Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.
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Artículo de método
Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea
En este artículo
Resumen
Resumen
Cuantificación de la activación de las células T CD4 Naive, proliferación y diferenciación al ayudante de T 1 (Th1) las células es una manera útil de evaluar el papel desempeñado por las células T en una respuesta inmune. Este protocolo describe la diferenciación en vitro de progenitores de médula ósea (MO) para la obtención de granulocitos macrófago colonia-que estimulan el factor (GM-CSF) deriva-células dendríticas (DCs). El protocolo describe también la transferencia adoptiva de péptidos de ovoalbúmina (OVAp)-cargado DCs de GM-CSF-derivados e ingenuo CD4 T cells de ratones transgénicos OTII para analizar la en vivo la activación, proliferación y diferenciación de Th1 de la transferidos de las células T CD4. Este protocolo evita la limitación de puramente en vivo los métodos impuestos por la imposibilidad de manipular o seleccionar la población celular estudiado específicamente. Además, este protocolo permite estudios en un ambiente en vivo , evitando alteraciones a factores funcionales que pueden ocurrir en vitro e incluyendo la influencia de los tipos de la célula y otros factores que sólo se encuentran en órganos intactos. El protocolo es una herramienta útil para generar cambios en DCs y células de T que modificar las respuestas de adaptación inmune, potencialmente proporcionando importantes resultados para entender el origen o el desarrollo de numerosas enfermedades asociadas inmunes.
Introducción
Las células T CD4 y el antígeno que presenta las células (APCs) como DCs son necesarios mediadores de inmunidad a patógenos microbianos1,2. En los órganos linfoides periféricos, se activan las células T CD4 a partir del reconocimiento de antígenos específicos presentados por APCs3,4,5. Las células T CD4 activadas proliferan y se diferencian en células de Th de distintos efectores específicos que son necesarias para el desarrollo de una correcta respuesta inmune adaptativa6,
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Protocolo
Procedimientos experimentales fueron aprobados por la Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC) y la Comunidad Autónoma de Madrid con arreglo a las directrices españolas y europeas. Ratones fueron criados en la condiciones libres de patógenos específicos (SPF) y fueron sacrificados por la inhalación de dióxido de carbono (CO2).
1. aislamiento de células de médula ósea de ratón de Tibias y fémures
Nota: La cepa de ratón C57BL/6 congenic lleva el diferencial leucocitario marcador Ptprcun, reconocido generalmente como CD45.1 o Ly5.1, mientras que cep....
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Resultados
La figura 1 ilustra los pasos descritos en este protocolo. La figura 2 ilustra el aislamiento y cultivo de células de ratón BM. La adición de GM-CSF y LPS a estas culturas permite la generación en vitro y la maduración de DCs. figura 3 ilustra el análisis de citometría de flujo de la diferenciación y maduración de las DCs obtenidos cargado DCs. OVAp derivadas de GM-CSF BM y aisladas células .......
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Discusión
Este protocolo permite la caracterización de la capacidad de derivados de BM DCs para modular la activación, proliferación y diferenciación de las células CD4 naïve. Además, puede también utilizarse para evaluar la susceptibilidad de las células T CD4 a modulación por DCs derivados de BM. Con este protocolo, cambios en estos eventos pueden ser medidos en vivo.
Según la hipótesis de la investigación, se pueden utilizar varias combinaciones de células T y DCs. Por ejemplo, uno puede ana.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Simon Bartlett para la edición de inglés. Este estudio fue apoyado por becas del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), el programa de Miguel Servet y la Fundación Ramón Areces; con la cofinanciación del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER). El CNIC es apoyado por el Ministerio de economía, industria y competitividad (MEIC) y la Fundación Pro CNIC y es un centro de excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505). RTF es fundado por la Fundación Ramón Areces y CNIC, VZG por el ISCIII, BHF por Instituto de Investigación Sanitaria Hospital 12 de Octubre (imas12) y JMG-G por el ISCIII Miguel Servet pro....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Etanol | VWR Chemicals | 20.824.365 | |
| Tijeras | Fine Science Tools (F.S.T.) | 14001-12 | |
| Pinzas | Herramientas de Ciencias Finas (F.S.T.) | 11000-13 | |
| Pinzas finas | Herramientas de ciencia fina (F.S.T.) | 11253-20 | |
| Bisturí | Herramientas de ciencia fina (F.S.T.) | 10020-00 | Caja de 100 cuchillas Suero |
| Fetal Bovino | SIGMA | F7524 | |
| Penicilina/estreptomicina | LONZA | DE17-602E | |
| Roswell Park Memorial Institute medio (RPMI) | GIBCO | 21875-034 | |
| Placas de Petri estériles | Falcon | 353003 | |
| aguja de calibre 25 | BD Microlance 3 | 300600 | |
| Jeringa de 1 ml | Novico | N15663 | |
| Tubos cónicos de 15 ml | Falcon | 352096 | |
| 50 ml Tubos cónicos | Falcon | 352098 | |
| 70 μ m filtro de banda de nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Tampón de lisis sanguínea rojo | SIGMA | R7757 | 100 ml |
| EDTA | SIGMA | ED2SS-250 | |
| Albúmina de suero bovino | SIGMA | A7906 | 100 g |
| Azul tripán | SIGMA | 302643-25G | |
| Placas de cultivo | Falcon | 353003 | |
| Ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico (HEPES) | Cambrex | BE17-737E | |
| Beta-mercaptoetanol | Merck | 8-05740-0250 | |
| Piruvato de sodio | LONZA | BE13-115E | |
| L-glutamina | LONZA | BE17-605E | |
| Granulocitos murinos recombinantes Factor estimulante de colonias de macrófagos (GM-CSF) | Prepotech | 315-03 | |
| lipopolisacárido (LPS) | SIGMA-ALDRICH | L2018 | |
| placa de 96 pocillos | Costar | 3799 | |
| v450 anticuerpo CD11b | ratón BD Biosciences | 560455 | |
| PE anticuerpo CD115 de ratón | BioLegend | 135505 | |
| FITC antiratón Anticuerpo CD11c | BioLegend | 117305 | |
| FITC anticuerpo MHCII antiratón | BioLegend | 125507 | |
| APC anticuerpo CD86 | BioLegend | 105011 | |
| APC anticuerpo CD80 antiratón | BioLegend | 104713 | |
| Tubos de citometría de flujo | Zelian | 300800-1 | PS 12X75 5mL |
| OTII Péptido de | ovoalbúminaInvivoGen | 323-339 | |
| anti-ratón biotinilado CD8&alfa; anticuerpo | Tonbo Biosciences | 30-0081-U500 | |
| anti-ratón biotinilado IgM biocuerpo | BioLegend | 406503 | |
| anti-ratón biotinilado B220 anti-ratón | Tonbo Biosciences | 30-0452-U500 | |
| anti-ratón biotinilado anti-ratón | anticuerpo Tonbo Biosciences | 30-0193-U500 | |
| anticuerpo MHCII (I-Ab) biotinilado de ratón | BioLegend | 115302 | |
| anticuerpo CD11b biotinilado de ratón | Tonbo Biosciences | 30-0112-U500 | |
| anticuerpo CD11c biotinilado de ratón | BioLegend | 117303 | |
| anticuerpo CD44 biotinilado de ratón | BioLegend | 103003 | |
| biotinilado de ratón BioLegend Anticuerpo CD25 | Tonbo Biosciences | 30-0251-U100 | |
| anti-ratón biotinilado DX5 anticuerpo BioLegend | 108903 | ||
| microperlas magnéticas recubiertas de estreptavidina | MACS Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| Separador de células magnéticas | MACS Miltenyi Biotec | 130-090-976 | QuadroMACS Separador |
| Columnas de separación | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| PE anticuerpo CD4 anti-ratón | BioLegend | 100408 | |
| APC anticuerpo CD3 anti-ratón | BioLegend | 100235 | |
| FITC anticuerpo CD8 anti-ratón Tonbo | Biosciences | 35-0081-U025 | |
| Célula Violeta | Trazador Thermofisher | C34557 | |
| APC anti-ratón anti-ratón CD25 anticuerpo Tonbo | Biosciences | 20-0251-U100 | |
| Alexa647 anticuerpo CD69 anti-ratón | BioLegend | 104518 | |
| PerCPCY5.5 anti-ratón anti-anti-ratón CD45.1 | anticuerpo Tonbo Biosciences | 65-0453 | |
| APC anti-ratón CD45.1 anticuerpo Tonbo | Biosciences | 20-0453 | |
| PECY7 anti-ratón CD45.1 anti-ratón | Tonbo Biosciences | 60-0453 | |
| FITC anti-ratón CD45.2 anticuerpo | Tonbo Biosciences | 35-0454 | |
| Ionomicina | SIGMA-ALDRICH | I0634 | |
| Forbol 12 Miristato 13 Acetato (PMA) | SIGMA | P8139 | |
| Brefeldina A (BD GolgiPlug) | BD | 555029 | |
| Paraformaldehído | Millipore | 8-18715-02100 | |
| Tampón de permeabilización intracelular | eBioscience | 00-8333 | |
| APC anticuerpo IFNg de ratón | Tonbo Biosciences | 20-7311-U100 | |
| Fc-block (anti-ratón CD16/CD32) | Tonbo Biosciences | 70-0161-U100 | |
| B6. Ratones SJL CD45.1 | The Jackson Laboratory 002014 | ||
| BD LSRFortessa™ Analizador de células | BD Biosciences | 649225 | |
| DAPI Solution | Thermofisher | 62248 |
Referencias
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations (*). Annual Review of Immunology. 28, 445-489 (2010).
- Bustos-Moran, E., Blas-Rus, N., Martin-Cofreces, N. B., Sanchez-Madrid, F. Orchestrating Lym....
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Reimpresiones y permisos
