Evaluación de respuestas de células T Zika Virus-específica en Immunoprivileged órganos de ratones- / - Ifnar1 infectados

Resumen

Se describe un protocolo para evaluar las respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1^{- / -} modelo murino para la infección del virus (ZIKV) Zika. Este método es fundamental para la investigación de los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis de las vacunas ZIKV y también es valiosa para la evaluación de su eficacia.

Resumen

El virus Zika (ZIKV) puede inducir inflamación en órganos de immunoprivileged (p. ej., el cerebro y los testículos), llevando al síndrome de Guillain-Barré y dañar los testículos. Durante una infección con el ZIKV, han demostrado las células inmunes para infiltrarse en los tejidos. Sin embargo, los mecanismos celulares que definen la protección o la inmunopatogénesis de estas células inmunitarias durante una infección ZIKV son todavía en gran parte desconocidos. Adjunto, describimos los métodos para evaluar la funcionalidad del T-cell de virus específicos en estos immunoprivileged órganos de ratones infectados por ZIKV. Estos métodos incluyen una) una infección ZIKV e inoculación de la vacuna en Ifnar1 ratones de^{- / -} ; b) histopatología, inmunofluorescencia y pruebas de inmunohistoquímica para detectar el virus de la infección y la inflamación en el cerebro, los testículos y bazo; c) la preparación de un tetrámero de epitopos del T-cell ZIKV derivados; d) la detección de células T específicas ZIKV en los monocitos aislados del cerebro, los testículos y bazo. Utilizando estos enfoques, es posible detectar las células de T específicas de antígeno infiltrados en los órganos immunoprivileged y evaluar las funciones de estas células T durante la infección: potencial protección inmune vía virus separación y inmunopatogénesis de y/o exacerbar la inflamación. Estos hallazgos también pueden ayudar a aclarar la contribución de las células T inducida por la vacunación contra ZIKV.

Introducción

El ZIKV es un flavivirus transmitido por mosquitos que se aisló por primera vez en 1947 en Uganda de un macaco rhesus febril. Recientemente, el ZIKV se ha convertido en una emergencia de salud pública, debido a su rápida difusión en las Américas y su inesperada relación con microcefalia y síndrome de Guillain-Barré síndrome^1,2,3. De datos epidemiológicos, la ZIKV ha sido sospechado ser la causa del síndrome de Guillain-Barré en alrededor 1 por 4.000 infectados adultos⁴. Además, una correlación entre el daño infección ZIKV y testículos en el modelo de ratón se ha demostrado, lo que sugiere que la infección por ZIKV, bajo ciertas circunstancias, puede saltarse la barrera del sangre-testis y eventualmente conducir a la infertilidad masculina⁵ . Estos resultados destacan la importancia de entender completamente la inducción de respuestas inmunes protectoras o patológicas durante una infección ZIKV.

Queda mucho por aprender acerca de las inmunorespuestas celulares a la ZIKV. CD4⁺ y CD8⁺ T-cell responses to la cápside, envoltura y proteína no estructural 1 (NS1) se han observado en infectados por ZIKV monos y seres humanos^6,7,8. En ratones, varios estudios han indicado que CD8⁺ T las células juegan un papel protector en el control de la replicación de ZIKV^9,10,11. Lo importante, Jurado et al demostró que una infección ZIKV resulta en la ruptura de la barrera hemato - encefálica y la infiltración perivascularia de CD8⁺ células efectoras T dentro de los testículos de ratones^{- / -} Ifnar1. Además, demostró que CD8⁺ T células propiciar parálisis asociadas ZIKV y parecen jugar un papel en el immunopathology del cerebro neonatal. En un estudio anterior, preparamos el tetrámero de_294-302 ZIKV-E y demostró que CD8 específicas ZIKV⁺ T las células existen en los cerebros y médulas espinales de los ratones^{- / -} Ifnar1 ZIKV infectados, que pueden tener importantes implicaciones para el diseño y desarrollo de ZIKV vacunas¹⁰.

En respuesta a la necesidad urgente de vacunación para prevenir la infección por ZIKV, varias vacunas están en la fase preclínica de desarrollo, incluyendo vacunas, vacunas basadas en vectores recombinantes y vacunas de subunidades de la proteína purificada de RNA. La vacuna de ADN de plásmido está en fase 1 ensayos clínicos¹². La evaluación de la seguridad y eficacia de las vacunas ZIKV es, por lo tanto, importantes. Una de las ventajas de las vacunas es su capacidad para obtener respuestas específicas del T-cell, que pueden ser importantes para la protección contra la ZIKV. Mediante el uso de tetrámeros de ZIKV T-células relacionadas con el epitopo, pudo detectarse el immunoreactivity de células T inducido por una vacuna ZIKV adenovirus vector basado en ratones inmunizados y glicoproteínas de M y E se demostró que inducen fuerte específica de antígeno CD8⁺ T-cell immunoreactivity¹³.

Durante una infección de virus, el reconocimiento de antígenos péptidos presentados por las moléculas de (MHC) complejo mayor de histocompatibilidad para el receptor de células T (TCR) es un mecanismo importante de mediada por células T para la protección de host¹⁴. Basado en esta teoría, tetrámero tecnología es una herramienta única para aclarar los roles que juegan las células T antígeno específicas en la regulación de la respuesta inmune¹⁵. Este protocolo describe el establecimiento del Ifnar1^{- / -} modelo de ratón para las infecciones ZIKV y la detección de las células T reactivas en el bazo, cerebro y testículos de los ratones mediante el uso de tecnología de tetrámero. Además, utilizamos el tetrámero de_294-302 ZIKV-E para detectar y evaluar immunoreactivity de células T inducido por una vacuna ZIKV (AdC7-M/E) en los ratones inmunizados. Este estudio proporciona una guía para la investigación de las respuestas de células T en immunoprivileged órganos y proporciona una referencia para las aplicaciones potenciales en la placenta o cerebro fetal.

Protocolo

Los experimentos en animales fueron aprobados por el cuidado de Animal institucional y Comité de Instituto Nacional de uso para Viral Disease Control and Prevention, CDC de China. Todos los experimentos fueron realizados siguiendo la institucional Animal Care y aprobado por el Comité de uso de protocolos animal.

1. virus de la infección

1. Mantenga adulto (6 a 8 semanas de edad) Ifnar1^{- / -} (50% hombres y 50% mujeres) ratones estándar libre de patógenos (SPF) las condiciones especiales y les permite acceso regular a alimentos y agua.
2. Infectar a los ratones Ifnar1^{- / -} con la ZIKV a través de una inoculación de retro-orbital de 100 μl de ZIKV en tampón fosfato salina (PBS) solución tampón que contiene 1 x 10⁴ enfoque unidades formadoras (FFUs) del virus. Del mismo modo, proporcionan control de ratones con un volumen igual de PBS.
   PRECAUCIÓN: Infectan a los ratones en ABSL2 condiciones y realizar estos procedimientos con ratones infectados con virus en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
3. Controlar el peso y signos clínicos (temblores, marcha escalonada, bilateral flácido extremidades) de los ratones diariamente durante 15 días.

2. inmunización con la vacuna ZIKV

1. Utilice Ifnar1 ratones^{- / -} (50% hombres y 50% mujeres) entre 6 y 8 semanas de edad. Mantener los ratones en condiciones estándar de SPF de 18 – 29 ° C y un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con acceso a agua y alimentos.
2. Inmunizar los ratones Ifnar1^{- / -} con la vacuna ZIKV: inyectar 100 μl de AdC7-M/E [4 x 10¹⁰ (partículas de virus)] en PBS tampón a través de una inyección intramuscular (la vía i.m.) utilizando una jeringa de 1 mL con una aguja de 23 G.
3. Inyectar del mismo modo, los ratones de control con un volumen igual de PBS.

3. aislamiento de los monocitos de bazo

Nota: El aislamiento de los monocitos de bazo se describe como se mencionó anteriormente¹⁶.

1. Anestesiar lo ratones vacunados e infectados por ZIKV d 7 post-inoculación, usando un concentrationin 5% de isoflurano 100% oxígeno (con un caudal de 1 L/min). Eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Entonces, inmediatamente sumergir el ratón entero en etanol al 75%.
   PRECAUCIÓN: de este paso adelante, todos los procedimientos experimentales deben realizarse asépticamente en un gabinete de bioseguridad.
2. Uso de agujas, fijar las extremidades de los ratones (eutanasia, previamente infectadas/inmunizar) en la placa de la espuma con el abdomen hacia arriba.
3. Cortar la piel a lo largo de la línea media abdominal en el tórax con un bisturí estéril, cortar los músculos abdominales con tijeras, exponer la cavidad abdominal y retire con cuidado el hígado.
   Nota: El órgano largo, de color rojo oscuro a la izquierda del estómago es el bazo.
4. Extirpar el bazo, enjuague 3 veces en PBS para quitar cualquier sangre y colocarlo en 1,5 mL de medio helada del Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Mantener el bazo en el hielo.
5. Para generar una suspensión unicelular de bazo, colocar el órgano en un estéril 40 μm-célula colador encima de un tubo de 50 mL y añadir 2 mL de helado RPMI medio con 10% suero bovino fetal (FBS). Utilizando el émbolo de una jeringa de 5 mL, mecánicamente el órgano de puré y añadir medio hasta que el órgano ha sido completamente a través de la malla.
6. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mL y centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
7. Resuspender las células con 5 mL de un tampón de lisis de glóbulos rojos (gr) (NH₄Cl, Na₂EDTA y KHCO₃; véase la Tabla de materiales) y se incuba la reacción de lisis a temperatura ambiente durante 5-6 min.
8. Detener la lisis RBC con 10 mL de Medio RPMI/FBS helada y centrifugar el tubo a 600 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
9. Resuspender las células con 10 mL de Medio RPMI completo (RPMI con 10% vol/vol FBS y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina). Transferir 10 μl de la suspensión de células a un tubo pequeño, mezclar con 10 μl de 0.4% wt/vol trypan azul y contar el número de células usando un hemocitómetro.

4. aislamiento de monocitos del cerebro y los testículos

1. Anestesiar lo ratones machos infectados por ZIKV d 7 post-inoculación, utilizando oxígeno al 100% isofluranein 5% (con un caudal de 1 L/min). Eutanasia a los ratones por dislocación cervical. Entonces, inmediatamente sumergir el ratón entero en etanol al 75%.
   PRECAUCIÓN: De este paso todos los procedimientos experimentales deben realizarse asépticamente en un gabinete de bioseguridad. El aislamiento de monocitos del cerebro y los testículos se describe como se mencionó anteriormente¹⁷.
2. Inmovilizar un ratón macho (eutanasia, previamente infectado) en la posición prona en una tabla de cortar.
3. Asegure el cuero cabelludo con una pinza recta de 1 x 2 dientes y utilizar tijeras de Iris para hacer una incisión del midline en el cuero cabelludo para exponer el cráneo.
4. Sujetar los dos lados de las órbitas con pinzas afiladas y fijar el cerebro. Coloque una punta de unas tijeras afiladas de Iris en la botella doble de agujero y cortar lateralmente en el cráneo. Repita este paso para el otro lado.
5. Uso agudo Iris tijeras para cortar con cuidado de la misma cavidad, hasta la línea media, hacia la nariz. Trate de mantener el extremo de las tijeras tan superficial como sea posible para evitar lesionar el cerebro.
6. Levante el cerebro con pinzas y tijeras Iris agudas para diseccionar cuidadosamente las fibras del nervio craneal. Quitar el cerebro con unas pinzas y colocar en un tubo de 15 mL que contiene 5 mL de medio de FBS RPMI/10% helada.
7. Agarrar la piel abdominal con pinzas y afiladas tijeras de Iris para hacer una incisión longitudinal a través del tegumento y de la pared abdominal y exponer la parte más inferior del abdomen. Empuje los testículos hasta la incisión. Suavemente tire la capa de grasa con las pinzas y exponer un testículo globular en ambos lados.
8. Tijeras de Iris fuerte uso para disecar cuidadosamente la capa de grasa y epidídimo. Coloque los testículos en un tubo de 15 mL que contiene 5 mL de medio de FBS RPMI/10% helada con fórceps.
9. Para generar una suspensión unicelular del cerebro o los testículos, colocar el órgano en un filtro estéril de la célula con una malla de 100 μm en la parte superior un tubo de 50 mL y añadir 2 mL de medio de FBS RPMI/10% helada. Utilizando el émbolo de una jeringa de 5 mL, el órgano de puré y añadir medio hasta que el órgano ha sido completamente a través de la malla.
10. Transfiera la suspensión a un tubo de 15 mL y centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
11. Resuspender las células con 5 mL de medio gradiente de densidad de 30% y, a continuación, agrega muy lentamente a 2 mL de 70% densidad gradiente medio en un tubo de 15 mL.
12. Desactivar el freno y centrifugar los tubos a 4 º C a 800 x g durante 30 minutos obtener los linfocitos de la capa media.
13. La interfase de transferencia a un nuevo tubo de 15 mL, añadir 10 mL de medio de FBS RPMI/10% frío y centrifugar el tubo a 300 x g durante 10 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
14. Resuspender las células con 10 mL de Medio RPMI/FBS helada y centrifugar a 600 x g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
15. Resuspender las células con 10 mL de Medio RPMI completo y cuente el número de células como en el paso 3.9.

5. tetrámero preparación

1. La construcción de plásmidos que expresan los dominios extracelulares de H-2D^b con una etiqueta de sitio biotinilado en el c-terminal del dominio α3 y la β₂m utilizando el vector de pET28a con un NdeI y XohI restricción sitio¹⁸.
2. Expresar y preparar los cuerpos de inclusión de H-2D^b y β₂m como se describió anteriormente²⁰.
3. Renature y purificar el péptido/MHC complejo H-2D^b-E_294-302.
   1. Preparar 200 mL de una solución de repliegue (100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 400 mM de L-arginina, 2 mM EDTA-Na, 5 GSG y 0,5 mM GSSG). Añadir inhibidores de la proteasa: 2 mL de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, stock 100 mM), 100 μl de pepstatin (stock 2 mg/mL) y 100 μl de leupeptin (stock 2 mg/mL). Enfriar el búfer a 4 ° C durante 30 minutos.
   2. Añadir^bH-2D, β₂m y el péptido a la solución de repliegue.
      1. Inyecte 500 μl de β₂m disuelto en una solución de guanidina (valores de 30 mg/mL) usando una jeringa. Para esto, utilice una aguja de 23 G con una jeringa de 5 mL e inyectar los β₂m en la solución de repliegue gota a gota. Mantener la solución lentamente y constantemente agitando a 150 rpm a 4 ° C.
      2. Después de β₂m se ha disuelto en la solución de repliegue, resolver 2 mg de péptido de_294-302 E en 200 μL de DMSO y rápidamente inyectar la solución de repliegue con una pipeta. Agitar lentamente la solución a 150 rpm a 4 ° C durante 15 minutos.
      3. Inyecta 1,5 mL de H-2D^b disuelto en una solución de guanidina. Mantener la rotación de barra agitación a 150 rpm para el refolding de la H-2D^b a 4 ° C por 8 a 10 h.
         Nota: La solución se colocó en una caja cerrada en una habitación fría.
   3. Concentrado de la proteína replegada en una cámara a presión con una membrana de kDa 10. Intercambiar el buffer (20 mM Tris-HCl (pH8.0), 50 mM NaCl) a la cámara y concentrado hasta un volumen final de 30-50 mL.
   4. Transferir la solución de repliegue a un tubo de centrífuga y centrifugar a 2.500 x g durante 15 min a 4 ° C.
   5. Cuidadosamente transfiera el sobrenadante a un filtro centrífugo de 10 kDa y además se concentran hasta un volumen final de 500 μl a 2.500 x g durante 30 minutos.
   6. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y vuelta a 12.000 x g durante 15 min purificar la proteína con S200 10/300 GL gel filtration cromatografía.
   7. Recoge el pico complejo de MHC y concentrado a un volumen final de 350 μl.
4. Para generar un volumen de reacción de 500 μl de Biotinilación, añadir los regentes en el siguiente orden: 100 μl de la solución A [0.5M bicina (pH 8.3)], 100 μl de la solución B (100 mM ATP, 100 mM MgOAc, 200 biotina µΜ), 100 μl de d-biotina extra (500 biotina µΜ) , 20 μl de enzima de BirA (60 μg), 0.5 μl de pepstatin (2 mg/mL) y 0,5 μl de leupeptin (2 mg/mL). Incubar el tubo de reacción durante la noche a 4 ° C.
   PRECAUCIÓN: No agregue ningún EDTA a la reacción de biotinylating.
5. Purificar el MHC usando un S200 columna de filtración de gel 10/300 GL para quitar cualquier biotina extra.
6. Determinar la eficacia de la biotinylating con un ensayo de estreptavidina-shift¹⁸.
   1. Preparar tres muestras, A, B y C, en el hielo durante 30 minutos. Luego, analizar los resultados por un 10% SDS-PAGE. Muestra A consta de 8 μl de las moléculas de MHC biotinilado y 2 μl de tampón de intercambio, muestra B de 8 μl de las moléculas de MHC biotinilado y 2 μl de estreptavidina (20 mg/mL) y muestra C de 2 μl de estreptavidina (20 mg/mL) y 8 μl de tampón de intercambio.
      PRECAUCIÓN: No hervir la muestra.
7. Forma Multímeros de las moléculas biotiniladas MHC.
   1. Producir tetrámero mezclando el biotinilado E_294-302 D péptido-H₂^b complejo con estreptavidina marcada con ficoeritrina en un ratio molar de 1:5 para un enlace completo de todas las moléculas de MHC biotinilado.
   2. Calcular la cantidad de conjugado estreptavidina-necesario para la tetramerización.
      1. Determinar los moles de los complejos MHC/péptido responsable de la concentración de proteína y el peso molar (ejemplo: 1,8 mg de proteína total = 40 nmol).
      2. Calcular los moles del conjugado estreptavidina necesitadas dividiendo los moles del MHC/péptido de 5 (ejemplo: 40/5 = 8 nmol de conjugado estreptavidina).
      3. Calcular la cantidad de estreptavidina (en μg) dependiendo el conjugado estreptavidina (ejemplo: estreptavidina-PE [300.000 g/M] → 8 nmol necesitada = 2.400 g).
   3. Streptavidin-ficoeritrina se dividen en 10 muestras. Añadir a cada muestra a un tubo que contiene el biotinilado E_294-302 D péptido-H₂^b complejo, con un intervalo de 20 minutos. Después de cargar la muestra pasada, incubar el tubo de reacción a 4 ° C durante la noche en la oscuridad.
8. Aplicar los reactivos multimerized en un tubo de centrifugado de 100 kDa y concentrar por centrifugación a 2.000 x g a 4 ° C hasta un volumen de < 100 μl.
9. Diluir la muestra en el tubo de vuelta a 4 mL con PBS (pH 8.0) y concentrar otra vez < 100 μl.
10. Repetir paso el cambio de tampón PBS (pH 8.0) x 4.
11. Llenar el volumen total otra vez a 500 μl con PBS (pH 8.0). Concentrar la muestra a una concentración estimada de 2 – 2,5 mg/mL a 2.000 x g a 4 ° C. Almacenar la muestra en la oscuridad a 4 ° C.

6. flujo Cytometry

1. Incubar las suspensiones de la célula (de paso 3.9 o paso 4.15) a 4 ° C con 0.1 μl del anti-murino CD16/CD32 Fc-receptores bloqueo reactivo por 20 μl (1: factor de dilución de 200) durante 10 min, para evitar cualquier unión inespecífica.
2. Centrifugar el tubo de tetrámero a 20.000 x g durante al menos 15 min a 4 ° C.
3. Añadir 20 μl de la suspensión celular a un platecontaining de 96 pocillos 1 x 10⁶ células cada uno bien.
4. Preparar un volumen suficiente de la mezcla de tetrámero E_294-302 a manchar todos los tubos experimentales. Preparar un exceso del 15% del volumen total de esta mezcla en cuenta errores de pipeteo. Diluir los tetrámeros E_294-302 (2 mg/mL, 1 μl/prueba) en tampón FACS (PBS, 0,5% FBS) por lo que se añade 20 μl de la mezcla de tetrámero E_294-302 a cada prueba.
5. Añadir 20 μl de la mezcla de tetrámero E_294-302 a la placa de 96 pocillos. Al final de este paso, el volumen final en cada pozo debe ser 40 µL.Incubate la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos.
6. Añadir anticuerpos primarios (conjugados con FITC o conjugado con APC anti-CD3 (0,2 mg/mL), conjugado con PerCP anti-CD8 (0,2 mg/mL)) a 1 μl/prueba para la suspensión de células y, luego, lo incube a 4 ° C por 30 min en la oscuridad.
7. Lavar las células 2 x con 2 mL de tampón FACS y centrifugar a 600 x g por 5 min cuidadosamente aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 200 μL de tampón FACS.
8. Almacenar las muestras temporalmente a 4 ° C en la oscuridad hasta el análisis cytometric del flujo.
9. Utilice la siguiente estrategia bloquea para el análisis cytometric del flujo.
   1. Crear una puerta en camisetas diagonal agrupados mediante el trazado de un área de scatter (SSC) de forward scatter (FSC) versus lateral.
   2. La puerta luego, el CD3⁺ de las células por lado scatter (SSC) versus CD3; a continuación, la entrada al CD3⁺ CD8⁺ de las células; por último, esbozar CD8⁺ tetrámero⁺ células¹⁹.

7. histopatología, inmunofluorescencia y ensayo inmunohistoquímico

1. Análisis de la histopatología
   1. Recoger los tejidos cerebrales y testículo del Ifnar1 infectados por ZIKV^{- / -} ratones 7 días post-inoculación y fijar en formol tamponado neutro 4%.
      PRECAUCIÓN: paraformaldehido es tóxica; Use equipo de protección personal.
   2. Incrustar el tejido en parafina.
   3. Sección de tejido en 5 mm con un vibratome.
   4. Teñir el tejido con hematoxilina y eosina (H & E).
2. Ensayo inmunohistoquímico
   1. Desparafinizar, rehidratar y antígeno-recuperar el tejido de las secciones, según los procedimientos describen²¹.
   2. Tratar los cortes de tejido con 3% H₂O₂ en PBS (pH 7.6) por 10 min y bloquearlos con 1% albúmina sérica bovina (BSA) durante 10 minutos.
   3. Incubar las secciones de tejido con el anticuerpo de rata anti-ratón CD3 (dilución: 1/1.000) durante 8 h a temperatura ambiente y, luego, les incube a 4 ° C durante la noche.
   4. Lavar los tejidos con PBS y, luego, los Incube con 3 gotas de anticuerpo secundario biotinilado (dilución: 1/1.000) durante 2 h a temperatura ambiente, seguido de 3 gotas de avidina-biotina-peroxidasa (dilución: 1/200) a temperatura ambiente durante 30 minutos.
   5. Enlazar, con 3 gotas de 30, tetrahydrochloride 30-diaminobenzidina (dilución: 1/1.000), como se describió anteriormente²².
   6. Contratinción las secciones de tejido con hematoxilina de Mayer.
3. Análisis de la inmunofluorescencia
   1. Deje secar al aire las secciones de testículo congelado (6 mm) por 10 min a temperatura ambiente.
   2. Fijar con acetona fría durante 10 minutos.
   3. Lávese las secciones con PBS para x 3 y bloquearlos con un tampón de bloqueo (1% de BSA, 0.3% Tritón, 1 x PBS) a 37 ° C durante 30 minutos.
   4. Incubar las secciones de tejido con anticuerpo primario (Z6) (20 μg/mL) a 4 ° C durante la noche.
   5. Enjuaga los tejidos con PBS y aplica el anticuerpo secundario (factor de dilución: 1/200) por 1 h a 37 ° C.
   6. Lávese las secciones de tejido con PBS y contratinción para núcleos con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (factor de dilución: 1/1.000), siguiendo las instrucciones del fabricante.

Resultados

A raíz de estos métodos, hemos desarrollado un modelo murino para infecciones por ZIKV. Ifnar1^{- / -} ratones en 6 – 8 semanas de edad fueron infectados con 1 x 10⁴ enfoque formando unidades (FFU) de la ZIKV por inyección retroorbital. Síntomas patológicos y signos (figura 1A), así como cambios de peso (figura 1B), se observaron en los ratones Ifnar1^{- / -} después de una infección con el ZIKV. El cerebro murino mostró evidente edema e hiperemia (figura 1C). Mientras tanto, los testículos se contrajeron gradualmente (figura 1D). Además, se encontraron cambios patológicos y la destrucción del tejido en el cerebro y los testículos (figura 2A). Se realizó un análisis de la inmunofluorescencia para detectar la ZIKV en el cerebro y los testículos (figura 2B). Cargas virales elevadas fueron detectadas en el cerebro y los testículos por inmunotinción (figura 2B). Immunohistochemistry demostró una infiltración sólida de CD3⁺ T las células en el cerebro de ratones después de la infección con el ZIKV (figura 2C).

Para detectar y evaluar respuestas específicas ZIKV T-cell, preparamos un ratón MHC-I tetrámero de_294-302 - E H-2D^b. El péptido E_294-302 puede ayudar a la renature de^b H-2D correctamente y producir una alta cantidad de MHC soluble-I (figura 3A). En el análisis del cambio, se pudo observar una alta eficiencia en Biotinilación (figura 3B). Posteriormente, tres fluorescencia estreptavidina (APC, el PE y BV421) - tagged pMHC - I tetrámeros fueron producidos para detectar células de T específicas ZIKV (figura 3C). El tetrámero PE-labeled tuvo una mayor eficacia para detectar el CD8 específicas⁺ la célula de T en comparación con los tetrámeros de APC y etiquetados como BV421, aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa.

Usando el tetrámero de_294-302 E, detectamos los linfocitos T específicos ZIKV en el bazo de los ratones infectados por citometría de flujo en inoculación después de 7 d de ZIKV (3,49 ± 0,45%). También, similar al método descrito en la sección 3 del presente Protocolo, con la inmunización después de 4 semanas de la vacuna AdC7-M/E, los linfocitos T específicos ZIKV fueron detectados en el bazo (6,89 ± 1,36%) (Figura 4).

Además, se detectaron los linfocitos infiltrados en los órganos de immunoprivileged, como el cerebro y los testículos, después de la infección ZIKV. Las puertas fueron fijadas para seleccionar para CD3⁺CD8 células⁺ T en linfocitos totales del cerebro y los testículos. Un alto cociente de las E_294-302 tetrámero específicos de células T se podía detectar en el cerebro (42.2% en CD3⁺CD8⁺ T las células) y el testicular (26,4% en CD3⁺CD8⁺ T células) linfocitos (figura 5).

Figura 1 : Caracterización de la infección por ZIKV en Ifnar1 ratones^{- / -} . Ifnar1^{- / -} ratones en 6 – 8 semanas de edad fueron infectados con 10 unidades formadoras de foco⁴ (FFU) de la ZIKV por inyección retroorbital y ratones inyectados con PBS fueron utilizados como controles no infectados. La morfología (A) y (B) cambios de peso de Ifnar1^{- / -} ratones infectados fueron supervisados. Las flechas rojas indican Ifnar1^{- / -} ratones presentadas con myeloparalysis y motor paraparesis después de la infección. Se cosecharon los cerebros (C) a la inoculación posterior de 7 d y testículos (D) 0, 7, 14 y la inoculación después de 30 días. Imágenes representativas del cerebro y los testículos de los ratones se muestran con una regla para indicar los tamaños. Las barras de error representan la media ± SEM. n = 10 ratones por grupo por experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Detección de los linfocitos en el cerebro y los testículos de ratones^{- / -} infectados por ZIKV Ifnar1 y ZIKV. (A) este panel muestra los cambios histopatológicos en el cerebro y los testículos de los ratones infectados por ZIKV comparados con controles negativos en post-inoculación d 7. Barra de escala = 25 μm (panel izquierdo) y 50 (panel derecho). (B) una inmunofluorescencia análisis fue realizado con el anticuerpo de Z6 anti-ZIKV (verde). Se recogieron todas las muestras de tejido de ratones infectados por ZIKV post-inoculación d 7. Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. (C) inmunohistoquímica muestra una fuerte infiltración de CD3⁺ T las células en el cerebro y los testículos. Barra de escala = 25 μm (panel izquierdo) y 50 (panel derecho). Púrpura indica hematoxilina, brown representa los anticuerpos CD3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Preparación de pMHC ZIKV-específico-I tetrámeros. (A) la Unión de E_294-302 H-2D^b es aclarada por una en vitro refolding. Azul indica que la proteína de_294-302 - E H-2D^b. Naranja representa el control negativo sin péptido. (B) este panel muestra el ensayo de cambio_294-302 - E de H-2D^b. (C) la falsa representa un control de PBS. Tres fluorescencia de estreptavidina (APC, el PE y BV421) - tagged pMHC - I tetrámeros fueron utilizados para detectar las células de T específicas ZIKV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Flujo de análisis cytometric del CD8 específicas de virus ⁺ Las células T en el bazo de ratones infectados por ZIKV y vacunados vacuna. Ifnar1^{- / -} ratones en 6-8 semanas de edad fueron infectados o con 10 unidades formadoras de foco⁴ (FFU) de ZIKV o recibieron una dosis única de 4 x 10¹⁰ partículas virales de AdC7-M/E o PBS como control negativo. Después de 7 días post-infección o vacunación después de 4 semanas, esplenocitos de ratón fueron cosechadas y analizadas por citometría de flujo. Los datos se presentan como media ± SD. estadístico análisis se realizó mediante ANOVA unidireccional (no significativa: P > 0,05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ***P < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Figura 5 : Compuerta resultados estrategia y representante de CD8 específicas de virus⁺ T las células en el cerebro y los testículos de ratones infectados por ZIKV. Parcelas representativas se muestran para los linfocitos infiltrados en (A) el cerebro y (B) del testículo. Se establece una sucesión de puertas para seleccionar linfoide-⁺ de dispersión y CD3⁺ eventos. De estos, CD8⁺ eventos son bloqueados para el análisis de linfocitos T específicos del epítopo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 

Discusión

Inmunogénica epitopo de célula de T juega un papel importante en inmunidad celular contra patógenos²³. Así, la detección de células T específicas ZIKV en órganos immunoprivileged es una metodología crítica para entender las respuestas de células T contra la infección natural por ZIKV. Mientras tanto, la detección de la respuesta de células T es una excelente herramienta para investigar la eficacia de la vacuna viral. A continuación, os mostramos un protocolo integral para visualizar los experimentos, que incluyen el aislamiento de los linfocitos del bazo, cerebro y testículos de ratones infectados por ZIKV, la preparación de la inmunodominante del epítopo E_294-302 tetrámero y la reconocimiento de CD8 específicas ZIKV⁺ T las células en los órganos de ratones infectados por ZIKV immunoprivileged.

Un estudio anterior demostró que puede detectarse un ZIKV vivo o su ARN en el semen de pacientes masculinos, que indica que el ZIKV puede saltarse la barrera del sangre-testis y replicar a sí mismo en el sistema reproductivo²⁴. Previamente, demostramos que el ZIKV puede dañar los testículos y conducen a la infertilidad masculina en ratones²⁵. ZIKV infección puede conducir a viremia en monos rhesus, y el ARN viral puede ser detectado en el sistema nervioso central (SNC), así como en los órganos viscerales. Immunohistochemistry reveló que antígenos específicos ZIKV se presentaron en el SNC y órganos periféricos múltiples²⁶. También, en modelos murinos, infección por ZIKV puede inducir un robusto antivirus CD8⁺ respuesta de la célula de T en el bazo y el CNS²⁶.

En comparación con trabajos anteriores, este estudio establece métodos sistemáticos para la detección específica ZIKV CD8⁺ T-cell las respuestas en el cerebro y los testículos, que son sitios de immunoprivileged. Es importante evaluar la funcionalidad de las células en los órganos de immunoprivileged de los ratones infectados por ZIKV virus-específica. El uso de tetrámeros para detectar CD8 específicas ZIKV⁺ T-cell respuestas en órganos immunoprivileged mejoraría grandemente nuestra comprensión de las infecciones ZIKV y sus anfitrión inmunorespuestas. Usando el tetrámero de_294-302 E, virus específicos de células T en cerebro y testículos pueden aislarse mediante citometría de flujo, para investigar los mecanismos celulares de la protección y la inmunopatogénesis durante una infección ZIKV. Mientras tanto, es útil para los investigadores investigar más a fondo las funciones de los CD8⁺ T de las células para controlar el ZIKV, o para mejorar la inmunopatogénesis en estos órganos durante la infección ZIKV.

Para analizar el CD8 murino específica de antígeno⁺ T-cell las respuestas en los órganos immunoprivileged, preparamos tetrámero de_294-302 - E H-2D^by detectado el CD8⁺ T las células mediante citometría de flujo. Tetrámeros son una poderosa herramienta para detectar células de T específicas de antígeno. Aquí, se generaron tres tipos de fluorocromo conjugado estreptavidina (APC, el PE y BV421). Aunque no hay diferencias estadísticamente significativas en la APC, BV421 y tetrámeros marcado con PE para la detección de antígenos específicos de células T, pMHC marcado con PE-I tetrámeros rindieron los mejores resultados. Por lo tanto, el tetrámero marcado con PE se utilizó en este estudio. Curiosamente, en el tetrámero de_294-302 - E marcado con PE H-2D^bbase, detectamos proporciones elevadas de linfocitos T antígeno específicos en el cerebro y los testículos, que indican la capacidad de migración de las células de T del virus-específica de la sangre a órganos de immunoprivileged.

Sin embargo, existen algunas limitaciones en el protocolo. El tetrámero de_294-302 - E H-2D^bno es útil para la detección de células T humana, porque detección tetrámero es dependiente sobre restricción de MHC. La investigación de péptidos HLA restringida inmunodominante es necesario. Además, retro-orbital infección es eficaz para una infección por ZIKV pero podría no ser una operación conveniente para algunos investigadores. Así, otras vías de infección, incluyendo peritoneal, subcutánea o intravenosa, se recomiendan también.

En el protocolo descrito aquí, un paso fundamental es el aislamiento de monocitos de cerebro y testículos. Es importante adquirir alta calidad linfocitos; por lo tanto, es importante prestar atención a, por ejemplo, la velocidad centrífuga, la fuerza del tejido pulido y la disección de los tejidos del cerebro y testículos. Además, para la preparación de tetrámero, inhibidores de la proteasa (PMSF, pepstatin, leupeptin) son útiles cuando protege la degradación de una proteína. Por lo tanto, tiene sentido añadir un inhibidor de proteasa en el búfer de repliegue y cambiar el búfer durante el proceso de la preparación del tetrámero.

En conclusión, presentamos los métodos de detectar respuestas de células T antígeno específicas en los órganos de immunoprivileged del Ifnar1^{- / -} modelo de ratón para una infección por ZIKV. Esta plataforma puede ser ampliamente aplicada para investigar los mecanismos inmunes de emergentes y re-emergentes virus que pueden saltarse las barreras entre la sangre y los órganos immunoprivileged. Por otra parte, este estudio puede allanar el camino para el futuro desarrollo de candidatas a vacunas e inmunoterapias.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Z6	nuestro laboratorio		Ma W, Li S, Ma S, et al. El virus del Zika causa daño en los testículos y provoca infertilidad masculina en ratones. Celda, 2016, 167: 1511-1524 e1510
CD3 Santa	Cruz	sc-1127; RRID: AB_631128
Affinipure Conjued con fluoresceína Cabra anti-humano IgG(H+L)	ZSGB-BIO	ZF-0308
Conejo Anti-Cabra IgG, FITC Conjugado		CWBIO CW0115
FITC anti-ratón CD3	Biolegend	17A2
APC anti-ratón CD3	Biolegend	100236
PerCP anti-ratón CD8a	Biolegend	100732
Percoll	GE Healthcare	P8370
PMSF	Ameresco	0754-5G	Reactivo tóxico y corrosivo. Manéjelo con cuidado
Streptadivin	BD	S4762-FZ	Proporciona una solución clara a 10 mg / ml en PBS y   almacenado a -20   C
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG	5 mg en 2,5 mL DMSO, alícuotas almacenadas a -20 º C
Leupeptina	Sigma	L8511	5 mg en 2,5 mL dH2O, alícuotas almacenadas a - 20 º
Péptido	Scilight-peptide		Debe ser resuspendido en DMSO y almacenado a -20 ° C
RPMI 1640	Hyclone	SH30809.01	Debe almacenarse a 4 & grados; C
DMSO	MP		Almacenar a temperatura ambiente.
APC-Streptadivin	BD	554067	Debe almacenarse y mantenerse en 4 °C. No congelar.
FITC-Streptadivin	BD	554060	Debe almacenarse y mantenerse en 4 °C. No congelar.
PE-Streptadivin	BD	554061	Debe almacenarse y mantenerse en 4 °C. No congelar.
BV421-Streptadivin	BD	563259	Debe almacenarse y mantenerse en 4 °C. No congelar.
PageRuler Escalera de proteínas sin teñir	Thermo Fisher Scientific	26614	Debe almacenarse a 4 & grados;
Filtros de celdas	BF	BF10-5040	Almacenar a temperatura ambiente.
Amicon Ultra 100 kDa	Millipore UFC510024		Conservar a temperatura ambiente.
Ultracentrífuga	Thermo Fisher Scientific
de flujo FACS Cantol			debe contener láseres y filtros que sean compatibles con el panel de tinción utilizado.
Superdex 200 Aumento 10/300 GL	GE healthcare	28990944
AKTA PURE	GE healthcare
tampón de lisis de glóbulos rojos	Solarbio	R1010	Almacenar a 4 °C.