En este artículo, nos proporcionan que un protocolo detallado para la expresión de proteínas fluorescentes de fusión en médula ósea murina derivados de macrófagos y células dendríticas. El método se basa en la transducción de la médula ósea progenitores con retrovirales construcciones seguidas de diferenciación en macrófagos y dendríticas de las células en vitro.
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Artículo de método
Expresión de proteínas fluorescentes de fusión en murinas médula ósea células dendríticas y macrófagos
En este artículo
Resumen
Resumen
Macrófagos y células dendríticas son células cruciales que forman la primera línea de defensa contra patógenos. También juegan papeles importantes en la iniciación de una respuesta inmune adaptativa. Trabajo experimental con estas células es más bien un desafío. Su abundancia en órganos y tejidos es relativamente baja. Como resultado, no puede ser aislados en grandes cantidades. También son difíciles de transfectar con construcciones de cDNA. En el modelo murino, estos problemas pueden superarse parcialmente por en vitro la diferenciación de progenitores de médula ósea en presencia de M-CSF para macrófagos GM-CSF de las células dendríticas. De esta manera, es posible obtener grandes cantidades de estas células de muy pocos animales. Por otra parte, progenitores de médula ósea pueden ser transduced con vectores retrovirales que construcciones de cDNA durante etapas tempranas del cultivo antes de su diferenciación en la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos. Por lo tanto, transducción retroviral seguida de diferenciación en vitro puede utilizarse para expresar diversas construcciones de cDNA en estas células. La habilidad de expresar proteínas ectópicas substancialmente amplía la gama de experimentos que se pueden realizar en estas células, incluyendo células vivas imágenes de proteínas fluorescentes, purificaciones de tándem para interactoma análisis, análisis de la estructura y función, seguimiento de las funciones celulares con biosensores y muchos otros. En este artículo, describimos un protocolo detallado para la transducción retroviral de murino la médula ósea derivada de células dendríticas y macrófagos con vectores que codifica para las proteínas con etiqueta fluorescente. En el ejemplo de dos proteínas, OPAL1 y PSTPIP2, demostramos su aplicación práctica en microscopia y citometría de flujo. También discutimos las ventajas y limitaciones de este enfoque.
Introducción
Las células mieloides representan una parte imprescindible de nuestros mecanismos de defensa contra patógenos. Son capaces de rápidamente eliminar microbios, así como las células moribundas. Además, también están involucrados en la regulación de la reparación y desarrollo de tejido y en el mantenimiento de la homeostasis1,2,3. Todas las células mieloides se diferencian de la común progenitores mieloides de la médula ósea. Su diferenciación en muchos subconjuntos funcionalmente y morfológicamente distintos es en gran parte controlada por citoquinas y sus diversas combinaciones....
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Protocolo
Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el Comité de expertos sobre bienestar de animales de experimentación del Instituto de Genética Molecular y por la Academia de Ciencias de la República Checa.
1. preparación del reactivo
- Preparar el tampón amonio cloruro de potasio (ACK). Añadir 4,145 g de NH4Cl y 0,5 g de KHCO3 a 500 mL de ddH2O, añada 100 μl de 0.5m ácido etilendiaminotetracético (EDTA) y esterilizar filtro.
- Preparar solución de polietilenimina (PEI). Añadir 0.1 g de PEI a 90 mL de ddH2O. Mientras que revuelve, agregue 1 M HCl gota a gota hasta que el pH ....
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Resultados
Proteínas señales son proteínas generalmente pequeñas sin ninguna actividad enzimática. Poseen varios dominios de interacción o motivos, que median la Unión a otras proteínas involucradas en transducción de señales, incluyendo tirosina quinasas, fosfatasas, ligasas de ubiquitina y otros21. Para la demostración de la funcionalidad de este protocolo se seleccionaron adaptadores de células mieloides PSTPIP2 y OPAL1. PSTPIP2 es una proteína bien caracterizada en la reg.......
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Discusión
La expresión de la proteína de interés en las células Diana es un paso clave en muchos tipos de estudios biológicos. Diferenciados de los macrófagos y las células dendríticas son difíciles de transfectar, transfección estándar y técnicas de transducción retroviral. Pasando por alto la transfección de las células diferenciadas con transducción retroviral de progenitores de médula ósea, seguido por la diferenciación cuando ya llevan la construcción deseada, es un paso crítico que permite la expresión de los cDNAs ectópico .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por Checa ciencia Fundación (GACR) (proyecto número 16-07425S), por Charles University Grant agencia (poesías) (número de proyecto 923116) y por fondos institucionales desde el Instituto de Genética Molecular de la Academia de Ciencias de la República Checa República (RVO 68378050).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | 15028 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU. | 10270 | Para la suplementación |
| de medios KHCO3 | Lachema, Brno, República Checa | N/A | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.) | A9434 | |
| Penicilina | BB Pharma AS, Praga, República Checa | N/A | PENICILINA G 1,0 DRASELNÁ SOL' BIOTIKA |
| Estreptomicina | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.) | S9137 | Polvo de sal de sulfato de estreptomicina |
| Gentamicina | Dr. Kulich Pharma, Hradec Krá lové, República Checa | N/A Polietilemina | |
| , lineal, MW 25,000 | Polyscience, Warrington, PA, EE. UU | . 23966 | |
| Polybrene | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.) | H9268 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, EE. UU.) | E5134 | |
| PBS | Preparado internamente por el centro de prensa de IMG ASCR, Praga, República Checa | N/A | |
| Anticuerpo CD11b anti-ratón/humano de APC, clon M1/70 | BioLegend (San Diego, CA, EE. UU. | )101212 | análisis de citometría |
| flujo PE anti-ratón F4/80 Anticuerpo, clon BM8 | BioLegend (San Diego, CA, EE. UU.) | 123110 | análisis de citometría |
| flujo APC anticuerpo CD11c de ratón APC, clon N418 | BioLegend (San Diego, CA, EE. UU.) | 117310 | análisis de citometría de flujo |
| M-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, EE. UU.) | 315-02 | |
| GM-CSF | PeproTech (Rocky Hill, NJ, EE. UU. | )315-03 | |
| Hoechst 33258 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU | H1398 | uso de análisis de citometría de flujo en 1-2 y micro; g/mL |
Referencias
- Moghaddam, A. S., et al. Macrophage plasticity, polarization and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. , (2018).
- Qian, C., Cao, X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inflammation. Seminars in Immunology.
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Reimpresiones y permisos
