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Artículo de método

Mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en Aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto

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DOI:

10.3791/58044

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31 de agosto de 2018

 ,  , 
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

En este artículo

Resumen

El pulgón Aphis nerii coloniza plantas muy defendido en la familia del dogbane (Apocyanaceae) y ofrece numerosas oportunidades para el estudio de las interacciones planta-insecto. Aquí, presentamos una serie de protocolos para el mantenimiento de la planta y el pulgón de las culturas y la generación y el análisis molecular y los datos de a. nerii- omic.

Resumen

Áfidos son excelentes modelos experimentales para una variedad de cuestiones biológicas que van desde la evolución de la simbiosis y el desarrollo de polyphenisms a preguntas alrededor de las interacciones de los insectos con sus plantas hospederas. Recursos genómicos están disponibles para varias especies de áfidos, y con los avances en la secuenciación de próxima generación, transcriptómicos estudios se se amplía a organismos no-modelo que carecen de genomas. Además, culturas de pulgón pueden ser recogidas del campo y criadas en el laboratorio para el uso en experimentos moleculares y el brecha entre los estudios ecológicos y genéticos. Por último, muchos pulgones se pueden mantener en el laboratorio en sus plantas del anfitrión favorito en ciclos de vida perpetuos, partenogénesis que permite comparaciones de reproducir asexualmente genotipos. Aphis nerii, el pulgón de la adelfa de algodoncillo, proporciona uno de estos modelos para estudiar interacciones de insectos con plantas tóxicas usando experimentos de organismos y moleculares. Métodos para la generación y mantenimiento de la planta y pulgón en la expresión diferencial del transcriptoma de invernadero y laboratorio, extracciones de DNA y RNA, análisis de microsatélites, de novo transcriptoma montaje y anotación, Análisis y verificación de la qPCR de genes diferencialmente expresados son descritos y discutidos aquí.

Introducción

Los áfidos son insectos hemimetabolous, pequeño que colonizan en familias de diversas plantas en todo el mundo. Son distintivos para varias características, más en particular sus ciclos de vida complejos con partenogénesis cíclica y polyphenisms discreta y sus simbiosis nutricionales obligados con endosimbionte bacteriano o de levadura que suministrar nutrientes en el la dieta de savia de planta1. Mientras más áfidos son especialistas de planta huésped, algunas especies generalistas son importantes plagas, causando un daño económico considerable en los cultivos ya sea directamente o a través de los agentes patógenos y virus vector2. La publicación del primer genoma del pulgón en el 2010, el áfido de la arveja Acyrthosiphon pisum3, marcó un hito importante en el estudio de la biología de los áfidos porque proporcionó los recursos genomic para abordar preguntas acerca de los insectos adaptaciones al estilo de vida herbívora, los que podrían conducir a un mejor control estrategias4incluidos. Desde entonces, han acumulado más recursos genomic con la publicación de un genoma anotado para la soja pulgón glycines Aphis5y recursos disponibles al público todo el genoma de otra especie de pulgón tres (Myzus Cerasi (cereza negra pulgón), Myzus persicae (pulgón de patatas y melocotón), Rhopalosiphum padi (pulgón de la avena de la cereza de pájaro)6. Valiosa de novo transcriptómicos recursos está disponible, así como para un número de otras especies de áfidos (e.g.,Aphis gossypii (pulgón del algodón)7, Sitobion avenae (áfido grano)8, Cinara pinitabulaeformis (pulgón del pino)9, Aphis nerii (pulgón de la adelfa de algodoncillo)10).

Áfidos también han hecho contribuciones duraderas a nuestro entendimiento de las interacciones planta-insecto y la ecología de la vida en las plantas11. Un área donde los pulgones han hecho contribuciones especialmente importantes es en nuestra comprensión de la ecología química de las interacciones de la planta de host. Adaptaciones expresan diversos insectos herbívoros para superar las defensas de la planta y algunos incluso cooptación las defensas de la planta para su propio benefician de12,13,14. Por ejemplo, el pulgón de la adelfa de algodoncillo, Aphis nerii, es un brillante amarillo, invasor pulgones encontrados en regiones templadas y tropicales en todo el mundo que colonizan en las plantas de la familia del algodoncillo (Apocynaceae). Planta de la familia Apocynaceae ha desarrollado defensas químicas diversas, incluyendo látex lechoso y glucósidos cardíacos conocidos como cardenolides, que se unen el portador de catión Na, K-ATPasa y son eficaces elementos de disuasión a generalistas herbívoros15, 16. especialistas de algodoncillo expresan distintos modos de resistencia a los cardenolides, y selectivamente o pasivamente se acumulan o modificar cardenolides en sus tejidos como medio para disuadir depredadores o para otros beneficios17. A. nerii piensa secuestrar cardenolides de esta manera, aunque los mecanismos y beneficios funcionales siguen siendo claro10,18.

Teniendo en cuenta los recursos genomic a la mano, a. nerii ofrece un excelente modelo experimental para el estudio de los mecanismos moleculares y genéticos involucrados en las interacciones chemo-ecológicas entre las plantas tóxicas acogida y su especialista herbívoros. Cabe señalar que, mientras algunos de los primeros estudios de a. nerii se centró en el secuestro de cardenolides19, desde entonces, los estudios de a. nerii han proporcionado penetraciones en un amplio conjunto de preguntas evolutivas y ecológicas, incluyendo la estructura genética de insectos invasores20 y la interacción entre regulación ascendente y descendente de la densidad de herbívoros21. A. nerii así es un buen candidato como un modelo experimental para un conjunto especialmente amplio de estudios de las interacciones planta insecto. Crítico para el éxito de cualquier estudio con a. nerii es la cultura de cuidado del pulgón las poblaciones, que incluye el cultivo de plantas de las que dependen los pulgones, así como una eficiente generación de datos de alta calidad - omic. Nuestro objetivo es guiar al lector a través de ambos. A continuación figuran los métodos para la generación y mantenimiento de la planta y pulgón en invernadero y laboratorio, DNA y RNA extracciones, análisis de microsatélites, de novo transcriptoma conjunto y anotación, transcriptoma Análisis de expresión diferencial y verificación de la qPCR de diferencialmente expresan genes. Mientras que estos métodos se escriben de a. nerii, los métodos generales de cultivo, la extracción y el análisis se pueden extender a una gran variedad de especies de áfidos.

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Protocolo

1. planta de culturas

  1. Comprar semillas de cualquier proveedor comercial u obtener de plantas maduras en el campo.
    Nota: Este protocolo es adecuado para muchas especies de algodoncillo comercialmente disponibles (e.g., Asclepias incarnata, a. syriaca, a. curassavica, Gomphocarpus physocarpus). Algunas semillas pueden necesitar ser estratificado en frío, y deben revisarse las instrucciones del proveedor de semilla.
  2. Planta las semillas en un suelo fino de la germinación (60 – 70% turba fina, perlita, vermiculita, piedra caliza).
    1. Llenar una bandeja estándar de la planta de semillero con tierra de mezcla de germinación; asegurar que el suelo alcanza la parte superior de los pozos. En cada pozo, haga una marca para crear un agujero en el suelo sobre una profundidad de 3 cm.
    2. Coloque una semilla en cada agujero y el agua muy bien con una regadera que la tierra cubre las semillas y está saturada.
    3. Crecen las semillas en un invernadero (ver condiciones abajo, 1.5). Agua con regularidad, diariamente a cada-otro día; suficiente para mantener la humedad del suelo a un nivel moderado.
  3. Cuando las plántulas han crecido su primer conjunto de hojas completos, volver a maceta plántulas en un encapsulamiento general mezclan (50 – 60% de turba, corteza y piedra caliza) (figura 1A).
    1. Uso 4 pulgadas redondas ollas que encaja con un sello hermético con las jaulas de la taza. Llene con general macetas hasta unos 5 cm por debajo del borde.
    2. Crear un agujero en el suelo profundo lo suficiente como para llegar a la parte inferior de la olla.
    3. Con la mano, suavemente saque la semilla madura de su pozo y colóquela dentro del agujero en el bote de 4 pulgadas. Cubrir la semilla con el suelo. Agua muy bien.
    4. Crecer las plantas en el invernadero y el agua regularmente, día a día; suficiente para mantener la humedad del suelo moderado.
  4. Condiciones de invernadero.
    1. Fijar los termostatos de invernadero para mantener temperaturas diurnas entre 18 – 28 ° C y temperaturas nocturnas entre 16 y 22 ° C usando las instrucciones del fabricante.
    2. Durante los meses de invierno cuando los días son más cortos, complementar la luz diurna con bombillas de sodio de alta presión de 600 W (12 h, 8:00 – 20:00).
  5. Control de plagas no deseadas (por ejemplo, trips, áfidos) con una solución de jabón orgánico foliar, sin embargo, utilizar estos productos con precaución.
    1. La solución de jabón según las recomendaciones del fabricante y se aplican utilizando una botella rociadora.
    2. Dejar el jabón en las plantas para 4 – 24 h. Enjuagar suavemente las plantas con agua para quitar la aplicación después de 4 – 24 h de jabón y enjuague con agua un segunda vez antes cultivos de pulgón de laboratorio.
  6. Cultura la población promedio de pulgones en las plantas que han crecido por lo menos 3-4 sistemas de hojas completos y son por lo menos 10 cm de altura (figura 1B).

2. pulgón de la culturas

  1. Las poblaciones de pulgón de laboratorio a partir de una población de isoclonal de laboratorio existente o a partir de los áfidos de campo siguiendo las instrucciones a continuación.
    1. Cuando a partir de una población de laboratorio de una población existente de isoclonal de laboratorio, transferencia de áfidos como se describe en 2.3.1–2.3.3.
  2. Cuando a partir de la isoclonal nueva, las poblaciones de pulgón de campo y un pulgón solo, reproducción, adultos en una planta huésped adecuado como se mencionó en el paso 1.6.
    Nota: Las poblaciones se pueden comenzar de alado (vivíparos) o unwinged adultos (ápteros).
    1. Inspeccionar manualmente las plantas del invernadero para plagas no deseadas antes de su uso con áfidos de laboratorio. Congele cualquier plantas con pulgones indeseados. Si lo desea, utilice un frasco vacío de etanol para eliminar trips u otras plagas.
      Nota: Asegúrese de lavar las plantas que han sido tratadas con previo de jabón a utilizar como se describe en el paso 1.5.2.
    2. Traslado con seguridad un solo áfido adulto usando un pincel o una pipeta de boca con 3/16" ID x tubería plástica de 1/4" OD, una pipeta de 1.000 μl y una punta de pipeta 2,00 μl (figura 2A).
    3. Asegurarse de cubrir las plantas con pulgones con una jaula de taza creada con un vaso de plástico con la parte superior cortada, cubierta con una malla fina y asegurado con cinta adhesiva (figura 2B).
    4. Colocar las plantas infestadas con áfidos en una bandeja y guardar en una cámara ambiental controlada (16 L: 8, 22 ° C, 70% de humedad).
  3. Para mantener las poblaciones de stock, transferencia de pulgones a frescas nuevas plantas, semanal (2.2.1–2.2.3).
    1. Transfiera con seguridad 1 – 3 2nd o 3rd instar ninfas y 1 pulgones adulto edad usando una pipeta de boca (figuras 2A, 3).
      Nota: Las reservas se mantienen mejor transfiriendo unwinged individuos.
    2. Asegurarse de cubrir las plantas infestadas de pulgones con una jaula de taza creada con un vaso de plástico con la parte superior cortada, cubierta con una malla fina y asegurado con cinta.
    3. Colocar las plantas en una bandeja y mantener pulgones en una cámara ambiental (16 L: 8, 22 ° C, 70% de humedad).
    4. Alternativamente, si se desea y si la planta hospedera es de calidad decente, use un frasco vacío de etanol para reducir las poblaciones dejando reproducir sólo un adulto y dos a tres 2 º o 3er instar ninfas.
  4. Para crear las mismas poblaciones de edad para el uso en experimentos, lugar hasta 5 adultos (preferiblemente unwinged) de la población en una nueva planta de host.
    1. Eliminar a los adultos 24 h más tarde.
    2. Unos 5 – 7 días más tarde, una vez que han madurado las crías de1 F a la edad adulta, colocar a hasta 5 unwinged F1 adultos en una nueva planta de host. Eliminar a los adultos 24 h más tarde.
    3. Una vez que la población de2 F ha madurado hasta la edad adulta, esta población está lista para ser usado en experimentos.
      Nota: Este proceso asegura que la población experimental es aproximadamente la misma edad y nacen de madres de edad más o menos el mismo.
  5. Confirmar las diferencias genotípicas entre líneas isoclonal capturado en el campo mediante Genotipado de microsatélites (descrito a continuación, las secciones 3 y 4).

3. extracción de ADN

  1. Preparación
    1. Utilizar técnicas estériles para preparar 1 L de tampón de lisis (0,1 M NaCl, sacarosa de 0,2 M, 0,1 M Tris (pH 9.1), EDTA de 0.05 M, 0,05% SDS).
    2. Caliente del bloque calefactor o baño María a 65 ° C.
  2. Lisis y la homogeneización de tejidos
    1. Coloque el pulgón en la parte inferior de un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL estéril.
    2. Coloque el mortero estéril en el tubo con el pulgón y sumergir la parte inferior de los tubos en nitrógeno líquido.
      Nota: Desintegración de tejido óptimo se logra cuando el pulgón se coloca entre el mortero y el lado del tubo.
    3. Moler el pulgón con el mortero inicialmente Lyse las células.
    4. Para un solo áfido adulto, utilizar 200 μl (dividir en alícuotas de 2 x 100 μL) del buffer de lisis. Añadir la primera alícuota para moler y resuspender el pulgón triturado hasta que la muestra es visiblemente se desintegró, luego use la segunda alícuota a lavar la mano del mortero.
    5. Incubar los áfidos machacados en tampón de lisis a 65 ° C en el bloque de calor o baño de agua durante 30 minutos.
  3. Precipitación del ADN
    1. Mientras el tubo está caliente, agregar 14 μl de 8 M KOAc. Invertir el tubo para mezclar. Almacenar la muestra en hielo durante 30 minutos.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí, y las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta 24 horas.
    2. Centrifugar a 13.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Transferir el sobrenadante a tubo nuevo de 1,5 mL con una pipeta. Tenga cuidado de no eliminar ninguno de los restos sedimentados.
    3. Para mejorar la visualización del pellet de DNA, añadir 2 glucógeno μl (20 μg/mL) en el sobrenadante. Si el tamaño de muestra es suficientemente grande, omite este paso.
    4. Añadir 200 μL de etanol de grado molecular de frío 100% para el sobrenadante. Invierta los tubos para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí, y las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta 24 horas.
    5. Centrifugar a 13.000 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Eliminar el etanol por pipeteo.
  4. Elución y lavado de ADN
    1. Añadir 200 μL de etanol frío al grado molecular 70%. A continuación, parpadeará el tubo para suspender y lavar el pellet.
    2. Centrifugar a 13.000 x g durante 5 minutos. Mientras visualizas la pelotilla, retire el etanol mediante pipeteo con cuidado y añada 200 μL de etanol de grado molecular de frío 100%.
    3. Centrifugar a 13.000 x g durante 5 minutos. Mientras visualizas el balín, para sacar el etanol pipeteo.
      Nota: Repetir el 100-70-100 etanol la colada si es necesario.
    4. Secar las pastillas por 5 – 10 min con la colocación del tubo horizontal abierta sobre un papel.
    5. Resuspender el precipitado de DNA en 80 μl de baja TE (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA).
    6. Cuantificar el ADN resuspendido utilizando un espectrofotómetro.
    7. Almacenar a 4 ° C.

4. microsatélites PCR y secuenciación para la genotipificación de pulgón

  1. Ordenar los cebadores apropiados F y R para microsatélites secuenciación (tabla 120).
    Nota: Primer revés secuencias deben modificarse con etiquetas fluorescentes 5' 6-FAM o 5'-5-HEX para permitir muestras de multiplexado para la secuencia de microsatélites.
  2. Realizar la PCR con muestras de ADN solo pulgón (descritas en la sección 3) y primers microsatélites fluorescencia marcada.
    1. Mezcla de reacciones de PCR según protocolo del fabricante (F/R cartilla de 0.2 μm, 2.5mm MgCl2, plantilla de la DNA de 50 a 200 ng).
    2. Utilice la siguiente configuración de Termociclador: desnaturalización inicial a 94 ° C por 4 min, 35 ciclos de 94 ° C por 30 s, 58 ° C por 35 s, 72 ° C por 45 s y un paso de elongación final a 72 ° C durante 10 minutos.
  3. Combinar las muestras PCR con diferentes etiquetas fluorescentes para reducir el número de muestras secuenciadas y secuencia de las muestras de microsatélites en un servicio de genotipificación.
  4. Analizar los archivos de muestra crudo .fsa usando software de análisis de microsatélites.

5. extracción RNA

  1. Recoger muestras de áfidos para extracción de RNA en 1,5 mL Rnasa / de los tubos libre de DNasa e inmediata congelación en nitrógeno líquido.
    Nota: Si estos pasos no se realiza inmediatamente, las muestras pueden conservarse a-80 ° C.
  2. Homogeneización de tejidos
    1. Con la mano del mortero estéril en el tubo con pulgón, congelar en nitrógeno líquido durante 10 – 15 segundos, hasta la parada muestra que chisporrotea. Aplastar el pulgón con el mortero como se describe en el paso 3.2.
      Nota: Desintegración de tejido óptimo se logra cuando el pulgón se coloca entre el mortero y el lado del tubo.
    2. En la capilla del humo, añadir 800 μl de reactivo de extracción del tiocianato-fenol-cloroformo de guanidinio a la muestra (pulgones adultos de 1 a 5). Homogeneizar las muestras con del mortero y la maja.
  3. Separación de la fase
    Nota: Todas las medidas deben realizarse en una campana de humos.
    1. Incubar las muestras homogeneizadas durante 5 minutos a temperatura ambiente. Añadir 160 μl de cloroformo a la muestra. Agitar vigorosamente a mano durante 15 s.
    2. Incubar durante 2-3 min a temperatura ambiente. Centrifugar 15 min a 12.000 x g a 4 ° C.
      Nota: Después de la centrifugación, la mezcla se separa en 3 capas: una fase inferior, rojo fenol-cloroformo, una interfase y una fase acuosa superior descolorida. El RNA permanece exclusivamente en la fase acuosa. El volumen de la acuosa será ~ 480 μl.
  4. Precipitación de RNA
    1. En una campana de humos, transferir la fase acuosa a un tubo nuevo, libre de ARNasa. No molestes a la fase intermedia.
    2. Precipitar el ARN mediante la adición de 400 μL de isopropanol e incubar la muestra a-20 ° C durante 10 minutos.
      Nota: El protocolo se puede detener aquí, y las muestras pueden almacenarse a-20 ° C hasta 24 horas.
    3. Centrifugue la muestra durante 10 min a 12.000 x g a 4 ° C.
  5. Elución y RNA wash
    1. Quite el sobrenadante; reloj para el pellet de RNA.
    2. Lavar el pellet de RNA con 1 mL de etanol al 75% en agua tratada con DEPC. Mezclar con un vórtex lento. Centrifugar durante 5 min a 7.500 x g a 4 ° C.
    3. Repita los pasos 5.5.1–5.5.2 para ayudar a eliminar contaminantes de fenol.
    4. Quite el sobrenadante y secar el pellet por 5-10 min con colocación de tubo horizontal abierta en un banco estéril. No deje que el pellet de RNA seque completamente.
    5. Disolver el pellet de RNA en 30 μl de agua libre de ARNasa o tratada con DEPC. ¡Pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar. Incubar a 55-60 ° C durante 10-15 minutos.

6. RNAseq De Novo transcriptoma conjunto, anotación y análisis de expresión diferencial

  1. Analizar la concentración de la muestra de RNA y su calidad mediante un sistema electroforético capilar basado en el chip.
    Nota: Un sistema de electroforesis capilar basado en el chip es el método preferible de la opción de analizar con un espectrofotómetro ya que proporciona una medida más exacta y más sensible de la concentración de RNA y de calidad.
    1. Si las muestras son de calidad adecuada (≥ 250 ng total, RIN (número de integridad del RNA) ≥ 5), realizar la secuencia de RNA.
      Nota: Importante, porque estos datos de la secuencia se utilizará para ambos conjunto de transcriptoma de perfiles y de novo de expresión, más leen profundidad resultará en un transcriptoma de calidad superior. Para un conjunto razonablemente completo usando la tecnología de secuenciación Illumina, bp 100 100 millones, Lee pares final sería un punto de partida recomendado. Total preparación de biblioteca de mRNA y la secuencia de RNA fueron realizados por un centro de secuenciación.
  2. Compruebe la calidad de lecturas utilizando Fast QC22.
  3. Muestra todas las lecturas se combinan y montar el transcriptoma de novo utilizando Trinidad23,24 (Trimmomatic calidad filtrado habilitado).
  4. Refinar la Asamblea
    1. Utilice Transdecoder25 para identificar marcos de lectura abierta (ORFs) que son un mínimo de 100 aminoácidos de longitud.
    2. Realizar búsquedas de homología de las ORFs traducidos contra Pfam26 y UniProt27 bases de datos utilizando BLASTP28 y29de HMMER, respectivamente.
    3. Retire la transcripción bacteriana (cualquier secuencia traducida cuya explosión mejor golpe era un gen bacteriano con una puntuación de bit de más de 300 y una identidad de secuencia de aminoácidos mínimo del 50%).
    4. Contraer cualquier ORFs completas, traducidos que son por lo menos 99% idénticos a nivel de aminoácidos usando CD-golpee30.
    5. Colapsar los ORFs restantes, incompletos que son 95% idéntico a nivel de nucleótidos usando CD-golpee30.
    6. Asignar las secuencias de nucleótidos restantes con identificadores únicos, propios de cada especie (por ejemplo, 0001 APHNE).
  5. Evaluar la integridad de la Asamblea refinada, utilizando BUSCO (http://busco.ezlab.org/) y los artrópodos gene dataset31.
  6. Anotación de transcriptoma
    1. En primer lugar, anotar el transcriptoma refinado con HMMER contra la base de datos Pfam26,29.
    2. En segundo lugar, anotar el transcriptoma utilizando BLASTP contra la base de datos de UniProt27,28.
    3. En tercer lugar, anotar el transcriptoma utilizando BLASTP contra las secuencias de codificación de insectos seleccionados con genomas publicados, anotados.
    4. Por último, anotar el transcriptoma utilizando BLASTP guisante pulgón proteína base de datos de sólo.
    5. Utilizar Trinotate para generar las anotaciones de GO de UniProt adhesiones.
    6. Utilice Trinotate para organizar todos los resultados de anotación en una base de datos de SQLite y generar un informe de la anotación.
  7. Análisis de expresión diferencial
    Nota: Haciendo referencia a la refinada transcriptoma, alinee y cuantificar por separado cada biblioteca.
    1. Utilice Trimmomatic para filtro de calidad y recortar los archivos leer original32.
      Nota: Si se realiza este paso después de una Asamblea de Trinidad, uno puede en su lugar utilice la salida de Trimmomatic de ese paso.
    2. Realizar alineamientos locales para cada muestra usando Bowtie233.
    3. Extracto de la que cuenta de la lectura de cada muestra individualmente utilizando SAMtools34.
    4. Calcular la expresión diferencial entre muestras de interés utilizando DESeq2 con los parámetros por defecto y montar un paramétrico35.

7. qPCR verificación de Genes diferencialmente expresados

Nota: Si los usuarios están interesados en genes diferencialmente expresados desde sus experimentos RNAseq, el siguiente protocolo puede utilizarse para verificar patrones de expresión diferencial.

  1. Generar muestras de RNA como se describió anteriormente (paso 5).
  2. Extracciones de RNA utilizando un espectrofotómetro para comprobar la calidad y obtener la concentración de cuantificar.
  3. Sintetizar el cDNA muestras usando un kit disponible comercialmente según las recomendaciones del fabricante.
  4. Determinar las eficiencias de la cartilla de genes de interés para asegurar la precisión doble amplificación por PCR.
    1. Basado en las concentraciones de RNA originales, realizar diluciones seriadas (101) para obtener concentraciones de cDNA 3.
    2. Usando una mezcla maestra de PCR cuantitativa, mezcla de reacciones de qPCR triplicado según protocolo del fabricante utilizando tres concentraciones de cartilla (por ejemplo, 100 nM, 200 nM, 300 nM) con tres concentraciones de cDNA diluidos en serie (por ejemplo, 0.1 ng/μl, 10 ng/μl, 100 ng/μL).
    3. Para cada gen de destino, calcular la pendiente (m) de la línea creada con los valores medios det de C para cada muestra como las variables dependientes y el log (concentración de cDNA) como las variables independientes (tres puntos en total).
    4. Utilice la siguiente ecuación para calcular la eficiencia (E) de la cartilla donde m es la pendiente calculada en 7.4.3:
      E = 10^(-1/m)
      Nota: Primer eficiencias entre 90-110% son adecuadas para los análisis. Este proceso asegura igual amplificación de los genes incluidos en los cálculos.
  5. Utilice el método det ΔΔC con un gen housekeeping para cuantificar la expresión diferencial de genes de interés36.

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Resultados

Las culturas de la planta: Las semillas llevará aproximadamente de dos a cuatro semanas, dependiendo de la temporada, para crecer lo suficiente como para ser nuevo en maceta (figura 1A). Las plántulas a macetas tendrá otras dos a cuatro semanas para crecer a un tamaño óptimo para los cultivos de pulgón (figura 1B).

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Discusión

Durante mucho tiempo se ha reconocido que la catalogada a. nerii puede proporcionar penetraciones en los patrones y mecanismos de resistencia a las defensas de la planta y secuestro particularmente química18,37. Recientemente ha surgido una serie de recursos genómicos de a. nerii10, ofreciendo nuevas oportunidades para estudios de genómica funcionales y ecológicos que usan a. nerii como modelo. Describiremos los ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a Michelle Moon (Vanderbilt University) por asistencia con la fotografía. Proporcionado la Universidad de Vanderbilt a PA y SSLB se admiten por DGE-1445197.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sun Gro Fafard Mezcla de GerminaciónHummert International10-0952-2
Sun Gro Fafard 3B/ Metro MixHummert International10-0951-2
2" x 4" Maceta Redonda Estándar AndersonPots1503
DreamTaq ADN PolimerasaThermoFisher ScientificEP0701
TrizolThermoFisher Scientific
SuperScript® III Kit de síntesis de primera cadenaThermoFisher Scientific18080051
Power SYBR Green PCR Master MixThermoFisher Scientific4367659
15596026

Referencias

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313(2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180(2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524(2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31(2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417(2010).

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