Aquí, presentamos un protocolo para cuantificar con precisión múltiples alteraciones genéticas de una región de destino en una sola reacción usando ddPCR de bajada y un único par de sondas de hidrólisis.
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Artículo de método
Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot
En este artículo
Resumen
Resumen
Reacción en cadena de polimerasa digital gota (ddPCR) es un método de reacción en cadena (PCR) alta sensibilidad cuantitativa de polimerasa basado en fraccionamiento de la muestra en miles de reacciones individuales de agua en aceite tamaño nanométrico. Recientemente, ddPCR ha convertido en uno de los instrumentos más precisos y sensibles para la detección de ADN (ctDNA) de tumor de circulación. Una de las principales limitaciones de la técnica de ddPCR estándar es el número limitado de mutaciones que pueden ser defendidos por reacción, como sondas de hidrólisis específica reconociendo cada versión alélica posible son necesarias. Una metodología alternativa, el ddPCR de entrega, aumenta el rendimiento, ya que requiere solamente un solo par de sondas para detectar y cuantificar potencialmente todas las alteraciones genéticas en la región específica. Entrega ddPCR muestra sensibilidad comparable a ensayos ddPCR convencional con la ventaja de detectar un mayor número de mutaciones en una sola reacción. Es rentable, conserva muestras preciosas y puede usarse como una herramienta de descubrimiento cuando las mutaciones se desconocen a priori.
Introducción
Miles de mutaciones somáticas relacionadas con el desarrollo de cáncer han sido reportados1. Entre éstos, algunos son marcadores predictivos de la eficacia de la terapia dirigida 2,3 y detección de estas mutaciones genética es la práctica clínica habitual ahora. Tecnología PCR (ddPCR) digital de la gotita puede utilizarse para monitorizar la presencia o la ausencia de mutaciones con precisión de detección alta y es altamente compatible con biopsias líquido no invasivos4,5. Sin embargo, ensayos de ddPCR actual están diseñados pri....
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Protocolo
El protocolo que presentamos sigue las pautas de ética del Instituto Curie. Todas las muestras humanas fueron obtenidas de pacientes inscritos, tras consentimiento informado, en estudios aprobado por la Junta de revisión institucional en el Instituto Curie.
1. recolección, almacenamiento de Plasma y extracción de ADN libre de células de la sangre
Nota: Se puede utilizar la DNA extraída de cualquier tipo de "tejido" (por ejemplo, parafina fresca o formaldehído-fija integrado tejidos (FFPE), las células en las muestras de cultura o de la sangre). Aquí proporcionamos instrucciones detalladas para recolección ....
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Resultados
En un estudio de prueba de concepto, mutaciones del exón 2 de KRAS (codones 12 y 13) y EGFR exón 19 eliminaciones fueron investigados en los tejidos FFPE y las muestras de plasma de pacientes con cáncer mediante la entrega ddPCR estrategia6.
La punta de prueba KRAS entrega interrogó a una región de bp 16 que abarca múltiples mutaciones en el exón 2 del gen KRAS , que al.......
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Discusión
Para diseñar un ensayo de ddPCR de entrega eficiente, la optimización es crucial, y el protocolo debe seguirse cuidadosamente. Cada combinación de cebadores y sondas tiene un única eficiencia de reacción de PCR. Así, un ensayo individual tiene que ser cuidadosamente validado en muestras de control antes de ser utilizado en muestras de prueba valiosos. Optimización y validación son importantes para la detección de la señal de pico de certificar y evaluar sensibilidad y especificidad. Como se describe en el protocolo, toda.......
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Divulgaciones
Varios autores llaman inventores de dos solicitudes de patente (EP17305920.5, EP18305277.8) relacionados con la detección de ctDNA.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Institut Curie SiRIC (grant INCa-DGOS-4654). Los autores también desean agradecer a Caroline Hego por su contribución al video.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo K2EDTA (código de color: lavanda) | Los tubos BD | 367863 | EDTA se utilizan para obtener una muestra de sangre completa o plasma EDTA |
| Kit de ácido nucleico circulante QIAamp (protocolo manual) | Qiagen | 55114 | Para el aislamiento de ADN circulante de libre circulación de plasma humano |
| QIAsymphony DSP Circulating DNA Kit (protocolo automatizado) | Qiagen | 937556 | Para el aislamiento de ADN circulante libre a partir de plasma humano |
| Sistema QIAsymphony SP | Qiagen | 9001297 | sistema totalmente integrado y automatizado para la purificación de cfDNA, ADN o ARN |
| QIAvac 24 Plus | Qiagen | 19413 | Para la purificación de hasta 24 cfDNAs simultáneamente |
| Fluorímetro Qubit | Invitrogen | Q33226 | El fluorómetro Qubit es un fluorómetro de sobremesa para la cuantificación de ADN |
| QX100 o QX200 lector | Bio-Rad | 186-3003 o 186-4003, respectivamente | El lector mide la intensidad de fluorescencia de cada gota y detecta el tamaño y la forma a medida que las gotas pasan por el detector |
| QX100 o QX200 generador de gotas | Bio-Rad | 186-3002 o 186-4002, respectivamente | Instrumento utilizado para la generación de gotas |
| C1000 termociclador | Bio-Rad | 1851196 | Plataforma de termociclador modular, incluye chasis de termociclador C1000 Touch, módulo de reacción rápida de 96 pocillos |
| Sellador | de placas Bio-Rad | 181-4000 | PX1™ Selladora de placas PCR |
| DG8 portacartuchos | Bio-Rad | 186-3051 | Coloca y sostiene el cartucho DG8 en el instrumento para la generación de gotas |
| Cartuchos y juntas generadoras de gotas | Bio-Rad | 186-4007 | Cartucho microfluídico DG8 utilizado para mezclar muestras y aceite para generar gotas; Las juntas DG8 sellan el cartucho para evitar la evaporación y aplicar la presión necesaria para la formación de gotas |
| Supermix de PCR | Bio-Rad | 186-3010 | supermix ddPCR para sondas (sin dUTP) |
| Placas de PCR de 96 pocillos | Eppendorf | 951020362 | Placas semifaldón de 96 pocillos |
| Junta de lámina | Bio-Rad | 181-4040 | Sellado térmico de lámina perforable |
| ddPCR Aceite lector de gotas | Bio-Rad | 186-3004 | aceite utilizado en la lectura |
| Generación de gotas Aceite para sondas | Bio-Rad | 186-3005 | aceite para generación de gotas |
| DNA loBind Tube 1,5 mL | Eppendorf | 0030 108.051 | Los tubos Eppendorf LoBind maximizan la recuperación de muestras al reducir significativamente la unión de la muestra a la superficie |
| Multiplex I cfDNA Reference Standard Set | HORIZON | HD780 | Los Estándares de Referencia de ADNcf Multiplex I son materiales de referencia altamente caracterizados y biológicamente relevantes que se utilizan para evaluar el rendimiento de los ensayos de ADNcf que detectan mutaciones somáticas |
| KIT DE ENSAYO QUBIT DSDNA HS, 500 | Life Technologies | Q32854 | El ensayo HS es altamente selectivo para el ADN bicatenario (dsDNA) sobre el ARN y está diseñado para ser preciso para concentraciones de muestra iniciales de 10 pg/& L a 100 ng/µ |
| L Tubos de ensayo Qubit Life | Technologies | Q32856 | Los tubos de ensayo Qubit son 500 y micro; L Tubos de polipropileno de pared delgada para usar con el fluorímetro Qubit |
Referencias
- Alexandrov, L. B., Nik-Zainal, S., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Amado, R. G., Wolf, M., et al. Wild-Type KRAS Is Required for Panitumumab Efficacy in Patients With Metastatic C....
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Reimpresiones y permisos
