Artículo de método

Proyección de imagen de tomografía multimodal bioluminiscente y emisión positrónica tomografía/computacional de xenoinjertos de médula ósea del mieloma múltiple en ratones NOG

DOI:

10.3791/58056

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7 de enero de 2019

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1Greater Los Angeles Veteran Administration Healthcare System, 2San Diego Veterans Administration Healthcare System, 3University of California, Los Angeles, 4Perkin Elmer

En este artículo

Resumen

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Aquí utilizamos bioluminiscente, rayos x y emisión de positrones la tomografía/computado tomografía la proyección de imagen para estudiar cómo inhibidor mTOR actividad impactos tumores mieloma engrafted de médula ósea en un modelo de xenoinjerto. Esto permite fisiológicamente relevantes, no invasivo y multimodales análisis del efecto anti-mieloma de tratamientos contra tumores mieloma médula engrafted en vivo.

Resumen

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Mieloma múltiple (MM) tumores engraft en la médula (BM) y su supervivencia y progresión dependen de complejas interacciones moleculares y celulares que existen dentro de este microambiente. Sin embargo el microambiente BM no puede ser fácilmente replicada en vitro, que potencialmente limita la relevancia fisiológica de muchos modelos experimentales in vitro y ex vivo . Estos problemas pueden ser superados mediante la utilización de un modelo de xenoinjerto en que luciferasa (LUC)-células transfected 8226 MM se engraft específicamente en el esqueleto del ratón. Cuando estos ratones se les da el sustrato apropiado, D-luciferin, los efectos del tratamiento sobre el crecimiento del tumor y la supervivencia pueden ser analizadas midiendo cambios en las imágenes bioluminiscentes (BLI) producida por los tumores in vivo. Estos datos BLI combinaron con tomografía de emisión positrónica/computacional análisis de tomografía (PET/CT) utilizando el marcador metabólico 2-deoxy - 2-(18F) fluoro-D-glucosa (18F-FDG) se utiliza para monitorizar los cambios en el metabolismo del tumor con el tiempo. Estas plataformas de proyección de imagen permiten varias mediciones no invasivas en el microambiente del tumor/BM.

Introducción

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MM es una enfermedad incurable de plasma maligno de células B que infiltran el BM y causar destrucción ósea, anemia, insuficiencia renal e infección. MM hasta 10% - 15% de todas las malignidades hematológicas1 y es el cáncer más frecuente participación del esqueleto2. El desarrollo de la m proviene de la transformación oncogénica de larga vida células plasmáticas que se establezcan en los centros germinales de los tejidos linfoides antes de finalmente autoguiado hacia el blanco a la BM3. El BM se caracteriza por nichos altamente heterogéneas; como críticos y diversos componentes celulares, regiones de baja pO2 (hipoxia), extensa vascularización, complejas matrices extracelulares y redes citocinas y factor de crecimiento, todos los cuales contribuyen al tumorgenesis MM4. Así, el desarrollo de un modelo de xenoinjerto MM diseminado caracterizado por tumores que son estrictamente engrafted en el BM sería una herramienta muy potente y clínicamente relevante para el estudio de MM patología en vivo5,6. Sin embargo, numerosos obstáculos técnicos pueden limitar la efectividad de la mayoría de las modelos de xenoinjerto, haciéndolos costosos y difíciles de aplicar. Esto incluye problemas relacionados con el engraftment tumor consistente y reproducible dentro del nicho de BM, un prolongado desarrollo del tumor, y limitaciones en la capacidad de observar y medir los cambios de crecimiento del tumor/supervivencia sin tener que directamente sacrificio de ratones durante el curso del experimento7,8.

Este protocolo utiliza un modelo de xenoinjerto modificado que fue desarrollado inicialmente por Miyakawa et al. 9, en el que un desafío (IV) intravenosa con células de mieloma produce tumores que engraft consistente y reproducible en la BM de NOD/SCID/IL-2γ(null) (NOG) ratones10"diseminada". La visualización en situ de estos tumores se logra mediante la transfección estable de la línea de celular MM humano 8226 con un alelo LUC y en serie, medir los cambios en el BLI producido por estas células tumorales implantada del6. Lo importante, este modelo puede ser ampliado para utilizar varias otras LUC-expresión humana MM líneas celulares (por ejemplo, U266 y OPM2) con una propensión similar a engraft específicamente en el esqueleto de los ratones NOG. La identificación de los tumores por imágenes bioluminiscentes de los ratones es seguida por la medición de la captación de radiofármacos sondas (como la 18F-FDG) por PET/CT. juntos, esto permite la caracterización adicional de crítica bioquímico vías (es decir, alteraciones en el metabolismo, cambios en la hipoxia y la inducción de apoptosis) en el microambiente del tumor/BM. Las principales fortalezas de este modelo se pueden destacar la disponibilidad de una amplia gama de sondas radiactivos, bioluminiscentes y fluorescentes y marcadores que pueden utilizarse para estudiar la progresión MM y patología en vivo.

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Protocolo

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Todos los procedimientos animales que se describe a continuación fueron aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la mayor Los Angeles VA Healthcare system y se realizaron bajo condiciones estériles y libre de patógenos.

1. preparación de 8226 células expresan luciferasa (8226-LUC)

  1. Mantener la línea celular humana de MM, 8226, en Medio RPMI-1640 suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y penicilina-estreptomicina de 1% a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenga 95% aire y 5% de dióxido de carbono (CO2).
  2. Generar células de reportero 8226 LUC-expresión estables de transferencia 1 x 106 8226 células con un vector reportero de luciferasa seguido de una selección con Higromicina (100-350 mg/mL) como ya describieron6.
  3. Mantener las células en condiciones estándar estéril cultivo durante 2-3 semanas, cambiando el medio día, hasta que se ha generado el establecimiento de una línea celular 8226 estable transfected.
  4. Confirmar la actividad de luciferasa en vitro en 1 x 106 transfectadas las células/100 μl de tampón fosfato salino (PBS) al agregar el sustrato de la luciferasa, D-luciferin (150 μg/mL solución de trabajo en medio de cultivo precalentado) y medir la bioluminiscencia de las células en un tubo de ensayo o una placa de 96 pozos utilizando un luminómetro6.

2. trasplante orthotopic del xenoinjerto modelo

  1. Mantener los ratones NOG (4-6 semanas edad, hombres o mujeres) bajo condiciones estériles patógeno-libre en un centro de atención animal.
  2. Preparar las células transfected LUC 8226 para inyección IV en los ratones NOG (~ 5 x 106 células/ratón) en el día del experimento. Lavar las células 3 x en PBS helado, contarlos y les vuelva a suspender en PBS helado (menos antibióticos y FBS) a una concentración final de 5 x 106 células/200 μL de PBS) en un tubo de ensayo estéril. Mantener las células en hielo y desafiar los ratones tan pronto como sea posible (dentro de 30-120 min).
  3. Anestesiar el ratón (con isoflurano, 1% - 3% en el aire a 0.5 - 1 L/min) y coloque el animal en una posición supina sobre una almohada con la cabeza hacia fuera. Compruebe el nivel de anestesia pellizcando el dedo del pie. Aplicar pomada oftálmica en los ojos.
  4. Inyectar las células LUC 8226 en los ratones a través de la vena de la cola (200 μL/inyección) usando una jeringa de insulina de 1 mL y una aguja de 26 G.
    Nota: Puede utilizarse una lámpara de calor para calentar la cola, de tal modo dilatación de la vena y aumentando la eficacia de las inyecciones.
  5. Regresar el animal a su jaula casera y vigilar los animales hasta que han recuperado plenamente.
  6. Confirmar el engraftment de células 8226-LUC en el esqueleto del ratón midiendo el BLI en ratones anestesiados (se describe a continuación y se muestra en la figura 1A).
    Nota: Exudados del BM también pueden manchados para la expresión de CD45 humano mediante citometría de flujo (figura 1B) o por inmunohistoquímica del hueso cosechado (figura 1).

3. medición de BLI en Vivo

Nota: Típicamente, BLI medible de engrafted tumores en ratones se observa primero entre 10-20 días postchallenge, pero esto puede necesitar ser determinado experimentalmente.

  1. Anestesiar el ratón (con isoflurano, 1% - 3% en el aire a 0.5 - 1 L/min) y controlar el nivel de anestesia pellizcando el dedo del pie. Aplicar ungüento oftálmico en sus ojos.
  2. Dar al animal una inyección de IP (200 μL/inyección) de "en vivo-grado" sustrato D luciferin (30 mg/mL diluido en solución salina estéril).
  3. Medir el BLI en 5-10 min, después de la inyección del sustrato luciferin (aunque la actividad BLI puede ser observable en los ratones hasta 45-60 minutos), colocando el animal anestesiado en posición supina en un sistema de proyección de imagen de pequeños animales (figura 2 ). Seleccione luminiscente y análisis de la radiografía y adquisición de imágenes (figura 3).
    1. Medir la luminosidad media (/steradian fotones/s/cm2) en las regiones de interés (ROIs) utilizando el software de proyección de imagen (figura 4).
    2. Devolver el animal a su jaula casera y vigilar hasta que haya recuperado completamente (aproximadamente 15-20 min).

4. tratamiento de los ratones con terapia dirigida

  1. Medir la línea base BLI y aleatorizar los animales en grupos de tratamiento (4-8 ratones/grupo).
  2. Tratar a los ratones con una inyección de IP (200 μL/inyección) de temsirolimus (0.2 - 40 mg/kg ratón) utilizando un régimen de cinco inyecciones diarias de IP seguido de 2 días de descanso y una inyecciones diarias cinco adicional11.
  3. Medir la actividad de luciferasa (/steradian fotones/s/cm2) 2 x por semana tal como se describe en la sección 3 y trama el cambio de la BLI en el tiempo. Cambios en tumor BLI puede presentarse como imágenes seriales de los ratones (figura 5B).
    Nota: Se recomienda que seguimiento diario de los animales se realizará hasta que presentan los siguientes síntomas (normalmente dentro de 45-60 días del reto inicial): peso (pérdida de más del 10% en relación con el peso antes de la implantación) o posteriores parálisis de miembro, momento en el cual debe sacrificados utilizando una cámara de CO2 seguida por dislocación cervical.

5. PET/CT análisis usando 18F-FDG para medir cambios en el metabolismo del Tumor

  1. Rápidamente los animales en su jaula casa quitando sus alimentos durante 24 h antes del experimento para evitar la excesiva absorción no específica de 18F-FDG.
  2. Preparar 18sondas PET FDG radiactiva F (50-100 μCi/inyección de solución salina estéril) en el día del experimento. Registrar el tiempo y la actividad de la sonda de 18F-FDG con un calibrador de dosis.
    Nota: 18F tiene una vida media relativamente corta (~ 2 h), una esmerada preparación y planificación para el uso de estas sondas deben ser establecidas.
  3. Anestesiar al animal (con isoflurano, 1% - 3% en el aire a 0.5 - 1 L/min) y coloque en una posición supina sobre una almohada con la cabeza hacia fuera. Compruebe el nivel de anestesia pellizcando el dedo del pie. Aplicar ungüento oftálmico en sus ojos.
  4. Inyectar la sonda a través de la vena de la cola (100 μl/inyección) usando una jeringa de insulina 1 mL blindado y una aguja de 26 G.
    Nota: Puede utilizarse una lámpara de calor para calentar la cola, de tal modo dilatación de la vena y aumentando la eficacia de las inyecciones.
  5. Mida la radiactividad residual en la aguja y jeringuilla en un calibrador de dosis y tenga en cuenta la actividad y el tiempo.
    Nota: La estandarización de la incubación de ratón, la dosis y el tiempo es esencial para asegurar la comparabilidad y reproducibilidad de los datos.
  6. Mantener los ratones bajo anestesia y a 37 ° C utilizando una almohadilla de calefacción durante todo el período de absorción de la punta de prueba (~ 45-90 min).
    Nota: Es importante que los ratones permanezcan quietos y a 37 ° C para evitar la absorción inespecífica de la sonda.
  7. Alterne las inyecciones de la sonda de 18F-FDG a ocurrir a intervalos de aproximadamente 20 - 30 min para veces Etiquetadoras similares en los ratones.
    Nota: Flujo de trabajo adecuado y el momento de las inyecciones sonda dará lugar a condiciones de proyección de imagen óptima y reproducibles.
  8. Medir la actividad de 18F-FDG en un sistema imagen de PET/CT de pequeños animales en las regiones de interés que corresponden a los tumores implantados (figura 6).
    Nota: Inicialmente, se recomiendan una exposición estática de PET de 10 minutos y una exposición de CT de 2 min, pero los tiempos de exposición exacto deba determinarse experimentalmente.
  9. Devolver los animales a sus jaulas hogar y controlarlos hasta que se recuperó completamente. Los ratones en un cuarto retorno dedicado 24 h mientras que la caries sonda a niveles de fondo de la casa.
    Nota: Debido a la corta vida media de 18F, mediciones múltiples usando una punta de prueba fresca pueden hacer tan con frecuencia como 2 x por semana.

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Resultados

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En estudios piloto iniciales, las inyecciones IV de células LUC 8226 en ratones NOD/SCID no desarrollaron tumores m m BM-engrafted, aunque forman squamous MM tumores eran fácilmente (100% de éxito). En cambio, desafíos IV con 8226 células en ratones NOG generan (dentro de 15-25 días) tumores en el esqueleto (y sólo raramente formados tumores en tejidos no esqueléticos, como el hígado o bazo). Puesto que los tumores en el esqueleto no se podían confirmar visualmente examinando físicamente ...

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Discusión

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A pesar de una gran variedad de modelos de xenoinjerto preclínica de MM6,9,11,12,13, la capacidad para el estudio de las interacciones del tumor/BM en el microambiente del BM sigue siendo difícil 14. las técnicas aquí descritas permiten el engraftment rápido y reproducible de las células de tumores 8226-LUC en el esqueleto de los ratone...

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Divulgaciones

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El autor Kevin Francis es un empleado de Perkin-Elmer.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por un grant1I01BX001532 de mérito VA desde los Estados Unidos Departamento de los veteranos asuntos laboratorio investigación biomédica y desarrollo servicio (BLRDS) y P.F., C.E. reconoce apoyo de la (VA ciencia clínica R & D servicio Merecen Premio I01CX001388) y rehabilitación VA R & D servicio (mérito Premio I01RX002604). Más apoyo vino de una donación de semillas Facultad de UCLA a J.K. Estos contenidos no representan necesariamente las opiniones de la nos Department of Veterans Affairs o el gobierno.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
8226 línea celular de mieloma humanoATCCCCL-155
NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Ratones (NOG)Jackson Labs5557
VivoGlo Sustrato de luciferinaPromegaP1041
Hypoxyprobe-1KitHPL HP1-100
PE-CD45 (clon H130)BD Biosciences555483Utilizado para la citometría de flujo para identificar células tumorales CD45+ humanas en exudado
BM conejo anti-humano CD45 (clon D3F8Q)Señalización celular Tecnología70527Anticuerpo primario utilizado para la inmunohistoquímica de hueso extirpado
IgG anti-conejo de cabra (HRP conjugado)ABCAMab205718Anticuerpo secundario utilizado para la inmunohistoquímica del hueso
extirpado Sistema de ensayo reportero de luciferasadual PromegaE1910
pGL4.5 Luciferasa Vector Reportero PromegaE1310
IVIS Lumina XRMS In Sistema de imagen VivoPerkin Elmer
Sofie G8 Sistema de imagen PET/CTPerkin Elmer

Referencias

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