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Artículo de método

Aplicaciones en bloque del ganglio simpático Cervical inducido por etanol para promover la regeneración del nervio Alveolar Inferior canino utilizando un nervio Artificial

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DOI:

10.3791/58039

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30 de noviembre de 2018

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1Department of Dental Anesthesia, Nippon Dental University Hospital at Tokyo, 2Department of Dental Anesthesiology, Nippon Dental University School of Life Dentistry at Tokyo, 3Department of Bioartificial Organs, Institute for Frontier Medical Science, Kyoto University

En este artículo

Resumen

Se evaluó el efecto de bloque del ganglio simpático cervical en la reparación del nervio mediante conductos artificiales nerviosas. Perros beagle macho fueron cada uno implantados con un nervio artificial a través de un hueco de 10 mm en el nervio alveolar inferior izquierdo; ganglio simpático cervical izquierdo fue bloqueado inyectando etanol al 99.5% vía toracotomía lateral.

Resumen

Poliglicólico colágeno ácido (PGA-C) los tubos son bio-absorbible del nervio con colágeno de estructura multi-cámara, que consisten en películas delgadas de colágeno. Se han logrado resultados clínicos favorables al utilizar estos tubos para el tratamiento del nervio alveolar inferior dañado (IAN). Un factor crítico para la regeneración de nervio éxito usando tubos de PGA-C es el suministro de sangre a los tejidos circundantes. Bloqueo de ganglio simpático cervical (CSGB) crea un bloqueo simpático en la región de cabeza y cuello aumentando el flujo sanguíneo en la zona. Para asegurar un efecto adecuado, el bloqueo debe ser administrado con anestésicos locales una o dos veces al día durante varias semanas consecutivas; Esto plantea un desafío al crear modelos animales para la investigación de esta técnica. Para solucionar esta limitación, hemos desarrollado un CSGB etanol-inducida en un modelo canino de aumento a largo plazo en el flujo sanguíneo en la región orofacial. Se examinó si la regeneración IAN mediante implantación de tubo de PGA-C puede ser mejorada por este modelo. Cada uno de los catorce Beagles fueron implantados con un tubo de PGA-C a través de un hueco de 10 mm en el izquierdo IAN. El IAN está situado en el canal de la mandíbula rodeado de hueso, por lo tanto elegimos cirugía piezoeléctrica, que consiste en ondas de ultrasonido, para el procesamiento de hueso, con el fin de minimizar el riesgo de lesión del nervio y los vasos. Se obtuvo un buen resultado quirúrgico con este enfoque. Una semana después de la cirugía, siete de estos perros fueron sometidos a CSGB izquierdo por la inyección de etanol. CSGB inducida por etanol dio lugar a la regeneración del nervio mejora, sugiriendo que el aumento del flujo sanguíneo efectivamente promueve la regeneración del nervio en defectos de IAN. Este modelo canino puede contribuir a la investigación adicional sobre los efectos a largo plazo de CSGB.

Introducción

En muchos casos, lesión traumática del nervio alveolar inferior (IAN) es iatrogénica, siendo causada por la extracción del tercer molar o la colocación de implantes dentales1,2,3. Lesión del IAN puede conducir a déficits en térmica y táctil sensaciones como parestesia, disestesia, hipoestesia y alodinia. Lesión del nervio se trata no sólo de terapia conservadora, sino también por otros métodos, incluyendo la sutura y colocación de autoinjerto. Sin embargo, estos métodos tienen inconvenientes, que a menudo incluyen la falta de mejoría de los síntomas y defectos neurológicos en el sitio donante4,5,6.

El nervio artificial — tubo de poliglicólico (PGA-C) ácido del colágeno fue desarrollado originalmente en Japón. Es un bio-absorbible tubo con su luz interior llenado de un colágeno espongiforme del7. En experimentos con animales, este tubo se utilizó para realzar la regeneración del nervio en perros beagle con defecto del nervio peroneo y fue demostrado para promover mayor nivel de recuperación que nervio autólogo trasplante8. La aplicación clínica de la PGA-C tubo comenzó en 2002 en pacientes con lesiones de nervio periférico. Por otra parte, se han logrado resultados clínicos favorables en el tratamiento de la neuropatía del trigeminal (IAN y nervio lingual)9,10,11. Un factor crítico para la regeneración de nervio éxito usando tubos de PGA-C es el suministro de sangre a los tejidos circundantes8. Bloqueo de ganglio simpático cervical (CSGB) crea un bloqueo simpático en la región de cabeza y cuello y aumenta el flujo sanguíneo a la zona inervada respectivos12; así, se ha utilizado en el tratamiento del síndrome de dolor regional complejo e insuficiencia circulatoria13,14,15. Sin embargo, han sido sólo algunas investigaciones experimentales sobre la eficacia de CSGB en cada vez mayor flujo de sangre16,17. Para asegurar la adecuada eficiencia CSGB, el bloqueo debe aplicarse junto con anestésicos locales una vez o dos veces al día durante varias semanas, así planteando un desafío al generar modelos animales para investigar esta técnica. Para hacer frente a esta limitación, en un estudio anterior, se desarrolló un modelo canino de flujo de sangre creciente a largo plazo en la región orofacial del18. Se generó el modelo realizando una CSGB inyectando etanol al 99.5%. Se evaluaron el flujo sanguíneo mucosa oral y la temperatura de la piel nasal por flujometría Doppler láser y termografía infrarroja una vez por semana durante 12 semanas. Se encontró que el flujo sanguíneo de la región orofacial se aumentó de 7 a 10 semanas en este modelo.

En el presente estudio, evaluaron los efectos de CSGB inducida por etanol en la regeneración del nervio.
El tubo de PGA-C fue implantado en perros beagle a través de un hueco de 10 mm en el izquierdo IAN. Una semana más tarde, CSGB fue realizada mediante la inyección de etanol. Tres meses después de la cirugía, realizamos una variedad de estudios electrofisiológicas, histológicas y morfológicas para evaluar los efectos de CSGB en la regeneración del nervio. Proporcionamos un protocolo detallado para reconstrucción de IAN usando un tubo de PGA-C y CSGB inducida por etanol.

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Protocolo

Este estudio fue realizado de conformidad con los principios rectores para el cuidado y uso de animales y aprobado por el Comité para la investigación Animal de la Universidad de Kyoto (Kioto, Japón; número de autorización de: R-16-16). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento de los animales, y todas las secciones de este informe se adhieren a la llegada (investigación Animal: presentación de informes de experimentos in Vivo ) directrices.

1. fabricación del tubo de PGA-C

  1. Para fabricar el conducto del nervio artificial mediante un tubo de (PGA) ácido poliglicólico absorbible, utilizar una máquina de trenzado tubular equipada con 48 husos y cinco fibras de PGA, compuesto por haces de 26 filamentos (figura 1)18.
  2. Para representar la superficie del tubo PGA hidrofílico, exponerlo a la descarga de plasma.
  3. Utilice 1% v/w atelocollagen clorhidrato solución7.
    Nota: Atelocollagen es extraído de piel porcina mediante tratamiento enzimático y sometido a una comprobación de virus. Principalmente consta de tipo I (70 – 80%) y el tipo colágeno de III, la relación se describe en detalle en otra parte7. Preparar la solución de colágeno mediante la disolución de colágeno 1 g en 100 mL de solución de clorhidrato (pH = 3.0). Puesto que la densidad de la solución de clorhidrato es aproximadamente 1.0, la concentración de colágeno w/w es casi el 1%.
  4. El tubo con las capas de colágeno de la capa sumergiendo repetidamente en la solución de clorhidrato de colágeno 1% para 5 s cada vez.
    1. Después del baño, secar el tubo en un banco limpio a temperatura ambiente. Realizar la siguiente inmersión después de asegurar que el tubo esté completamente secado (alrededor de 6 horas para el secado al aire).
    2. Repita el proceso 10 veces.
  5. Sujeta el tubo de PGA-C a 140 ° C durante 24 h. bajo vacío (tratamiento dehydrothermal), para controlar la bio-absorción y reticulación de las moléculas de colágeno. Realizar todo el proceso bajo condiciones asépticas.
    Nota: Este procedimiento genera un tubo de longitud final de 14 mm, 3 mm de diámetro interno y 50 μm de espesor de pared.

2. intervención puesta en marcha

  1. Uso adulto macho beagles 9.0 a 13.0 kg de peso.
    1. Animales en jaulas separadas, bajo condiciones de criadero controlado (ciclo de 12 h luz y oscuridad) en casa.
    2. Proporcionar el alimento sólido y agua ad libitum.
  2. Pesan los beagles.
  3. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos.
  4. Don guantes esterilizados y desinfectar todas las superficies de la configuración de operación con una solución de etanol al 80%. Desechar los guantes usados.
  5. Realizar lavado de manos quirúrgico.
  6. Colóquese una mascarilla fresca, bata y guantes estériles.

3. anestesia y preparación de la piel

  1. Anestesiar al perro con una mezcla de clorhidrato de 5 mg/kg ketamina y xilacina de 1 mg/kg por una inyección intramuscular.
  2. Intubación por un tubo endotraqueal de 7,5 mm de diámetro y 25 cm de longitud.
  3. Colocar el perro en la posición de lateral derecho. Mantener anestesia general con sevoflurano de 3.2% con oxígeno (1,0 L/min).
  4. Use una almohadilla de calefacción para mantener la temperatura corporal en 37 ° C.
  5. Aplicar un gel oftálmico sobre la superficie anterior de los ojos para evitar la abrasión corneal.
  6. Cepille cuidadosamente el campo quirúrgico (área del pecho del lado izquierdo) con tijeras quirúrgicas. Rocíe una cantidad considerable de solución alcohólica sobre el sitio operatorio. Espere al menos 15 segundos repetir la aplicación 3 veces.
  7. Registrar la frecuencia cardíaca y saturación de oxígeno durante la cirugía.

4. inferior Alveolar nervio reconstrucción utilizando PGA C tubo: desarrollo del modelo de reconstrucción sólo

  1. Inyectar 3 mL de lidocaína al 1% utilizando una aguja de 27 G a la encía mandibular izquierda como un anestésico local y analgésico.
  2. Realizar una incisión transversal de 5 cm con una hoja de bisturí número 15 en la encía mandibular izquierda, para exponer las mandíbulas del animal.
  3. Utiliza vibraciones ultrasónicas piezoeléctricas para moler el aspecto proximal de la mandíbula en un rectángulo de 3 cm × 8 mm a través del agujero mental posterior.
    Nota: La frecuencia de la vibración fue \u2012 28 32 kHz.
  4. Retire la parte frontal de la placa de hueso mandibular (dimensiones, 3 cm × 8 mm) para exponer a la izquierda de IAN (figura 2A)18.
    Nota: El sitio de la reconstrucción se corresponde con el ápice de la raíz del primer molar
  5. Transecto del IAN con un escalpelo para quitar un segmento de 10 mm.
  6. Inserte los muñones proximales y distales del nervio cortado el tubo del nervio a una profundidad de 2 mm.
  7. Use suturas de nylon 8-0 y termina de un microscopio quirúrgico con 8 aumentos para el tubo del nervio proximal y distal de la sutura (figura 2B)18.
  8. Devuelva la placa de hueso a su sitio original en la mandíbula.
  9. Cerrar la herida con suturas de nylon 4-0.
  10. Un día después de la cirugía, confirmar que la placa de hueso mandibular está en su posición correcta.
    1. 4.10.1 realizar proyección de imagen de tomografía computada (CT) del hueso facial bajo anestesia. Definir los parámetros de CT como sigue: 120 kVp, 200 mAs, 0.5 mm/s, grosor de 0.5 mm de corte.
      1. Administrar anestesia con una mezcla de 5 mg/kg ketamina clorhidrato y 1 mg/kg xilacina (figura 3).
  11. Administrar ampicilina (100 mg/día) como un antibiótico y paracetamol (100 mg/día) como analgésico para una semana después de la cirugía.

5. etanol-inducida CSGB: desarrollo de la reconstrucción + modelo CSGB

  1. Realizan reconstrucción de IAN como se describe en la sección 4 y permitir una semana para la recuperación.
  2. Anestesiar los animales con 1.5% de sevoflurano en oxígeno (4 L/min) y aire (6 L/min). Afeitado y limpieza del campo quirúrgico previsto, como se describe en la sección 3.
  3. Marque la línea de incisión con un marcador de piel dibujando una línea en el área del pecho lado izquierdo (figura 4, la línea de incisión es 20 cm de largo).
  4. Inyectar 5 mL de lidocaína al 1% utilizando una aguja de 21 G para la zona del pecho de lado izquierdo como un anestésico local y analgésico.
  5. Haga una incisión en la piel del pecho de lado izquierdo con una hoja de bisturí número 10.
  6. Haga una incisión en la capa de grasa con un bisturí eléctrico para exponer la fascia muscular.
  7. Exponga el serratus ventralis músculo y músculo escaleno.
  8. Levante el serratus ventralis músculo y músculo escaleno de ventral a dorsal para exponer las segunda y terceros costillas (figura 5).
  9. Realizar una toracotomía lateral izquierda en el segundo y tercer espacio intercostal para exponer el ganglio simpático cervical izquierdo (figura 6).
  10. Inyectar 0,2 mL de etanol al 99.5% en el ganglio simpático cervical utilizando una aguja de 30 G bajo visualización directa (figura 7).
  11. Cerrar el espacio intercostal con suturas absorbibles interrumpidas 1-0.
  12. Cierre la piel con suturas de nylon 3-0 interrumpido.
  13. Administrar ampicilina (100 mg/día) como un antibiótico y paracetamol (100 mg/día) como analgésico para una semana después de la cirugía.
  14. En 1 semana después CSGB, medir la temperatura de la piel facial con termografía infrarroja para confirmar la CSGB.

6. electrofisiológicas grabaciones

  1. Para medir el potencial de acción del nervio sensorial (SNAP) y velocidad de conducción sensorial del nervio (SCV) del IAN tres meses después de la reconstrucción, anestesiar animales como se describe en la sección 3.
    Nota: Complemento y SCV deben medirse en ambos los lados del control experimental y normal para cada perro en ambos grupos de tratamiento.
  2. Hacer una incisión en la encía mandibular izquierda con una hoja de bisturí número 10.
  3. Retire con cuidado la placa de hueso mandibular para evitar dañar físicamente el nervio regenerado.
  4. Estimular al IAN con un par de electrodos de aguja, para registrar la presión y el SCV.
    1. Inserte los electrodos proximal en el conducto del nervio.
    2. Se aplican estímulos eléctricos 10 kHz 20 veces.
  5. Analizar los resultados.
    1. Determinar el complemento mediante el cálculo de la amplitud media de la respuesta a la estimulación eléctrica.
    2. Medir la máxima latencia y la amplitud máxima de las grabaciones de la tabla.
    3. Calcular el índice de recuperación con la siguiente ecuación: amplitud pico del izquierda IAN de que sólo la reconstrucción o reconstrucción + CSGB grupo / máxima amplitud del control normal (segmento central del derecha IAN en el grupo de reconstrucción)19 ,20.

7. histológico análisis

  1. Sección Preparación
    1. Tres meses después de la reconstrucción, la cosecha al izquierda IAN, incluyendo 1 cm del nervio a cada lado del sitio reconstruido.
    2. El derecha IAN en el nivel correspondiente en el sitio de cosecha en el lado izquierdo de la cosecha.
    3. Prefijo de los nervios cosechados por inmersión en glutaraldehído al 2,5% en una solución de tampón cacodilato 0.1m (pH 7,4, 48 ° C, 24 h).
    4. Postfix con tetróxido de osmio solución al 2% (48 ° C, 4 h) y ferrocianuro de potasio en tampón de fosfato de 0,1 M (pH 7,4, 2 h).
    5. Deshidratar los nervios con una serie de soluciones de etanol graduado.
    6. Incrustar en la resina de epoxy (parafina).
    7. Sección de las muestras, a un espesor de 0.5 μm de \u2012 1.0.
  2. Azul de toluidina análisis morfológico y tinción
    1. Mancha de secciones con solución de azul de toluidina.
    2. Obtener imágenes de microscopía utilizando un microscopio óptico a 400 aumentos en las siguientes regiones a lo largo de las muestras: izquierda IAN, el centro del segmento regenerado y 2 mm distal a la cepa; IAN de derecha, el centro del segmento IAN correspondiente al sitio de cosecha en el lado izquierdo.
    3. Seleccione imágenes de todas las regiones con fibras nerviosas regeneradas.
      1. Al azar seleccione 8 \u2012 10 áreas del μm 100 × 100 μm que contiene regeneran las fibras nerviosas.
      2. Realizar análisis morfológico utilizando un software apropiado para medir los siguientes parámetros: diámetro de fibras nerviosas mielinizadas (μm) y densidad (cuenta/área), del nervio porcentaje de tejido y G-cociente (axón mielinizado diámetro/myelinated fibras nerviosas de diámetro ).
  3. Inmunotinción
    1. Seguir protocolos estándar para la coloración de la sección de la parafina.
    2. Incubar con anticuerpos primarios durante 30 min a 25 ° C.
    3. Lavar con solución salina con tampón fosfato 3 veces a 25 ° C.
    4. Incubar con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano durante 30 min a 25 ° C.
    5. Obtener imágenes mediante un microscopio de luz.
  4. Microscopía electrónica de transmisión (TEM)
    1. Preparar los nervios como se describe en el paso 7.1.
    2. Nervios de sección en un espesor de 70 \u2012 90 μm utilizando un ultramicrótomo.
    3. Secciones con citrato de plomo y uranilo de Reynold de la mancha.
    4. Examinar e imagen por microscopía electrónica de transmisión.

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Resultados

Se observó un aumento en la temperatura de la piel de la cara del lado bloqueado 1 semana después de la izquierda CSGB (figura 8).

Reconstrucción después de 3 meses, absorbe el tubo de PGA-C en el área de reconstrucción y regeneración del nervio alveolar inferior fue observada en la reconstrucción solamente y reconstrucción + CSGB grupos (Figura 9Ay B)<...

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Discusión

Presentamos un método eficiente para la regeneración de IAN utilizando un tubo de bioabsorbable del nervio en combinación con CSGB inducida por etanol. Para este estudio se utilizaron perros, desde otros modelos animales, como ratones, ratas y conejos, tienen una corta esperanza de vida y tamaño de cuerpo pequeño y por lo tanto no se puede utilizar para realizar los procedimientos quirúrgicos precisos. Como el IAN se encuentra dentro del canal mandibular rodeado de hueso, una técnica quirúrgica es necesaria para evitar e...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Departamento de órganos bioartificiales en Kyoto Instituto Universitario de ciencias médicas de la frontera. Nos gustaría agradecer al personal veterinario del Instituto de ciencias médicas de la frontera.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
NMP Colágeno PSNippon Meatpackers301-84621Atelocolágeno extraído de piel porcina joven mediante tratamiento enzimático
Cortaúñas quirúrgicasRoboz Surgical Instrument CompanyRC-5903
Bisturí desechable (No.15)Kai medical219ABBZX00073000
VarioSurg3NakanishiVS3-LED-HPSC, E1133Cirugía piezoeléctrica para hueso procesamiento
4-0 suturas de nylonEthicon8881H
8-0 suturas de nylonEthicon2775G
Sulfato de isepamicinaNichi-Iko620005641
Bisturí desechable (n.º 10)Kai medical219ABBZX00073000
aguja de calibre 30Nipro1134
1-0 puntosabsorbiblesEthiconJ347H
3-0 Puntadas de nylonEthicon8872H
Neo ThermoNEC AvioTVS-700Termografía infrarroja 
Neuropack y Sigma;NIHON KOHDENMEB-5504Registrador ortodrómico para registro electrofisiológico
Azul de toluidinaSigma-AldrichT3260-5G
Microscopio ópticoKeyenceBZ-9000
Anticuerpo monoclonal de proteína de neurofilamento humano para ratonesDAKON1591
Anticuerpo policlonal anti-S100 de conejoDAKOZ0311
Microscopía electrónica de transmisiónHitachi High TechnologiesHitachi H-7000
Recuento dinámico de célulasKeyenceBZ-H1CSoftware para evaluación morfológica

Referencias

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