sample[,-1],digits=2)
      > Normalized_mean <-data.frame (data.matrix (Normalized_mean))
      > Parcela NMDS de # de números normalizados cel
      > nmds(Normalized_mean)
   7. Crear el análisis de correlación de la abundancia relativa normalizada y otros parámetros mediante la ejecución de la función de paquete de "correlación":
      > Conjunto de datos de carga #
      > data(Corr_data_sample)
      > Valores de # mostrar correlación
      > Corr_data_sample [, -1]
      > # Ejecutar Análisis de correlación
      > correlation(Corr_data_sample[,-1])
      Nota: CHIC y CyBar confían en abundancias. Sin embargo, la citometría de flujo también puede determinar un número absoluto de células, que puede ser de gran interés para aplicaciones biotecnológicas. Para determinar el número de celda absoluta, el número de células en la puerta del interés se divide por el volumen de muestra analizada. El volumen de la muestra analizada puede determinarse mediante la adición de la suspensión de grano con una concentración conocida en la muestra (fórmula en la archivo adicional 1-S7). El analizador superior del Banco está equipado además con una función de conteo volumétrica verdadero que cuantifica directamente el volumen en el tubo de muestra durante la medición. Se aconseja utilizar un SYBR Green I protocolo para contar células de tinción.

Results

Los siguientes resultados representativos destacan la necesidad de repeticiones y ejemplifican técnicas de visualización y análisis de datos diferentes en cada uno de los tres tipos de muestra. Muestran los resultados de datos evaluación tuberías adecuado para responder a preguntas de investigación estándar sobre el respectivo conjunto. Sin embargo, las técnicas presentadas no son exclusivas para el conjunto de la muestra que se presentan con. Los datos brutos de la citometría de flujo se hizo disponibles públicamente con el ID FlowRepository FR-FCM-ZY46. Previamente datos cargados de la ASC están disponibles bajo ID FR-FCM-ZYD7.

Réplicas biológicas y técnicas fueron tomadas, preparados y analizados según protocolos publicados¹¹. Réplicas biológicas de la PC y ASC fueron tomadas de tres frascos paralelo. Réplicas biológicas de el BC se toman como tres muestreos subsecuentes en un lugar único en una planta a escala piloto. Tres alícuotas de una muestra se fija, manchados y se analizaron para asegurar la reproductibilidad técnica. Se evaluó la reproducibilidad de los métodos según los procedimientos previamente publicados en¹¹. Una plantilla de puerta para todas las muestras del conjunto de una muestra (archivo complementario 1-S6) se utilizó para el cálculo de la desviación estándar (%) por la puerta.

Para el PC, la máxima desviación estándar de la abundancia relativa fue 3.44%, mientras que la desviación estándar promedio fue del 2.13% (figura 1). Para el ASC y el BC, la máxima desviación estándar de la abundancia relativa fueron 1,27% y 0,88%, mientras que los promedios de las desviaciones estándar fueron 2.13% y 0.21% (archivo complementario 1-S8).

Un procedimiento estándar, al investigar una cultura de pura cepa, es la preparación de una curva de crecimiento para analizar la fase lag, tiempos de generación y densidad celular bajo condiciones específicas. Hemos combinado este procedimiento con el workflow de análisis citometría de flujo para lograr una comprensión más profunda del sistema (figura 2). El FSC vs DAPI fluorescencia parcelas revelan los Estados del ciclo celular de la cultura en diferentes puntos de la cultura de la hornada. Una plantilla de la puerta principal (archivo complementario 1-S6) fue establecida para cuantificar la proporción de células con uno (c1n), dos (c2n) y cromosomas múltiples (cXn, figura 2B). La proporción predominante de células inoculadas tenía sólo un cromosoma (93.7% en 0 h). Esto cambió drásticamente durante el crecimiento exponencial, donde casi todas las células figuran más de una (99,6%, 4 h) y más de la mitad de la población (53,1%) incluso más de dos cromosomas. Esto muestra la capacidad de s de p. putidapara replicar sus cromosomas más rápidamente que su tiempo de generación.

Análisis cytometric del flujo ha demostrado ser muy útil para monitorear la evolución de las comunidades microbianas. Puede seguir la dinámica comunitaria mucho más cerca que el recurso más intensivo métodos moleculares^5,10. Destacó estas dinámicas en una película y obtuvo una visión general de los cambios de la comunidad de lodos activados con el tiempo. Cada segundo el marco muestra una parcela de fluorescencia FSC vs DAPI de un punto de muestra (archivo adicional 2). Un cambio muy distinto entre el día 0 y día 4 fue seguido por el establecimiento de una comunidad de base después de día 7. Subcomunidad adicional ocurrió en el día 21. Hemos establecido una plantilla de la puerta principal (archivo complementario 1-S6) que permitió la evaluación de la dinámica microbiana a nivel de subcomunidad. La subcomunidad dominante en las diferentes etapas del experimento fueron identificados claramente con la herramienta de CyBar (figura 3). Combinación con la distribución de frecuencia de la abundancia relativa de la subcomunidad ayudó a seleccionar puertas que son interesantes (cambios significativos en la abundancia activado en un momento clave) y viable (sobre la abundancia relativa de 5%) para la clasificación y más Análisis²².

Aplicaciones del biorreactor a escala industrial pueden enfrentar posibles heterogeneidades espaciales debido a las limitaciones de la agitación. También con frecuencia están expuestos a los cambios de parámetros de funcionamiento, como alteraciones en la calidad de los sustratos no sintético. El AC representa un sistema y se tomaron muestras de diferentes localidades de un reactor de flujo tapón dinámicamente impulsado. Parcelas de fluorescencia de la FSC vs DAPI (figura 4) de los puntos de muestra ejemplar muestran heterogeneidad temporal sólo poco espacial, pero pronunciado. El BC fue investigada más a fondo con ambos, el CHIC rápido automatizado y la plantilla de la puerta principal más profunda CyBar enfoque basado en.

Su naturaleza automatizada, rápida e imparcial, hace el CHIC especialmente interesante para el control in situ de bioprocesos en un entorno industrial. Compara datos raw .fcs de todas las muestras disponibles. Dos de estas comparaciones se muestran en la figura 5. Los valores de disimilitud obtenidos confirman las observaciones anteriores sobre la heterogeneidad espacial y temporal. El NMDS parcelas generadas forma la matriz de disimilitud de herramientas CHIC (figura 6) más fundamenta este resultado y visualiza en consecuencia.

Además, se calculó la abundancia relativa de 23 subcomunidades de el BC con una plantilla de la puerta principal (archivo complementario 1-S6). Se realizó un análisis de correlación de 48 muestras de un período de un año para comprender las relaciones funcionales en la comunidad microbiana. Esto puede ayudar a identificar puertas de interés para la posterior investigación (4 clasificación de la célula). Fuerte correlación positiva o negativa con parámetros abióticos como producto títulos pueden ayudar a comprender y optimizar los ecosistemas y procesos biotecnológicos. La tasa de carga orgánica en esta correlación (figura 7) es un ejemplo de tal un parámetro abiótico. G5 y G4, G10 exhiben fuertes correlaciones positivas y podrían posiblemente contener especie fermentativa, mientras que la correlación negativa en el G8 podría apuntar hacia archaea metanogénicas.

Figura 1: reproducibilidad de los análisis de citometría de la pura cultura. Fluorescencia de FSC vs DAPI parcelas con cuentas de control (A, B) y parcelas de la abundancia de la subcomunidad de 3 [%] con barras de error que representa ± una desviación estándar (C, D). La abundancia relativa se determinó con la plantilla de la puerta que se muestra en la archivo adicional 1-S6. Tres réplicas biológicas A, B y C fueron tomadas de la curva de crecimiento en 4 h y tres repeticiones técnicas P1, P2, P3 se prepararon de la muestra A y tres veces, respectivamente: M1, M2, M3 y con sus respectivas desviaciones estándar. se registraron 50.000 eventos en la puerta de la celda. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: análisis del ciclo de la célula de la cultura pura en una curva de crecimiento experimento sobre 12 h. (A). Fluorescencia de FSC vs DAPI parcelas de las muestras cada dos horas que exhiben un cambio del contenido de ADN durante la fase de crecimiento exponencial. Esta serie de medición no incluye granos (véase la archivo adicional 1-S3). (B). curva de crecimiento basado en la densidad óptica con barras de error que representa una desviación estándar de ± y abundancia relativa en la subcomunidad con el tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: evolución de la estructura de la comunidad de lodo activado durante 24 días. (A) el flowCyBar con superposición de distribuciones de frecuencia visualizadas en boxplots para las puertas individuales que son arregladas por la similitud de las tendencias, el correspondiente color clave (B) y un análisis de semejanza en un ingenio de la trama NMDS R < (0.001 C). las parcelas subyacentes aparecen en la secuencia de la película en archivo adicional 2. Abundancia relativa se determinó utilizando la plantilla de la puerta en la archivo adicional 1 - S6. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: reactor de biogás del flujo del enchufe heterogeneidad espacial y temporal de la estructura de la comunidad microbiana en escala industrial. Muestreo (A) la comparación de la estructura de la comunidad microbiana de los cuatro puertos I-IV día 223. (B) la comparación de las variaciones de estructura comunidad dependiente de tiempo desde el día 0 a día 384 puerto II. El ruido ha sido cortado tardíamente para mejorar la visualización. 250.000 eventos fueron medidos en la puerta de la celda (archivo complementario 1-S6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: histograma de la citometría de imagen comparación — elegante. El principio del algoritmo CHIC se ejemplifica mediante la comparación de dos muestras que representan la heterogeneidad espacial y temporal, respectivamente. (i) imágenes CHIC se crean de los archivos de .fcs después de seleccionar dos parámetros para mostrar (fluorescencia de FSC vs DAPI). La escala de grises (0 – 255) los códigos de la cuenta del evento en un píxel. (ii) CHIC subconjuntos se generan después de especificar el área que contiene las células (aquí: 200 < x < 4000, 200 < y < 2200). (iii) imagen de combinación XOR se crea mediante la comparación de píxeles entre los subconjuntos. Ninguna diferencia es igual a 0 y se muestra como negro. Diferencia máxima igual a 200 y se muestra como blanco. El valor correspondiente de la XOR se calcula agregando los valores de escala de grises de todos los píxeles de la imagen de la XOR. (iv) recubrimiento combinación imagen se crea mediante la adición de los valores de escala de grises de los píxeles de los subconjuntos. El valor de recubrimiento correspondiente se calcula contando los píxeles de una imagen de superposición que no igual a cero y por lo tanto contienen información. (v) valores de disimilitud se calculan dividiendo valores XOR y superposición. Estas son la base para la trama de la NMDS en la figura 6. Tanto los valores de disimilitud y la demostración de parcela NMDS un insignificante espacial- y una comunidad temporal pronunciada heterogeneidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: CHIC basado en análisis de similitud de las muestras de biogás comunidad. La muestra de 0-day fue excluida de este terreno debido a su estructura extremadamente distintas comunidades que distorsionan el análisis (archivo complementario 1-S11). La trama de la NMDS confirma la suposición bajo espacial- y la mayor heterogeneidad temporal utilizando la herramienta elegante y explicado en la figura 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Análisis de correlación en la comunidad de biogás. La matriz se calculó con el coeficiente de orden de rango de Spearman y se basa en la abundancia relativa de 23 subcomunidades que se determinaron con la plantilla de la puerta principal en la archivo adicional 1-S6. Fueron correlacionados con la tasa de carga orgánica (OLR) para 48 muestras de un período de un año. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Análisis de similitud de planctónicos (P) y fango basado en comunidades (S) en aguas residuales. Se tomaron muestras de la cuenca de lodos del clarificador primario (LCP), activado (AS) y tanque digestor (DT) de una planta de tratamiento de aguas residuales a gran escala (punto parcelas en archivo adicional 1-S10). Abundancia relativa se determinó utilizando la plantilla de la puerta que se muestra en la archivo adicional 1-S6. También se analizaron estas abundancias de subcomunidad con la herramienta flowCyBar para crear un CyBar (archivo complementario 1-S10) y NMDS parcela (R < 0,01). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: estabilidad de la fijación de la pura cultura. Las muestras del experimento de la curva de crecimiento en 0 h fueron almacenadas durante 28 días a-80 ° C después de la fijación en glicerol al 15%. Fluorescencia de FSC vs DAPI parcelas con control aparecen granos. Serie de medición no incluye granos (archivo complementario 1-S3). se registraron 50.000 eventos en la puerta de la celda (archivo complementario 1-S6). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Un acertado análisis de poblaciones microbianas y comunidades requiere citómetros bien afinado, una adecuada selección de los parámetros de la célula y un confiable flujo de trabajo de muestreo y fijación hacia la evaluación medición y datos. Los parámetros de la celda seleccionada deben asociarse con las longitudes de onda de excitación disponibles. Utilizamos y recomendamos DAPI, que es muy sensible a bajas concentraciones; pero deben ser excitados por un láser UV, que generalmente no se compone en configuraciones estándar citómetro. Otros tintes, como el SYBR Green, también mancha toda las poblaciones o comunidades pero generalmente entregan resoluciones inferiores. No recomendamos usar pescado procedimientos o pruebas de viabilidad en las comunidades microbianas. Estos enfoques son imposibles de cuantificar, verificar y controlar porque sus efectos sobre especies individuales en la comunidad es incierto. No puede ser confiablemente probaron, como una parte sustancial de las comunidades típicas todavía no está disponible como un cultivo puro.

Pasos críticos en el protocolo incluyen procedimientos de muestreo y fijación, así como la clasificación celular. El muestreo puede ser complicado por la tendencia de ciertos cultivos puros y comunidades microbianas a agregado en flóculos o se adhieren a las partículas de la matriz de la muestra. Es esencial para disipar estos agregados y separar las células en una muestra antes de la introducción al análisis de citometría de flujo para garantizar resultados confiables. Los protocolos de preparación presentado fueron optimizados para permitir análisis unicelular. Se realiza una filtración final 50 μm antes de la medición para eliminar cualquier agregados residual y prevenir la boquilla μm 70 del clasificador de la célula y la cubeta de flujo del analizador de obstrucción. Flóculos de célula de plantas de tratamiento de aguas residuales son especialmente abundante, robusto y vital para el funcionamiento del sistema. Investigamos los planctónicos y lodos basado en las comunidades microbianas en diferentes tanques de una planta de tratamiento de aguas residuales a gran escala para probar el protocolo establecido. El lodo formando agregados fueron disipados claramente de la célula y la composición de la comunidad se mantuvieron estables. Además, las comunidades planctónicas y de lodos exhibieron notables similitudes entre ellas en los tres tanques muestreados (figura 8, archivo complementario 1-S10). Estos resultados fueron verificados por comparativa 16S rDNA amplicon secuenciación de un fresco, un formaldehído tratadas-, fijación un formaldehído y etanol-y una muestra ordenada¹⁰. Sin embargo, extraordinariamente desafiante muestras ambientales, como biofilms fuertes o las bacterias crecen en cadenas firmemente conectadas, puede ser imposible de disipar. Muestras de suelo pueden ser particularmente problemáticas, mismo las partículas omnipresentes en el histograma y pueden obscurecer las células por pura abundancia. En tales casos, los métodos tradicionales de secuenciación deban aplicarse.

La estabilidad de la fijación de cada nuevo conjunto de muestra debe analizarse antes de diseñar el experimento para garantizar la validez del resultado. Estabilidad de buena fijación también permite el combinado manchas y medición de varios puntos de tiempo de la muestra en un solo día. Además permite mediciones de replicación y retrospectiva de la célula clasificación de momentos decisivos después de la conclusión y evaluación final del experimento. La estabilidad de la fijación de la cultura pura se verificó durante 28 días (figura 9). Para los experimentos in situ incluyendo el transporte de la muestra, la estabilidad de la fijación debe ser probada durante períodos más prolongados (en este caso, de 60 días para la comunidad de lodos activados, 195 días para la comunidad de biogás, archivo complementario 1-S9).

La tinción no suele ser problemática pero debe controlarse con un biológico estándar para permitir la aplicación de las herramientas de evaluación de la bioinformática. Se utilizó la cepa simulacro e. coli BL21 (DE3), que fue determinada según el protocolo ASC y almacenadas para su uso en cada lote de tinción.

Aparte de DAPI, SYBR Green se ha aplicado con éxito para resolver las comunidades microbianas para varios años^{14,23,24,25,26}. SYBR Green puedo resolver comunidades en subconjuntos de alta y baja de ácido nucleico (HNA y LNA) utilizando células vivas en un modo en línea. DAPI, sin embargo, es más específico en su unión al ADN y permite la distinción de más de 50 subcomunidades en conjunto una muestra pero requiere un paso de fijación antes de la tinción.

Clasificación de células es una característica destacada de este enfoque y se puede aplicar si ciertas subcomunidades son de más interés. Hay que destacar que ni PFA-(realizado por sólo 30 min) ni tratamiento de etanol o DAPI tinción¹⁰ tuvo un efecto negativo en la secuenciación de amplicones de 16S posterior. Influencias del potencial de la fijación y procedimientos el metagenoma de la subcomunidad de tinción análisis aún deben ser probados.

Mucha información sobre las funciones de la comunidad y dinámica de la tendencia puede obtenerse independiente del enfoque de clasificación cuando involucrando herramientas bioinformáticas que resolución características de la comunidad a nivel de celda por celda virtual y conectan estas características abióticas parámetros.

Recientemente, una serie de nuevas herramientas bioinformáticas evaluación, todos los útiles para ambos el SYBR verde I y los enfoques de la DAPI, se han desarrollado para resolver patrones de comunidad de citometría. Se trata de FlowFP²⁷, los paquetes utilizan en este estudio (flowCHIC²⁰, flowCyBar²⁸), un modelo de deconvolución establecido con las comunidades de agua dulce²⁹ y una herramienta utilizada para diferenciar cepas según su fisiológico características³⁰. Además, cytometric diversidad puede ser determinado²⁵ y estabilidad incluso propiedades de las comunidades microbianas pueden seguirse ahora con una herramienta en línea¹⁰.

Así, los análisis de citometría de flujo tienen una gran ventaja cuando se trata de la evaluación rápida de las comunidades microbianas y correlaciones posibles parámetros abióticos. Sin embargo, todavía existen limitaciones al método. No se puede aplicar verdaderamente en línea con la herramienta de flowCyBar, debido al procedimiento de ajuste de puerta basado en experiencia. Además, el desarrollo de los citómetros de flujo a la medida, fácil de usar avanzaría grandemente la proliferación del enfoque de análisis de microbioma de citometría de flujo. Primeros pasos en esta dirección son realizados²⁸.

Futuras aplicaciones de la citometría de flujo microbiano pueden ser visualizadas en ecología microbiana, ya que permite un monitoreo de alta frecuencia dentro del rango de tiempo de generación bacteriana y se ha demostrado que paradigmas ecológicos son aplicables a los datos de citometría^{5 ,10}. El método es muy útil para exámenes de rutina de los ambientes naturales como los controles obligatorios de agua potable en Suiza³¹. También puede ser una valiosa herramienta para los usos médicos como animal³² proyección de microbioma humano¹⁵ . Además, los últimos avances en Bioinformática pueden permitir citometría de flujo microbiano que un sensor integral en los controles de proceso de sistemas microbianos gestionados. Comunidad microbiana citometría también proporciona una herramienta de detección para la clasificación de la célula, que permite mayor resolución investigaciones Genómicas de subconjuntos específicos de la comunidad.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sistema Milli-Q Synthesis A10	Merck, Darmstadt, (GER)
BioPak Cartucho de ultrafiltración	Merck, Darmstadt, (GER)	CDUF BI0 01
Clasificador de células MoFlo Legacy	Beckman-Coulter, Brea, California (EE. UU.)
Innova 90C	Coherent, Inc , Santa Clara (EE. UU.)		334 nm - 364 nm, 100 mW
Innova 70C	Coherent, Inc , Santa Clara (EE.UU.)		488 nm, 400 mW
Genesis MX488-500 STM OPS	Coherent, Inc , Santa Clara (EE.UU.)		488 nm, 400 mW
Xcyte CY-355-150	Lumentum, Milpitas, California, EE.UU		355 nm, 150 mW
Tubos fotomultiplicadores R928 y R3896	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japón)
Software	Summit 4.3Beckman-Coulter, Brea, California (EE.UU.)
1 y micro; m  Sondas moleculares FluoSpheres	, Eugene, Oregón (EE. UU.)	F8815	350/440 azul fluorescente
2 μ m YG FluoSpheres Sondas moleculares	, Eugene, Oregón (EE. UU.)	F-8827	505/515 perlas fluorescentes amarillo-verde
0,5 μ m Microesferas de carboxilato BB de fluoresbrite	PolyScience, Niles, Illinois (EE. UU.)	18339	360/407
1 μ m Fluoresbrite BB Microesferas de carboxilato PolyScience	, Niles, Illinois (EE. UU.)	17458	360/407 azul fluorescente
1 &; mYG FluoSpheres	Molecular Probes, Eugene, Oregon (USA)	F-13081	505/515 perlas fluorescentes amarillo-verde
KH2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (EE. UU.)	CAS n.º 7778-77-0
KCl	Sigma-Aldrich, St. Louis (EE.UU.)	CAS n.º 7447-40-7
Cyflow Space	Sysmex Corporation, Kobe (Japón)
UV Laser Genesis CX,Coherent	, Inc , Santa Clara (EE. UU.)		355 nm, 150 mW
H6779-32 series PMT	Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City (Japón)
FloMax software	Sysmex Partec GmbH, Gö rlitz, (GER)
todos los filtros ópticos	Carl Zeiss, Jena (GER)
2PO4	Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)	CAS no. 7778-77-0
KCl	Carl Roth, Karlsruhe (GER)	6781.3
FlowJo 10.0.8r1	FlowJo, LLC, Ashland, Oregon (USA)		Número de compilación: 42398
R-software v.3.4.3	R Core Team
flowCHIC	a href="http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html">http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/flowCHIC.html
flowCyBar	http://www.bioconductor.org/packages/devel/ bioc/html/flowCyBar.html