Analizar el tamaño, forma y direccionalidad de las redes de astrocitos acoplados

Summary

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la organización de redes astrocytic. El método descrito minimiza el sesgo para proporcionar medidas descriptivas de estas redes como recuento de células, el tamaño, zona y posición dentro de un núcleo. Anisotropía es evaluada con un análisis vectorial.

Abstract

Se ha vuelto cada vez más claro que los astrocitos modulan la función neuronal a nivel sináptico y unicelulares, sino también en el nivel de red. Los astrocitos están fuertemente conectados entre sí mediante uniones comunicantes y acoplamiento a través de estas uniones es dinámica y altamente regulada. Un concepto emergente es que funciones astrocíticos son especializadas y adaptadas a las funciones del circuito neuronal que se asocian. Por lo tanto, se necesitan métodos para medir diversos parámetros de redes astrocytic mejor describir las reglas que rigen la comunicación y el acoplamiento y entiendo sus funciones.

Aquí, usando el software de análisis de imagen (por ej., ImageJFIJI), se describe un método para analizar imágenes confocales de redes astrocytic reveladas por el acoplador de tinte. Estos métodos permiten 1) una detección automatizada y objetiva de las células marcadas, 2) cálculo del tamaño de la red, 3) cálculo de la orientación preferencial de tinte extendido dentro de la red y 4) reposición de la red dentro del área de interés .

Este análisis puede usarse para caracterizar astrocytic redes de un área en particular, comparar redes de diferentes áreas asociadas a diferentes funciones o comparar redes obtenidas en condiciones diferentes que tienen diferentes efectos en el acoplamiento. Estas observaciones pueden llevar a consideraciones funcionales importantes. Por ejemplo, se analizan las redes astrocíticos de un núcleo del trigémino, donde previamente hemos demostrado que acoplamiento astrocytic es esencial para la capacidad de las neuronas cambiar sus patrones de disparo de tónica a estallido rítmico¹. Midiendo el tamaño, el parto y la orientación preferencial de redes astrocytic en este núcleo, podemos construir hipótesis sobre dominios funcionales que circunscriben. Varios estudios sugieren que varias otras áreas del cerebro, incluyendo corteza de barril, oliva superior lateral, glomérulos olfativos los núcleos sensoriales en el tálamo y la corteza visual, por nombrar algunos, pueden beneficiarse de un análisis similar.

Introduction

Muchos estudios han descrito cómo el diálogo astrositos neurona a nivel subcelular o sináptico puede tener implicaciones en las funciones neuronales y transmisión sináptica. Está bien establecido que los astrocitos son sensibles a los que rodean la actividad neuronal; de hecho, tienen receptores para muchos neurotransmisores como glutamato, GABA, acetilcolina y ATP (ver comentarios anteriormente publicados^2,3,4). A cambio, astrocytic procesos elementos sinápticas ensheath y actividad neuronal influencia allí y en los sitios extrasinápticos regulación de la homeostasis iónica ....

Protocol

Todos los procedimientos de morada por el Reglamento de los institutos canadienses de investigación en salud y fueron aprobados por el Comité de uso y cuidado Animal de la Universidad de Montreal.

1. preparación de rodajas de cerebro de rata

1. Preparar 1 L de una solución de sacarosa (tabla 1) y 1 L de líquido cerebral espinal artificial estándar (aCSF) (tabla 2).
2. La burbuja de la solución de sacarosa con una mezcla de 95% O₂ y 5% CO₂ (carbogen) por 30 min antes de colocar de-80 ° C durante 30 minutos, hasta que la solución esté fría pero no totalmente congelado. Util....

Results

Acoplamiento entre las células del cerebro no es estático sino más bien dinámica regulada por muchos factores. Los métodos descritos fueron desarrollados para analizar redes astrocytic reveladas bajo diferentes condiciones y entender su organización en NVsnpr. Estos resultados han sido ya publicados¹. Realizamos la biocitina relleno de astrocitos individuales en la parte dorsal de la NVsnpr en tres condiciones diferentes: en reposo (en condiciones control en ausenc.......

Discussion

Existe un número de métodos electrofisiológicos para evaluar funcional acoplamiento entre astrocitos^23,24. Sin embargo, estos métodos no proporcionan información sobre el arreglo anatómico astrocytic redes. Varios estudios ya han demostrado que "colorante o trazador-acoplamiento", como aquí, se produce sólo en una fracción de junto a las células que se detectan por métodos electrofisiológicos^25,26,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Productos químicos para pescadores	S671-3
KCl	Productos químicos para pescadores	P217-500
KH2PO4	Productos químicos para pescadores	P285-500
MgSO4	Fisher Chemicals	M65-500
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500
C6H12O6 Dextrosa anhidra	Fisher Chemicals	D16-500
CaCl2 dihidratado	Sigma	C70-500
Sacarosa	Sigma	S9378
Ácido D-glucónico sal de potasio	Sigma	G45001
MgCl2 anhidro	Sigma	M8266
HEPES	Sigma	H3375
EGTA	Sigma	E4378
ATPTris Salt	Sigma	A9062
GTPTris Salt	Sigma	G9002
Biocytin	Sigma	B4261
Sal disódica de carbenoxolona	Sigma	C4790
Complejo avidina-biotina : Kit ABC	Laboratorios Vestor	PK-4000
Streptavidina-alexa 594	Sondas moleculares	S11227
Triton	Fisher Chemicals	BP151-500
Xileno	Fisher Chemicals	X5-1
Medio de montaje acuoso 1 : Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
de montaje de resina sintética a base de tolueno : Permount	Fisher Chemicals	SP15-100
Banco de secado de portaobjetos	Fisherbrand	11-474-470
Vibratome	Leica	VT 1000S
Cubreobjetos de microscopio	Fisherbrand	12-544A
Portaobjetos de microscopio ColorFrost	Fisherbrand	12-550-413
PFA	Fisherchemicals	04042-500
Olympus FluoView FV 1000 Microscopio confocal	Olympus
40X Olympus 40X	Olympus	LUMPLFLN40XW
4X Olymp	XLFLUOR4X		us
4X Micropipeta tirador	Sutter Instrument	P97
Micromanipulador	Sutter Instrument	MP 225
Cámara CCD	Sony	CX-ST50
Monitor en blanco y negro	Sony	SSM-125
Digidata	Molecular devices	1322A
Patch Clamp	Axon instrument	Mulitclamp 700A
Software de adquisición de electrofisiología	Dispositivos moleculares	pClamp 8
Software de análisis de electrofisiología	Dispositivos moleculares	Clampfit 8
Software de análisis de imágenes	ImageJFIJI	Software de código abierto. Versión FIJI que incluye el paquete plug-in.
Editor de imágenes vectoriales	Adobe	Illustrator CS4
Aplicación de hoja de cálculo	Microsoft Office	Excel 2010