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Artículo de método

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

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DOI:

10.3791/58051

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25 de septiembre de 2018

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1Circulating Tumor Biomarkers Laboratory, SiRIC, Translational Research Department, Institut Curie, PSL Research University, 2CNRS UMR144, Institut Curie, PSL Research University, 3Department of Medical Oncology, Institut Curie, PSL Research University, 4University Versailles Saint-Quentin-en-Yvelines, 5University Paris Descartes, 6Inserm U830, Institut Curie, PSL Research University

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.

Resumen

Reacción en cadena de polimerasa digital gota (ddPCR) es un método de reacción en cadena (PCR) alta sensibilidad cuantitativa de polimerasa basado en fraccionamiento de la muestra en miles de reacciones individuales de agua en aceite tamaño nanométrico. Recientemente, ddPCR ha convertido en uno de los instrumentos más precisos y sensibles para la detección de ADN (ctDNA) de tumor de circulación. Una de las principales limitaciones de la técnica de ddPCR estándar es el número limitado de mutaciones que pueden ser defendidos por reacción, como sondas de hidrólisis específica reconociendo cada versión alélica posible son necesarias. Una metodología alternativa, el ddPCR de entrega, aumenta el rendimiento, ya que requiere solamente un solo par de sondas para detectar y cuantificar potencialmente todas las alteraciones genéticas en la región específica. Entrega ddPCR muestra sensibilidad comparable a ensayos ddPCR convencional con la ventaja de detectar un mayor número de mutaciones en una sola reacción. Es rentable, conserva muestras preciosas y puede usarse como una herramienta de descubrimiento cuando las mutaciones se desconocen a priori.

Introducción

Miles de mutaciones somáticas relacionadas con el desarrollo de cáncer han sido reportados1. Entre éstos, algunos son marcadores predictivos de la eficacia de la terapia dirigida 2,3 y detección de estas mutaciones genética es la práctica clínica habitual ahora. Tecnología PCR (ddPCR) digital de la gotita puede utilizarse para monitorizar la presencia o la ausencia de mutaciones con precisión de detección alta y es altamente compatible con biopsias líquido no invasivos4,5. Sin embargo, ensayos de ddPCR actual están diseñados principalmente para detectar las mutaciones conocidas a priori. Esto limita severamente el uso de ddPCR como una herramienta de descubrimiento cuando la mutación es desconocida. De hecho, en el diseño convencional de ddPCR, una sonda de hidrólisis reconociendo el alelo de tipo salvaje (WT sonda) compite con una sonda específica reconociendo el alelo mutante (MUT Probe) (figura 1A). La sonda con mayor afinidad cruza por hibridación a la plantilla y libera su fluoróforo, indicando la naturaleza del alelo correspondiente. Los datos de fluorescencia obtenidos para cada gotita se pueden visualizar en un diagrama de dispersión que representa la fluorescencia emitida por las sondas WT y MUT en diferentes dimensiones. Una representación esquemática de un resultado típico de un ensayo de ddPCR convencional se presenta en la figura 1A. En este ejemplo, la nube azul corresponde a las gotitas que contienen alelos WT identificados por la punta de prueba de peso, mientras que la nube roja corresponde a gotitas en el que el alelo MUT ha sido amplificado e identificado por la sonda MUT. Dependiendo de la cantidad de DNA en la reacción, doble positivo gotitas que contienen peso y MUT amplicones pueden aparecer (nube verde). La nube gris clara corresponde a gotas de vacías.

Puesto que la mayoría de las plataformas permite la detección de un número limitado de fluoróforos (generalmente 2, pero hasta 5), rendimiento de ddPCR convencional es limitado. Por lo tanto, dirigida a las regiones con múltiples mutaciones adyacentes requiere diseño de técnicamente difícil ensayos multiplex ddPCR o el uso de múltiples reacciones dirigidas a cada mutación en paralelo. La estrategia de ddPCR de entrega, supera esta limitación como es potencialmente capaz de detectar cualquier alteración genética dentro de una región de destino utilizando un único par de sondas de hidrólisis WT. La primera cubre sonda (sonda 1) es complementaria a la secuencia de la WT de la región de destino donde las mutaciones son una secuencia no variable, adyacente a la región de destino y la segunda sonda (sonda 2) espera (figura 1B). Mientras que la primera punta de prueba cuantifica la cantidad total de amplificable moléculas en la reacción, la segunda sonda discrimina alelos WT y MUT óptimo hibridación a las secuencias mutantes. Punta de prueba 2 puede identificar varios tipos de mutaciones en la región (substituciones del nucleótido único o múltiples, eliminación, etc.) de destino6. Como en ddPCR convencional, la nube gris clara corresponde a las gotas que contienen no las moléculas de ADN. Es importante recordar que en este tipo de análisis, separación óptima de WT y MUT nubes depende de la cantidad de ADN cargado en la reacción, ya que no se pueden distinguir las gotitas que contienen alelos objetivo WT y MUT de gotitas que contienen sólo el peso forma. Por lo tanto, este análisis requiere que la mayoría de las gotas contienen no más de una copia del gen objetivo.

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Protocolo

El protocolo que presentamos sigue las pautas de ética del Instituto Curie. Todas las muestras humanas fueron obtenidas de pacientes inscritos, tras consentimiento informado, en estudios aprobado por la Junta de revisión institucional en el Instituto Curie.

1. recolección, almacenamiento de Plasma y extracción de ADN libre de células de la sangre

Nota: Se puede utilizar la DNA extraída de cualquier tipo de "tejido" (por ejemplo, parafina fresca o formaldehído-fija integrado tejidos (FFPE), las células en las muestras de cultura o de la sangre). Aquí proporcionamos instrucciones detalladas para recolección de sangre, plasma aislamiento y almacenamiento y extracción de ADN (cfDNA) sin células.

  1. Almacenamiento de la colección y el plasma de la sangre (figura 2B)
    1. Obtener muestras de sangre en tubos con EDTA de 7 mL. Dos tubos se recomiendan recoger aproximadamente 4 mL de plasma.
    2. Centrifugar los tubos durante 10 min a 820 x g dentro de 3 h de la atracción de la sangre para separar los glóbulos rojos (RBC), leucocitos (WBC) y plasma. El tiempo entre el muestreo y la centrifugación es crítico para obtener alta calidad cfDNA (es decir, cfDNA no contaminado con ADN de WBC).
    3. Pipetee cuidadosamente el sobrenadante (plasma) utilizando una pipeta de 1 mL sin tocar la capa de WBC; generalmente se recuperan alrededor de 2 mL de plasma por tubo de EDTA.
    4. Transferir el plasma a tubos de 2 mL y centrifugar las alícuotas a 16.000 x g por 10 min a 15 ° C para eliminar restos celulares.
    5. Pipetee cuidadosamente el sobrenadante (plasma) sin perturbar el pellet. Distribuir el plasma en tubos criogénicos de 2 mL y guardar a-80 ° C hasta que se necesite.
  2. cfDNA extracción (Figura 2B)
    Nota: Aquí, presentamos el procedimiento utilizando el kit de extracción manual. Una versión automatizada siguiendo las instrucciones del fabricante puede realizarse también para el aislamiento de cfDNA.
    1. Poner 400 μL de proteinasa K en un tubo de 50 mL. Agregar 4 mL de plasma (volumen utilizada de manera rutinaria) y 3,2 mL de tampón de lisis ACL (contiene 1,0 μg portador RNA) desde el kit. Cierre el tubo y mezclar con un vórtex durante 30 s para obtener una solución homogénea. Incubar a 60 ° C durante 30 minutos.
    2. Añadir 7,2 mL de buffer ACB (del kit) para el lisado para optimizar la Unión de las circulación los ácidos nucleicos a la membrana de silicona y mezclar con un vórtex para 15 – 30 s. Incubar el tubo durante 5 minutos en hielo.
    3. Coloque la columna y el diluyente de 20 mL en la bomba de vacío. Cerca de las posiciones no utilizadas para permitir la extracción con bomba aspirativa.
    4. Aplique cuidadosamente la mezcla de lisado-buffer ACB en el extensor de tubo (brevemente centrifugar el tubo para recoger el máximo de mezcla de lisado-buffer ACB), encender la bomba de vacío y permitir que el lisado ser dibujado a través de las columnas completamente. Retire y deseche el extensor de tubo.
    5. Aplique 600 μl de buffer ACW1 a la columna. Cuando buffer ACW1 ha dibujado a través de la columna, agregar 750 μl tampón ACW2 y finalmente agregar 750 μl de etanol (96-100%). Luego, coloque la columna en un tubo limpio de 2 mL y centrifugar a máxima velocidad (20.000 x g) durante 3 minutos eliminar el etanol.
    6. Coloque la columna en un tubo nuevo de colección de 2 mL. Abra la tapa e incubar a 56 ° C durante 10 min secar completamente la membrana.
    7. Coloque la columna en un tubo de unión baja de ADN limpio de 1,5 mL. Aplique cuidadosamente 36 μl de agua libre de ARNasa con 0,04% de azida sódica (tampón de AVE). Cierre la tapa e incubar a temperatura ambiente durante 3 minutos.
    8. Centrifugar a máxima velocidad (20.000 x g) durante 1 min eluir los ácidos nucleicos y almacenar a-20 ° C hasta que se necesite.
  3. cuantificación de cfDNA
    Nota: cfDNA la cuantificación se realiza con un fluorómetro usando protocolo del fabricante inmediatamente después de la extracción o la descongelación de las muestras a temperatura ambiente (RT), antes de su uso. Evitar congelaciones y descongelaciones múltiples.
    1. Utilizar el análisis de alta sensibilidad según la cantidad de cfDNA esperado, que es generalmente menos de 100 ng/mL plasma. cfDNA las concentraciones van desde 2 a 10 ng/mL para donantes sanos pero pueden ser tan altas como 100 ng/mL en pacientes con enfermedad metastásica.
    2. Asegurar todos los reactivos a temperatura ambiente y mezclan 199 μl de tampón de dilución de Fluorímetro con 1 μl de colorante (200 x) por la reacción (número N de muestras + 2 normas para calibrar el fluorómetro) para obtener una solución de trabajo.
    3. La solución de cfDNA para asegurar la homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger contenidos en la parte inferior del tubo de vórtice.
    4. Mezcla 5 μl de cada muestra de cfDNA con 195 μl de la solución de trabajo.
    5. Mezclar 10 μl de cada norma con 190 μl de la solución de trabajo.
    6. Tubos de vórtice completamente todas para que 2-3 s garantizar la homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger contenidos en la parte inferior de los tubos.
    7. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min en la oscuridad.
    8. Leer los tubos en el fluorómetro, usando el modo de salida de ' ng/μl'
    9. Calcule la concentración final en ng/mL de plasma de la siguiente manera: ng/μl x 36 (volumen de eluido cfDNA) / 4 (volumen de plasma extraído).

2. ddPCR sonda y Primer diseño (figura 2A)

Nota: La amplificación de las moléculas específicas en el análisis de ddPCR de entrega sigue principios similares de qPCR. Cada cartilla y punta de prueba está diseñado con el software dedicado convencional Primer37 (http://primer3.ut.ee/).

  1. Primer diseño
    1. En la ventana de configuración general, cambiar 'concentración de cationes divalentes' a 3.8, 'concentración de dNTPs' a 0.8 y ' mispriming/repetición biblioteca ' para el organismo correcto.
    2. En la ventana de configuración avanzada, cambiar la 'Tabla de parámetros termodinámicos' y la 'fórmula de la concentración de sal' a Santa Lucia 1998.
    3. Elegir un Tm entre 55 y 70 ° C (de 50 mM para la concentración de sal y 300 nM para la concentración del oligonucleótido).
    4. Comprobar la especificidad de los primers mediante herramientas como PrimerBlast.
    5. Evitar las regiones que tienen estructuras secundarias.
    6. Elegir una secuencia que tiene un contenido GC del 50 – 60%.
    7. Evitar repeticiones de Gs y Cs más de 3 bases.
    8. Elegir cebadores con Gs y Cs en su extremo 3' siempre que sea posible.
    9. Aseguran 3' extremos de cebadores apareados no complementariedad significativa para evitar dímeros de primer. Amplicones deben ser menor que 150 bp eficientemente ampliar cfDNA (sea tamaño 170 bp8) y la DNA extraída de FFPE, que es a menudo fragmentado.
  2. Diseño de la sonda
    Nota: Las sondas de hidrólisis se etiquetan con un reportero fluorescente en el extremo 5' y un extintor en el extremo 3'. Proporcionan alta especificidad, alta relación de señal a ruido y permite multiplexación si es necesario. Dos canales gotita lectores son compatibles con tintes FAM y HEX o VIC, así como análisis de FAM/HEX o FAM/VIC junto las puntas de prueba.
    1. Diseño de sondas de hidrólisis complementaria a la secuencia de la WT de la región de destino y la región adyacente de la variable no.
    2. Seleccione sondeos ubicados dentro de los amplicones definidos por el par de la cartilla diseñado previamente. Secuencias de la cartilla no pueden solaparse con las secuencias de sondeo, aunque puede sentarse uno junto al otro.
    3. Elegir la cadena que tiene más Cs de Gs. puntas de prueba deben tener un contenido de GC de 30-80%.
    4. Seleccione sondeos que están entre los 13 y 30 nucleótidos de longitud. Las sondas más largas tienden a mostrar mayor fluorescencia de fondo porque la distancia entre el fluoróforo y el quencher afecta el amortiguamiento de la reportera del fluoróforo.
    5. Seleccione Tm de las sondas de 3 a 10 ° c superior a Tm de los iniciadores para sonda de hidrólisis durante el recocido de la cartilla y extensión. Potenciadores dem T se recomiendan para alcanzar el necesario Tm manteniendo la sonda corta, como las puntas de prueba más cortos discriminan variantes de un solo nucleótido más eficientemente. Las sondas no deben tener un G en el extremo 5' porque esto apaga la señal de fluorescencia incluso después de la hidrólisis.
    6. Diseño entrega las puntas de prueba como sigue: 5'-(VIC) -secuencia complementaria del peso de la región mutada-(MGB NFQ)-3' y como la punta de prueba de referencia: 5'-(6-FAM) -secuencia complementaria de una región variable no-(MGB NFQ)-3'. También son posibles otras combinaciones de reportero/extintor.

3. optimización de la ddPCR reacción (figura 2A)

Nota: Controles de DNA de tipo salvaje y mutantes utilizados en esta etapa pueden obtenerse de líneas celulares, muestras tumorales o estándares de referencia de ADN disponibles comercialmente, por ejemplo.

  1. Realizar una PCR convencional en un termociclador mediante la función gradiente térmica para validar la especificidad del producto PCR amplificado por los primers diseñados.
    1. Preparar una mezcla única de la reacción de PCR como se describe a continuación en el paso 4.1 (sin sondas) en una plantilla de control de DNA de tipo salvaje para un mínimo de 8 reacciones que tenga al menos una reacción por temperatura.
    2. Ejecute la amplificación usando el programa descrito en paso 4.3.2 y un rango de temperaturas de recocido alrededor de la temperatura de recocido teórica de los iniciadores.
    3. Carga de productos de la PCR en un gel de agarosa al 3% para seleccionar para recocido temperatura proveyendo productos específicos.
  2. Realizar una serie de ddPCRs de entrega usando los parámetros descritos anteriormente, pero esta vez incluyendo ambas puntas de prueba.
    1. Uso 100% WT ADN, ADN de MUT 100% y una mezcla de WT y MUT ADN (por ejemplo, 50% MUT/50% WT) para determinar las mejores condiciones para la separación clara de las nubes de gotas WT y MUT.
    2. Elegir una gama de temperaturas de recocido por encima de la temperatura elegida en el paso 4.1.
    3. Seleccione la temperatura de recocido que permite la detección específica de peso o MUT señales cuando se utiliza ADN de peso 100% o 100% ADN de MUT y mejor separación de las nubes de gotas WT y MUT.
    4. Recocido de concentraciones tiempo y primer punta de prueba también se puede ajustar para mejorar la separación de las nubes y para disminuir el número de gotas con fluorescencia intermedia (efecto lluvia).
  3. Evaluar el límite de espacio en blanco (LOB) o fondo del ensayo.
    1. Realizar un mínimo de 48 reacciones de ddPCR de entrega individuales con un control de peso ADN utilizando los parámetros de recocido y las concentraciones de primers/sondas en 3.2.
    2. Para cada reacción, calcular la frecuencia del alelo mutante (MAF) como sigue: (número de mutante gotitas o número de gotas llenas) x 100.
      Nota: La unidad de negocio es definido como la media MAF de falsos positivos y asociado SD desde la que se calcula el intervalo de confianza de 95% (IC 95%). LPP = (media de falsos positivos MAF) + IC del 95%.
  4. Evaluar el límite de detección (LOD) del ensayo.
    1. Realizar reacciones de ddPCR de entrega utilizando diluciones seriadas de ADN de MUT en el ADN de la WT, con MAFs desde 5% hasta el 0,01% (≥ 8 repeticiones por condición). Utilizar concentraciones de parámetros y cartillas/sondas recocidas en 3.2.
      Nota: El LOD se define como los valores más pequeños del MAF que replica los valores medios presentes y SD por encima de la línea de negocio (véase Decraene et al. 6 para más detalles).

4. ddPCR protocolo (figura 2B)

Nota: DdPCR Similar al convencional, el protocolo de ddPCR de entrega consiste en 4 pasos: (i) PCR mezclar preparación, generación de la gotita (ii), amplificación por PCR (iii) y adquisición de datos (iv).

  1. Preparación de la mezcla de PCR
    1. Seguir las precauciones estándar, tales como guantes, utilizando una Limpie la campana de PCR, pipetas limpias y Rnasa, DNasa libre agua destilada para evitar la contaminación.
    2. Descongelar y equilibrar los componentes de la reacción a TA.
    3. Preparar 20 x mezcla de cebadores/puntas de prueba en agua destilada, con cartillas a 18 μm y sondas de 5 μm.
    4. Para todas las reacciones individuales de PCR, preparar una mezcla de la muestra mediante la combinación de 2 x ddPCR supermix (10 μL), 1 μl de 20 x mezcla de sondas de cartillas y hasta 10 ng ADN muestra qsp 20 μl de agua destilada.
    5. Mezclar la reacción mezclar cuidadosamente para asegurar la homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger contenidos en la parte inferior del tubo antes de dispensar. No dude en repetir este paso para cada mezcla de reacción antes de su uso.
  2. Generación de la gota
    1. Inserte el cartucho de ddPCR en el soporte y cargar 20 μL de mezcla de reacción que contienen las muestras en los pocillos mediados del cartucho para la generación de gotas (posiciones de verdes en la figura 2B) con una pipeta de 8 canales.
    2. Añadir 70 μL de aceite generador de gotas en los pocillos de fondo (amarillo posiciones).
    3. Inserte el cartucho, con una junta, en el generador de gotas; las gotitas se producirán en los pozos superior del cartucho (posiciones azul).
    4. Aspirar y dispensar lentamente y suavemente (para evitar cizallamiento) 40 μL de las gotitas de los cartuchos en una placa PCR de 96 pocillos. Utilice una pipeta multicanal para optimizar a la transferencia de las gotas.
  3. Amplificación por PCR
    1. Selle la placa final de la PCR con una lámina de aluminio utilizando un sellador de placas inmediatamente después de la transferencia de las gotas para evitar la evaporación. Centrifugar brevemente la placa para recoger contenidos en la parte inferior de los pozos.
    2. Ejecutar una amplificación de PCR convencional en un termociclador con el siguiente programa: 95 ° C 10 min, 40 ciclos de [94 ° C 30 s, validado recocido T ° por 60 s], 98 ° C 10 min (rampa 2,5 C ° / s). Incluyen controles sin entrada DNA y DNA de tipo salvaje (≥ 3 repeticiones) en cada serie.
    3. Una vez terminada la carrera, centrifugar brevemente la placa para recoger contenidos en la parte inferior de los pozos.
  4. Adquisición de datos
    1. Después de la amplificación por PCR, utilizar el lector de gotita a cuenta positiva de PCR y PCR-negativa gotas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
      Nota: El lector de gota generalmente ofrece un sistema de detección óptica de dos colores compatible con fluoróforos FAM, VIC o hexagonal.

5. Análisis (figura 2 y figura 3)

Nota: Gotitas positivo PCR y PCR-negativos se cuentan proporcionar una cuantificación absoluta de la MUT y los alelos WT en la región específica. Las gotitas asignadas se utilizan para calcular el MAF en cada pozo. Cuantificación de la gotita y análisis de entrega ensayos se pueden realizar utilizando el paquete de ddPCR R (https://github.com/daattali/ddpcr) desarrollado por Attali y colegas9,10. Este paquete de R clasifica automáticamente las gotas como vacía, parte de la "lluvia" (debido a la amplificación ineficiente) o con una señal real positiva (figura 3). La siguiente sección presenta las distintas etapas del análisis es una versión breve de la viñeta descriptiva del algoritmo escrito por sus autores (véase algoritmo de https://github.com/daattali/ddpcr/blob/master/vignettes/. RMD para más detalles). Datos son exportados a archivos de valores separados por comas (FileName_Amplitude.csv) y subidos en el paquete de ddPCR para ser analizados directamente en R o a través de la interfaz web dedicada.

  1. Ajustes de parámetro
    Nota: Cada diseño de ensayo entrega resultados en distribuciones específicas gotita final y variaciones en la forma de nube, separaciones o posiciones es de esperarse. Para garantizar la eficiente Análisis automatizado, un conjunto de parámetros necesita ser ajustado. Si bien tiene un perfil de inesperada, puede causar el análisis de la placa entera no, resultando en un mensaje de error. La problemática también tendrá que ser identificado y extraído el análisis automatizado.
    1. Identificar pozos fallidos usando (REMOVE_FAILURES). Uso de TOTAL_DROPS_T (valor por defecto es 5.000) para ajustar el número mínimo de gotas en cada pozo. Uso de EMPTY_LAMBDA_LOW_T (valor por defecto es 0.3) y EMPTY_LAMBDA_HIGH_T (valor por defecto es 0.99) para ajustar las métricas que evalúen las nubes gota esperado (vacío, MUT, WT) y su calidad.
      Nota: Tener demasiadas gotas de vacías es un signo que no había plantilla suficiente amplificable en la reacción.
    2. Identificar gotas aislados usando (REMOVE_OUTLIERS). Uso de TOP_PERCENT (valor predeterminado es p = 1%) para ajustar el porcentaje de p superior de gotitas con el valor más alto de la señal en cada dimensión de la señal (FAM, VIC/HEX) de gotitas en toda la placa. Uso de CUTOFF_IQR (por defecto es 5) para ajustar el umbral de valores atípicos del porcentaje de p superior de señal más alto.
    3. Identificar vacías gotas usando (REMOVE_EMPTY). Usar CUTOFF_SD (el valor predeterminado es 7) para ajustar la desviación de estándar de la distribución de Gauss (vacío gotitas) baja de los valores de la sonda 1.
    4. Gotitas de puerta usando (clasificar). Usar CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD (el valor predeterminado es 3) para ajustar la desviación estándar de la distribución de Gauss (lleno de gotitas) mayor de los valores de la sonda 1. Usar ADJUST_BW_MIN (por defecto es 4) y ADJUST_BW_MAX (el valor predeterminado es 20) para ajustar los parámetros k_min y k_max para estimar la densidad del núcleo de los valores de la sonda 2 y discriminar la MUT y la nube de la WT de gotitas.
      1. Usar SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ (valor predeterminado es p = 1%) y SIGNIFICANT_P_VALUE (por defecto es s=0.01% nivel de significancia) para clasificar los pozos como mutante o wildtype.
        Nota: En este algoritmo, un mutante bien se define como teniendo un MAF que es significativamente más alto que p %.
  2. Análisis automatizado de
    Nota: Para cada parámetro se presentan en esta sección, los autores del paquete de ddPCR R tienen valores propuesto basados en su experiencia y sus datos. Sin embargo, todos los parámetros pueden modificarse para aumentar la calidad del análisis (figura 3).
    1. Identificar pozos fallidos.
      1. Utiliza cuatro indicadores de control de calidad (ajustes: REMOVE_FAILURES) para identificar pozos fallidos; el primero es el número mínimo de gotas que debe contener un pozo. Los otros tres se centran en la identificación de las poblaciones de candidato válido para vacío, posiblemente FAM + y HEX + VIC + gotas. Eliminar pozos que no cumplan con estos criterios de análisis de aguas abajo.
    2. Identificar las gotitas aislados.
      1. Para evitar sesgar la gotita que bloquean, quitar outliers (es decir, las gotas con un anormalmente alto valor HEX/VIC o FAM) de análisis estableciendo un umbral de límite superior (configuración: REMOVE_OUTLIERS).
    3. Identificar gotitas de vacías.
      1. Identificar vacías gotas para reducir la dimensión de los datos (en un pozo típico, representan para la mayoría de las gotas) y eliminar el sesgo estadístico debido a la presencia de una gran parte de información inútil siendo sólo que contiene la plantilla de gotas () configuración: REMOVE_EMPTY).
    4. Realizar gota gating.
      1. Clasificar las gotas restantes como mutante, wildtype o lluvia (ajustes: clasificar).
    5. Identificar las gotas de lluvia.
      1. Como gotas de lluvia resultan de amplificación ineficiente, excluir de la FAM + o HEX + VIC + nubes. Determinar las fronteras de sus racimos con sus valores de sonda 1 (ajuste: CLUSTERS_BORDERS_NUM_SD).
    6. Identificar a mutantes frente a gotas de tipo salvaje.
      1. Como el punto culminante del análisis de la discriminación entre plantillas de mutante y de tipo salvaje, identificar todas las gotas restantes en esta etapa uno o el otro. Puesto que deben tener valores similares de sonda 1, utilizar sonda 2 valores mejor predecir su naturaleza respectiva (configuración: ADJUST_BW_MIN y ADJUST_BW_MAX).
    7. Clasificar pozos como mutante versus tipo salvaje.
      1. Después de determinar que las gotas son MUT y peso, calcular el MAF. Utilizando la frecuencia de mutantes y un valor de p asociado de cada pozo, es posible clasificarlos (configuración: SIGNIFICANT_NEGATIVE_FREQ, SIGNIFICANT_P_VALUE) como peso (contiene sobre todo gotas de WT) o pozos MUT (contiene un número estadísticamente significativo de MUT gotitas).
  3. Explorar y exportar los datos
    1. Explorar y exportar los datos como número de gotitas, afloramientos, gotitas de vacías, las concentraciones o gráficos que pueden personalizarse aún más para la representación óptima.

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Resultados

En un estudio de prueba de concepto, mutaciones del exón 2 de KRAS (codones 12 y 13) y EGFR exón 19 eliminaciones fueron investigados en los tejidos FFPE y las muestras de plasma de pacientes con cáncer mediante la entrega ddPCR estrategia6.

La punta de prueba KRAS entrega interrogó a una región de bp 16 que abarca múltiples mutaciones en el exón 2 del gen KRAS , que al...

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Discusión

Para diseñar un ensayo de ddPCR de entrega eficiente, la optimización es crucial, y el protocolo debe seguirse cuidadosamente. Cada combinación de cebadores y sondas tiene un única eficiencia de reacción de PCR. Así, un ensayo individual tiene que ser cuidadosamente validado en muestras de control antes de ser utilizado en muestras de prueba valiosos. Optimización y validación son importantes para la detección de la señal de pico de certificar y evaluar sensibilidad y especificidad. Como se describe en el protocolo, toda...

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Divulgaciones

Varios autores llaman inventores de dos solicitudes de patente (EP17305920.5, EP18305277.8) relacionados con la detección de ctDNA.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Los autores también desean agradecer a Caroline Hego por su contribución al video.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo K2EDTA (código de color: lavanda)Los tubos BD367863EDTA se utilizan para obtener una muestra de sangre completa o plasma EDTA
Kit de ácido nucleico circulante QIAamp (protocolo manual)Qiagen55114Para el aislamiento de ADN circulante de libre circulación de plasma humano
QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (protocolo automatizado)Qiagen937556Para el aislamiento de ADN circulante libre a partir de plasma humano
Sistema QIAsymphony SPQiagen9001297sistema totalmente integrado y automatizado para la purificación de cfDNA, ADN o ARN
QIAvac 24 PlusQiagen19413Para la purificación de hasta 24 cfDNAs simultáneamente
Fluorímetro QubitInvitrogenQ33226El fluorómetro Qubit es un fluorómetro de sobremesa para la cuantificación de ADN
QX100 o QX200 lectorBio-Rad186-3003 o 186-4003, respectivamenteEl lector mide la intensidad de fluorescencia de cada gota y detecta el tamaño y la forma a medida que las gotas pasan por el detector
QX100 o QX200 generador de gotasBio-Rad186-3002 o 186-4002, respectivamenteInstrumento utilizado para la generación de gotas
C1000 termocicladorBio-Rad1851196Plataforma de termociclador modular, incluye chasis de termociclador C1000 Touch, módulo de reacción rápida de 96 pocillos
Selladorde placas Bio-Rad181-4000PX1™ Selladora de placas PCR
DG8 portacartuchosBio-Rad186-3051Coloca y sostiene el cartucho DG8 en el instrumento para la generación de gotas
Cartuchos y juntas generadoras de gotasBio-Rad186-4007Cartucho microfluídico DG8 utilizado para mezclar muestras y aceite para generar gotas; Las juntas DG8 sellan el cartucho para evitar la evaporación y aplicar la presión necesaria para la formación de gotas
Supermix de PCRBio-Rad186-3010supermix ddPCR para sondas (sin dUTP)
Placas de PCR de 96 pocillosEppendorf951020362Placas semifaldón de 96 pocillos
Junta de láminaBio-Rad181-4040Sellado térmico de lámina perforable
ddPCR Aceite lector de gotasBio-Rad186-3004aceite utilizado en la lectura
Generación de gotas Aceite para sondasBio-Rad186-3005aceite para generación de gotas
DNA loBind Tube 1,5 mLEppendorf0030 108.051Los tubos Eppendorf LoBind maximizan la recuperación de muestras al reducir significativamente la unión de la muestra a la superficie
Multiplex I cfDNA Reference Standard SetHORIZONHD780Los Estándares de Referencia de ADNcf Multiplex I son materiales de referencia altamente caracterizados y biológicamente relevantes que se utilizan para evaluar el rendimiento de los ensayos de ADNcf que detectan mutaciones somáticas
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L Tubos de ensayo Qubit LifeTechnologiesQ32856Los tubos de ensayo Qubit son 500 y micro; L Tubos de polipropileno de pared delgada para usar con el fluorímetro Qubit

Referencias

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