Artículo de método

Cuantificación de Efferocytosis por microscopía de fluorescencia unicelular

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DOI:

10.3791/58149

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18 de agosto de 2018

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1Department of Microbiology and Immunology and the Center for Human Immunology, University of Western Ontario, 2Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, 3Department of Respiratory Research, Aintree University Hospital NHS Foundation Trust

En este artículo

Resumen

Efferocytosis, la eliminación fagocítica de células apoptóticas, es necesaria para mantener la homeostasis y es facilitada por receptores y vías de señalización que permiten el reconocimiento, la inmersión y la internalización de células apoptóticas. Adjunto, presentamos un protocolo de microscopía de fluorescencia para la cuantificación de efferocytosis y la actividad de vías de señalización de efferocytic.

Resumen

Estudiar la regulación de la efferocytosis requiere de métodos que son capaces de cuantificar con precisión la absorción de células apoptóticas y los procesos de señalización y celulares que controlan el efferocytosis la punta de prueba. Esta cuantificación puede ser difícil de realizar como células apoptóticas son a menudo efferocytosed paulatinamente, así que los métodos que se pueden delinear con precisión entre la porción efferocytosed de un objetivo de apoptosis versus residual celular unengulfed los fragmentos. El enfoque descrito en el presente documento utiliza doble etiquetado enfoques para cuantificar con precisión la dinámica de la capacidad efferocytosis y efferocytic de efferocytes tales como los macrófagos. El citosol de la célula apoptótica se etiqueta con un tinte de seguimiento de la célula para permitir el seguimiento de todos los apoptóticos mástil-célula-derivados materiales, mientras Biotinilación superficial de la célula apoptótica permite diferenciar entre internalizada y no internalizan fracciones de la célula apoptótica. La capacidad de efferocytic de efferocytes se determina tomando imágenes fluorescentes de células vivas o fijas y cuantificar la cantidad de consolidados versus objetivos internalizados, como diferenciadas por la coloración de estreptavidina. Este enfoque ofrece varias ventajas sobre los métodos tales como la citometría de flujo, es decir, la delineación precisa de no efferocytosed versus efferocytosed apoptóticos fracciones celulares, la capacidad de medir la dinámica efferocytic por microscopía de células vivas y la capacidad para realizar estudios de señalización celular en las células que expresan los transgenes marcada con fluorescencia. Combinados, los métodos establecidos en este protocolo sirven como base para un enfoque experimental flexible que puede utilizarse para cuantificar con precisión la actividad efferocytic e interrogar vías de señalización celulares activas durante efferocytosis.

Introducción

Apoptosis o muerte celular programada, es un proceso fisiológico altamente regulado que ocurre en la mayoría de los organismos multicelular y es crucial para su desarrollo y homeostasis1. Además de estar involucrado en el recambio celular normal y el desarrollo embrionario, la apoptosis permite la eliminación de las células infectadas o dañadas de los tejidos y puede activarse en respuesta a infección, inflamación, cáncer y también por las intervenciones médicas como radioterapia o esteroides1. Células apoptóticas exponen "comer-me" señales en su superficie celular que son reconocidas por receptores en una gama de los fagocitos profesionales y no profesionales, denominadas colectivamente como "efferocytes". Participación de estos receptores induce la captación y degradación de la célula apoptótica por el efferocyte a través de un proceso conocido como efferocytosis2,3. Fosfatidilserina es el mejor caracterizado comer-me efferocytosis conducción de la señal. Normalmente se limita a la hoja interna de la membrana plasmática, con apoptosis activando un scramblase lípidos que interrumpe esta asimetría de la membrana, exponiendo fosfatidilserina en la superficie de la célula4. Fosfatidilserina se encuentra en la superficie extracelular de algunas células no apoptóticas, tales como los macrófagos maduros y activa las plaquetas. Sin embargo, estas células no son efferocytosed debido a la presencia de "no me come" señales, como la CD47, en sus células superficiales5,6,7. Fosfatidilserina expuesto es reconocido por una variedad de receptores de efferocytic de efferocytes. Unión de estos receptores a fosfatidilserina, ya sea directamente o a través de la ayuda de opsoninas, activa vías de señalización que promueven la inmersión de la célula apoptótica en una vacuola membrana-limitan como el efferosome8, 9 , 10 , 11 , 12. el efferosome funde secuencialmente con endosomas y lisosomas, que entregan la maquinaria molecular necesaria para acidificar el efferosome y degradar la apoptosis de la célula de carga13,14. Una vez degradado, los materiales derivados de la célula apoptótica son traficados para el endosome reciclaje — un proceso que limita la respuesta inmune a antígenos derivados de células apoptóticas, y que pueden permitir la recuperación de nutrientes de la apoptosis de la célula13, 15. Un fracaso en los resultados de la efferocytosis en la separación deteriorada de células apoptóticas; Estas células someterse eventualmente a necrosis secundaria. Células necróticas liberan contenido citosólico pro-inflamatoria, patógenos y autoantígenos en el medio extracelular, así el conducir una variedad de enfermedades infecciosas, inflamatorias y autoinmunes16,17. Juntos, apoptosis y efferocytosis facilitan la eliminación de células muertas y moribundas y permiten el mantenimiento de la homeostasis del tejido.

Investigar los mecanismos moleculares subyacentes a efferocytosis requiere de métodos que permiten una cuantificación clara de captación de apoptosis celular. Esta cuantificación es complicada por el hecho de que a diferencia de la absorción de otros mecanismos tales como endocitosis y fagocitosis18,19, efferocytosis no pueden resultar en la inmersión de la célula objetivo intacto, dando por resultado la absorción gradual de la célula apoptótica por el efferocyte20. El protocolo descrito en este documento describe un ensayo en vitro efferocytosis que proporciona la delineación exacta de la internalizada versus no internalizan las porciones de células apoptóticas individuales y se puede combinar con una variedad de células fijas y métodos de microscopía de células vivas. Ensayos de fagocitosis tradicional añadir anticuerpos específicos al objetivo fagocítico al final del experimento para objetivos no interiorizado, la etiqueta donde como nuestro método diferencia por etiquetado el objetivo de la apoptosis con biotina covalentemente ligado21 , 22. mientras que los anticuerpos específicos de la célula apoptótica pueden ser utilizados en este análisis, el enfoque de Biotinilación permite para que cualquier destino de proteína lleva a etiquetarse y evita posibles problemas con reactividad cruzada del anticuerpo secundario si se realiza inmunotinción . En particular, describiremos la preparación de las células de Jurkat apoptotic que han sido doble tinción con un colorante de seguimiento de la célula y la biotina. La célula de seguimiento de tinte permite apoptotic mástil-célula-derivados materiales rastreados en efferocytosis, mientras que permite la discriminación de Biotinilación superficial internalizado desde porciones no interiorizada de las células apoptotic efferocytosed. También describimos la cultura y la preparación de líneas celulares de J774.2 y THP-1 para uso como efferocytes murino y humano, macrófagos derivados de monocitos de M2 como un ejemplo de celulares primarios de células efferocytosis y células de Jurkat para el uso como blancos de efferocytic. Estos métodos pueden aplicarse fácilmente a otras líneas celulares o células primarias, células diana sometidos a cualquier forma de muerte celular (por ejemplo , la necrosis y la apoptosis necroptosis) e imitadores de tamaño micrométrico que simulan células apoptóticas a través de capas de lípidos o capa con ligandos específicos de un receptor de efferocytic de interés.

El método descrito en el presente Protocolo tiene varias ventajas sobre los métodos de flujo cytometry basado comúnmente utilizados en el campo23,24. Por proyección de imagen directamente la interacción de la célula fagocito-apoptotic, combinada con un etiquetado claro de tanto material total y no interiorizados apoptotic de la célula, se pueden hacer medidas cuantitativas de efferocytosis. Por otra parte, el uso de fluoróforos pH insensible limita factores de confusión tales como la supresión de la fluorescencia de GFP y FITC a pH lisosomal que confunde algunos métodos alternativos25. Por último, aunque no se describe en detalle, estos métodos pueden emplearse utilizando efferocytes expresar transgenes marcada con fluorescencia, o con inmunotinción posteriores a la fijación, para permitir la cuantificación de la actividad de la molécula de señalización y control de la procesos celulares durante la efferocytosis.

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Protocolo

Colección de sangre de voluntarios sanos fue aprobado por la Junta de ética de investigación de ciencia de salud de la Universidad de Ontario Occidental. Venopunción fue realizada siguiendo las directrices de la declaración de política Tri-Consejo de investigaciones en seres humanos.

1. cultura y preparación de la línea de celular del monocito THP-1

  1. Monocitos de THP-1 de cultura como una cultura de suspensión en frascos T25 a 37 ° C + 5% CO2. Las células deben cultivarse en 5 mL de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) + 10% suero bovino Fetal (FBS).
  2. Cada células de suspensión día uniformemente a través de los medios de crecimiento agitando suavemente el matraz, entonces inmediatamente contar las células con un hemocitómetro. Las células deben ser pasadas una vez densidad celular llega a 1 x 106 células/mL:
    1. Caliente previamente el RPMI 1640 + 10% FBS en un baño de agua de 37 ° C.
    2. Transferencia de 2 x 105 células en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL o en un tubo cónico de 15 mL y pellet de células por centrifugación a 500 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    3. Quite el sobrenadante sin perturbar el sedimento celulares y resuspender el precipitado en 1 mL (tubo de microcentrífuga de 1,5 mL) o 5 mL (tubo cónico de 15 mL) de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
    4. Centrifugar el tubo a 500 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos retirar el PBS sin perturbar el sedimento celulares.
    5. Pellets de resuspender en 1 mL de fresco RPMI 1640 + 10% FBS.
    6. En un nuevo lugar de matraz T25 4 mL de medio caliente y a esto agregar las células resuspendidas en 1.2.5. La cultura en una incubadora de 37 ° C + 5% CO2 hasta que las células requieren pases (típicamente 3 días), o hasta que las células se requieren para un experimento.
  3. Un experimento con macrófagos THP-1-derivados, saque la cantidad necesaria de células el matraz y la placa antes de pases:
    1. Colocar el número requerido de cubreobjetos de vidrio circular de 18 mm (#1.5 espesor) en los pocillos de una placa de 12 pozos, normalmente 1 cubreobjetos por condición y punto. En cada uno bien alícuota 5 x 104 THP-1 monocitos. El número de células agregó a cada pozo puede ser alterado, si es necesario.
    2. Llevar el volumen total de cada célula que contienen a 1 mL con RPMI + 10% FBS calentado a 37 ° C.
    3. Añadir 100 nM forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a cada pocillo y la cultura durante 3 días inducir la diferenciación de monocitos THP-1 en células similares a macrófagos.

2. cultura y preparación de la línea de celular de macrófagos J774.2

  1. J774.2 células en cultivo en frascos de T25 a 37 ° C + 5% CO2. Deben cultivar las células en 5 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) + 10% FBS y pasados una vez que la cultura llegue a 80-90% de confluencia. Células de paso:
    1. Retire todos los medios del matraz y se levantan una vez con 5 mL de PBS.
    2. Retire el frasco de PBS y reemplazar con 5 mL de DMEM fresco + el 10% FBS.
    3. Con un raspador celular, raspe el fondo del matraz para suspender las células en los medios de comunicación. Pipetear enérgicamente las células varias veces para romper cualquier agregados de la célula.
    4. Diluir 1:5 células por quitar 4 mL de la suspensión de células del frasco y reemplazar con 4 mL de medio fresco. La suspensión de células restantes puede descarta, utilizada para iniciar una nueva cultura de la célula en un matraz de T25 fresco o utilizada para un experimento.
  2. Para un ensayo de efferocytosis con J774.2 las células:
    1. Un día antes del inicio del experimento, suspender J774.2 células en 5 mL de medio fresco, según pasos 2.1.1–2.1.3. Contar las células usando un hemocitómetro y preparar el volumen necesario de las células a una concentración de 5 x 104 células/mL.
    2. Coloque el número necesario de cubreobjetos de vidrio circular de 18 mm (#1.5 espesor) en los pocillos de una placa de 12 pozos. En cada uno bien alícuota 1 mL de la suspensión de células 5 x 104 células/mL.
    3. Cultura durante la noche para permitir que las células se adhieren al cubreobjetos y recuperar de pases.

3. cultivo de macrófagos primarios humanos M2

  1. Recoger 10 mL de sangre humana heparinizada por cada placa de 12 pozos de macrófagos M2 requeridos.
  2. En un tubo de centrífuga de 15 mL, 5 mL de sangre humana en la parte superior 5 mL de medio de separación de células de Lympholyte-poly precalentado en capas. Preparar los tubos múltiples si tratamiento > 5 mL de sangre en lugar de usar tubos de volumen más grandes.
  3. Centrifugar a 300 x g durante 35 min, usando aceleración media y ninguna rotura.
  4. Retire con cuidado la banda rica superior de células mononucleares que utilizando una pipeta de plástico y transfiéralo a un tubo de centrífuga de 50 mL. Si se prepararon tubos múltiples en el paso 3.2, las bandas pueden combinarse en un tubo de 50 mL solo. Llevar el volumen del tubo a 50 mL con PBS.
  5. Centrifugar a 300 x g por 8 min y retirar el sobrenadante. Durante este paso Coloque autoclave 18 mm cubreobjetos circulares de diámetro (#1.5 espesor) en cada pocillo de una placa de 12 pozos.
  6. Resuspender el precipitado de células en 300 μL de suero RPMI 1640 al número deseado de pocillos; por ejemplo, si 10 mL de sangre fue procesada para preparar un plato bien completo 12, suspender el precipitado de células en 3,6 mL de medios de comunicación.
  7. Añadir 300 μL de la suspensión de células a cada uno con cubreobjetos en la placa de 12 pozos. Incubar durante 1 h a 37 ° C + 5% CO2.
  8. Lave suavemente el cubreobjetos 3 x con 1 mL de PBS precalentada para eliminar cualquier célula no adherente.
  9. Añadir 1 mL de RPMI 1640 + 10% FBS + 10 recombinante ng/mL humano M-CSF + célula cultura antibiótico/antimicótico. Incubar a 37 ° C + 5% CO2 durante 5 días.
  10. Sustituir los medios de comunicación con RPMI 1640 + 10% FBS + 10 ng/mL recombinante humano M-CSF + 10 ng/mL IL-4 humana recombinante + célula cultura antibiótico/antimicótico. Incubar a 37 ° C + 5% CO2 durante 2 días completar la polarización M2.
  11. Los macrófagos polarizados deben utilizarse dentro de los próximos 3 días.

4. preparación de células Apoptotic Jurkat

  1. Cultivo de células de Jurkat en 5 mL de RPMI 1640 + 10% SBF a 37 ° C + 5% CO2. Jurkats son una línea de celular de la suspensión y puede ser mantenidos por pases 1:5 en fresco, con medios de comunicación cada 3 – 5 días.
  2. Para preparar las células apoptotic, permita que la cultura de Jurkat creciendo a alta densidad (4-5 días después de pases). Alícuota 1,5 mL en un 1.5 mL microcentrífuga tubo de pellet y de las células por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos.
  3. Deseche el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 1 mL de Medio RPMI 1640 sin suero contiene 1 μm estaurosporina.
  4. Incubar de 16 h a 37 ° C + 5% CO2 para las células apoptotic.
  5. Si lo desea, confirme la inducción de apoptosis mediante tinción con anexina V:
    1. Alícuota de 100 μl del cultivo de células de Jurkat estaurosporina tratados en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Sedimenten las células por centrifugación a 500 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante y Resuspenda el precipitado de células en 100 μl de medio sin suero de RPMI 1640.
    2. Añadir 1 μl de isotiocianato de fluoresceína (FITC)-conjugado anexina V e incubar 10 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
    3. Agregar 900 μl de PBS y transferir todo el volumen a un único pozo de una placa de 12 pozos con un cubreobjetos de cristal circular de 18 mm (#1.5 de espesor). Desactivación de una centrífuga equipada con un adaptador de placa a 200 x g durante 1 min forzar las células a adherirse al cubreobjetos. Por otra parte, las células se pueden colocar en una diapositiva "chambré" para la proyección de imagen.
    4. Imagen utilizando un microscopio de fluorescencia.

5. cuantificación de captación de Efferocytic y dinámica usando un celular fijo Efferocytosis análisis y tinción de adentro hacia afuera

  1. Preparar los macrófagos humanos THP-1, J774.2 o M2 como se describe en las secciones 1-3, respectivamente.
  2. La noche antes del comienzo del experimento preparar apoptotic células Jurkat como se describe en la sección 4.
  3. Inmediatamente antes del experimento, contar células apoptóticas usando un hemocitómetro. Transferencia de un número suficiente de células apoptóticas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, generalmente añadimos 5 x 105 células/pozo, proporcionando una relación objetivo: efferocyte de 10:1.
  4. Células Jurkat de pellets por centrifugación a 500 x g durante 5 min y resuspender en 500 μL de PBS.
  5. Durante la centrifugación, alícuotas de 10 μl de DMSO en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Se disuelven en el DMSO una cantidad mínima de N-hydroxysuccinimidobiotin (NHS-biotina). 5-10 cristales (~0.005 mg) es suficiente.
  6. Transferir la suspensión de la célula/PBS 500 μL apoptótica con DMSO/NHS-biotina que contiene el tubo. Luego diluya una célula de seguimiento de tinte a la concentración recomendada del fabricante en la suspensión de células apoptotic. Asegúrese de seleccionar una celda seguimiento tinte que no se traslapan espectral con FITC-estreptavidina (por ejemplo rojo o far-red célula de seguimiento de tinte).
  7. Incubar suspensión por 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Añadir un volumen igual de RPMI 1640 + 10% FBS e incubar 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad para saciar cualquier tinte sin reaccionar.
  8. Sedimenten las células por centrifugación a 500 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante y Resuspenda las células apoptotic manchada en 100 μl de RPMI 1640 + 10% FBS por bien de los macrófagos.
  9. Añadir 100 μl de suspensión de la célula apoptótica manchada gota a gota en cada pocillo de los macrófagos. Centrifugue a 200 x g durante 1 min en una centrífuga equipada con un adaptador de placa a la fuerza de contacto entre los macrófagos y células apoptóticas.
  10. Incubar la placa durante el período de tiempo a 37 ° C + 5% CO2 en una incubadora de cultivo de tejidos. Para macrófagos, efferocytosed material es generalmente primero perceptible después de 20-30 min y se completa después de 120 – 180 minutos.
  11. En los puntos de tiempo deseado eliminar las células de la incubadora. Lavar las células dos veces con 1 mL de PBS para detener efferocytosis y eliminar las células apoptotic no efferocytosed de temperatura.
  12. Añadir FITC conjugado estreptavidina en una dilución de 1:1,000 a cada pocillo e incubar por 20 min en la oscuridad. Esta etiqueta de la biotina expuesta en materiales no efferocytosed apoptotic de la célula.
    Nota: Si lo desea, núcleos celulares pueden teñirse durante este paso por la adición de dilución de 1: 20,000 de Hoechst 33342 o 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole, diclorhidrato (DAPI).
  13. Lavar las células 3 veces con 1 mL de PBS, agitando suavemente o mecer las muestras durante 5 minutos por enjuague. Fijar las células con 4% paraformaldehido (PFA) en PBS durante 20 min a temperatura ambiente. Enjuague las células una vez con PBS para eliminar exceso PFA.
  14. Monte el cubreobjetos sobre un portaobjetos para la proyección de imagen y transferencia a un microscopio de fluorescencia. Pilas de z de un número suficiente de células para la cuantificación precisa de captura — típicamente 10 – 30 células por condición. Material de la célula apoptótica internalizado no será evidente en la imagen resultante como célula de seguimiento de tinte etiquetado material envuelto por tinción FITC-estreptavidina, mientras que efferocytosed material forma celular discreto seguimiento puncta de tinte libre de cualquier estreptavidina de tinción.
  15. Cuantificar efferocytosis en las imágenes a través de una variedad de medidas:
    1. Calcular el índice de efferocytic determinando el número promedio de efferosomes discreta (célula de seguimiento de tinte+/streptavidin– puncta) por macrófagos. Cuantificar sólo macrófagos ligada a una célula apoptótica o con ≥1 visible efferosomes. Macrófagos registro enlazado a una célula apoptótica, pero falta efferosomes discretos, como teniendo un índice de efferocytic de 0.
    2. Calcular efferocytic eficiencia midiendo la fracción de macrófagos que contienen efferosome ≥1.
    3. Calcular la tasa de efferocytosis por las células de proyección de imagen fijas y teñidas en varios puntos del tiempo. Macrófagos de imagen única ligada a células apoptóticas o que contienen efferosomes visible, con pilas de z capturados de cada célula. Una vez reflejado, determinar la tasa de efferocytosis:
      1. Usando la tinción de estreptavidina como una guía y la herramienta de selección a mano alzada o polígono en FIJI/ImageJ26 (u otro paquete de software de análisis de imagen), el círculo de la célula de seguimiento de tinte+/streptavidin– (e.g. internalizado) material en un solo plano de la pila de z. Medir la intensidad integrada de la célula de seguimiento de tinte esta región. Medidas individuales para cada efferosome (por ejemplo, diámetro, posición en relación con la frontera de la célula o núcleo, etc.)15,27 pueden fácilmente ser adquiridas simultáneamente con estas medidas, mucho aumento de los datos recogidos durante el análisis.
      2. En la misma sección en z, usando la estreptavidina coloración como una guía y la herramienta de selección a mano alzada o polígono, círculo de la célula de seguimiento /streptavidin de tinte++ (p. ej. no internalizado) material en un solo plano de la pila de z . Sólo incluyen tinción de células apoptóticas en contacto con el fagocito. Medir la intensidad integrada de esta región.
      3. Repita los pasos 4.2.3.1 en 4.2.3.2 para las secciones restantes del z de la imagen. En definitiva la intensidad integrada de la efferocytosed (Σeff) y materiales no-efferocytosed (Σne). Se puede calcular la fracción de la célula apoptosis que ha sido efferocytosed para la célula como:
        figure-protocol-1
      4. Cuantificar la fracción efferocytosed para todas las células en todos los puntos de tiempo. Tenga en cuenta que la intensidad fluorescente de células apoptóticas/efferosomes puede variar entre imágenes debido a variaciones en la absorción de la célula células apoptóticas individuales de seguimiento tintes y debido a los cambios en los parámetros de adquisición de imagen como el tiempo de exposición. Como tal, sólo compara normalizó valores como fracción Efferocytosed o independiente de la intensidad de valores como el índice de efferocytic y efferocytic eficiencia, entre imágenes, entre las condiciones experimentales y entre repetición experimentos.
    4. Para asegurar que el conjunto de datos resultante refleja con exactitud la variación en la efferocytosis entre las células, realizar estos análisis sobre el número máximo de células en cada experimento.
      Nota: Índice de eficiencia y efferocytic de Efferocytic puede ser calculado rápidamente (pocos segundos/célula), y por lo general tratamos de analizar por lo menos 100 células por experimento, repetir cada experimento por lo menos 3 veces. Calcular la fracción de efferocytosed material, las medidas específicas de efferosome son más laboriosos, tomando típicamente 2 a 3 minutos y celular para un analista experto. Para estos cálculos cuantifica un mínimo de 15 células por condición, por experimento.
    5. Índice de registro efferocytic, fracción efferocytosed y datos individuales efferosome por celda.
      Nota: Esto permite el análisis de datos utilizando enfoques unicelular, permitiendo variaciones inter-células a cuantificarse. Análisis a nivel de población todavía pueden realizarse en estos conjuntos de datos promediando sola celda datos obtenidos en los experimentos individuales. Las medidas específicas de Efferosome pueden ser analizadas a nivel de población, nivel unicelular y como conjuntos (por ejemplo, como las poblaciones de efferosomes independientes de las células que los contienen)15.

6. Análisis de Efferocytosis la célula con las células Apoptotic en vivo

  1. Preparar los macrófagos THP-1, J774.2 o M2 como se describe en los pasos 1-3, respectivamente. Si es necesario, las células deben ser transfected con los transgenes u otros genética construye al menos 18 h antes de realizar cualquier experimentos.
  2. La noche antes del inicio del experimento, preparar apoptotic células Jurkat como se describe en las secciones 4 y 5 con las siguientes modificaciones:
    1. Diluir las células inducen apoptosis según 4.1, 4.3 y recoger el número de células apoptóticas según 5.3 – 5.4.
    2. Agregar una celda seguimiento colorante en concentración recomendada del fabricante a la suspensión de células apoptotic. Incubar suspensión por 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Añadir un volumen igual de RPMI 1640 + 10% FBS e incubar 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad para saciar cualquier tinte sin reaccionar. No agregue NHS-biotina para estos experimentos.
    3. Sedimenten las células por centrifugación a 500 x g durante 5 min, descartar el sobrenadante y Resuspenda las células apoptotic manchada en 100 μl de RPMI 1640 + 10% FBS por bien de los macrófagos.
  3. Si es necesario, etiqueta los macrófagos quitando medios de cultivo de cada pozo y agregar 500 μl de PBS con los fabricantes recomiendan dilución de una célula de seguimiento de tinte que no se traslapan espectral con la célula de seguimiento de colorante añadido a las células apoptóticas o cualquier fluorescentes transgenes expresados por los macrófagos. Incubar por 20 min a temperatura ambiente en la oscuridad, a continuación, agregue un volumen igual de DMEM + 10% FBS e incubar 5 min a temperatura ambiente en la oscuridad para saciar cualquier tinte sin reaccionar.
  4. Transferir el cubreobjetos que contiene macrófagos a una cámara de Leiden. Añadir 400 μL de DMEM + 10% FBS, seguido por 100 μl de la suspensión de células apoptotic etiquetados. Mezclar mediante pipeteo suave medios 2 – 3 veces.
  5. Transferencia de la cámara de Leiden a un caliente y CO2-cámara inundada de un microscopio de fluorescencia de células vivas.
    Nota: Para configuraciones de microscopio que carece de capacidades de CO2 perfusión, utilizar tejido medio de cultivo tamponado con 1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES) en lugar de bicarbonato de sodio para mantener el pH fisiológico mientras la la cultura se expone al aire.
  6. Captura de una serie de Time-lapse que contiene una imagen de luz blanca (contraste de fase o DIC) e imágenes de todas las etiquetas fluorescentes:
    1. Utilice un objetivo de 100 X para experimentos donde resolver detalles finos es necesario (por ejemplo dinámica de membrana de las interacciones de la célula fagocito-apoptótica). Mientras tanto, las medidas más generales (tasa de captación de apoptosis celular, tiempo de interacción entre los macrófagos y las células apoptotic, etc.) son mejor reflejada con un 60 X u objetivo X 63.
    2. Si está disponible, utilice punto de visita para múltiples campos de vista de la imagen durante una adquisición individual, aumentando así el número de eventos de efferocytic capturados en un solo experimento
    3. Porque efferocytes a menudo engullen pequeños fragmentos de células apoptóticas, en lugar de las células intactas, es mejor capturar z-pilas. Para minimizar la fototoxicidad, capturar z-secciones separadas por la profundidad focal de su objetivo de microscopios (típicamente 0.5-1.0 μm), a través del espesor de la celda (normalmente 8-10 μm para los macrófagos, por ejemplo, 8 – 20 rebanadas/celular). Esto asegura que toda inmersión y tráfico eventos serán visibles en al menos un plano de z. Como alternativa, utilizar grandes (1 a 5 μm de diámetro) apoptotic de la célula imitadores o células apoptóticas que sufren fragmentación mínima durante efferocytosis (e.g. calor sorprendidos neutrófilos) en su lugar sin z de apilamiento. Hemos descrito la preparación de los imitadores y neutrófilos apoptóticos previamente28.
    4. Para minimizar el fotoblanqueo, fluoróforos brillante y captura de imágenes utilizando las opciones de adquisición que minimicen el fotoblanqueo — por ejemplo, excitación de baja intensidad combinada con cámara de alta ganancia y corto de la exposición veces29. Recomendamos encarecidamente utilizar un microscopio equipado con una cámara de alta sensibilidad electromagnética dispositivo acoplado de carga (EM-CCD) o disco de giro confocal y una platina mecánica alta velocidad piezoeléctrica, para esta forma de proyección de imagen.
  7. El número de métodos de análisis posibles que pueden aplicarse a estos vídeos Time-lapse es extensa y más allá de nuestra capacidad de examinar aquí. Como ejemplos, uso manual o automatizado de software de seguimiento para seguir la fusión, fisión y movimiento de efferosomes dentro de células15, cuantificar la dinámica de fusión de efferosome con endolysosomes por análisis de colocalización en macrófagos expresando compartimento específico fluorescente transgenes13, monitor absorción procesos tales como la formación de sondeo y Copa30, determinar la dinámica de contratación de la señalización y el tráfico de proteínas a la efferosome13, o cuantificar la actividad de degradación de efferosomes con las células apoptotic con fluoróforos sensibles a pH, sensible al oxidante o activado por proteasa31.

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Resultados

Noche de cultura de células Jurkat con resultados de estaurosporina de 1 μm en la apoptosis de > 95% de las células, que pueden confirmarse con anexina V tinción (figura 1). Otros tipos de células pueden ser utilizados para estos experimentos, aunque la concentración de estaurosporina y la duración del tratamiento de estaurosporina necesitará optimizarse para cada línea celular. Para la detección confiable y cuantificación de efferocytosis, > 80% de las...

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Discusión

Los métodos establecidos en este protocolo permiten la proyección de imagen y cuantificación del proceso dinámico efferocytic, utilizando enfoques células fijas y células vivas. Estos enfoques ofrecen varias ventajas sobre los métodos basados en citometría de flujo comúnmente empleadas23,24. El uso de adentro hacia fuera manchas con muestras fijadas proporciona una cuantificación más robusta y precisa de la tasa y el grado de efferocytosis, de hecho, muchos métod...

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Divulgaciones

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por los institutos canadienses de Health Research (CIHR) operación Grant MOP-123419, ciencias naturales, ingeniería investigación Consejo de Canadá Discovery Grant 418194 y Ontario Ministerio de investigación e innovación temprana investigación Premio a BH. DGW contribuido algunas de las imágenes presentadas, a la optimización de los protocolos y a la escritura del manuscrito; él fue financiado por una subvención de cebado de la bomba de la Universidad de Liverpool. CY es financiado por una beca postgrado Vanier y beca de MD/PhD de CIHR. Las agencias de financiación no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
RPMI 1640 MediaWisent3500-000-EL
DMEM MediaWisent319-005-CL
Suero Fetal Bovino (FBS)Wisent080-150
PBSWisent311-010-CL
18 mm cubreobjetos de vidrio circulares #1.5 espesorCiencias de la Microscopía Electrónica72290-08El tamaño y la forma del cubreobjetos no son críticos, pero 18 mm caben en los pocillos de una placa estándar de 12 pocillos, lo que simplifica el cultivo celular
StaurosporineCayman Chemical81590Disolver en DMSO a 1 mM (1,000x solución madre)
Anexina V-Alexa 488ThermoFisherR37174
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217Almacenar en un desecador. No prepare una solución madre.
DMSOSigma-AldrichD2650
CellTrace FarRedThermoFisherC34572
CellTrace NaranjaThermoFisherC34851
Hoescht 33342ThermoFisher62249
FITC-StreptavadinThermoFisherSA1001
Medio de secración de células linfolíticas y polilinfolíticasCedarlane LabsCL5071
M-CSF humano recombinantePeprotech200-04
IL-4 humano recombinantePeprotech300-25
J774.2 Línea celular de macrófagosSigma-Aldrich85011428-1VL
THP-1 Línea celular de monocitos humanosATCCTIB-202
Línea celular T JurkatATCCTIB-152

Referencias

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