El objetivo de este protocolo es facilitar el estudio de receptores de NMDA (NMDAR) a una escala mayor y permitir el examen de los efectos moduladores de pequeñas moléculas y sus aplicaciones terapéuticas.
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Artículo de método
Un análisis del flujo de calcio de alto rendimiento para el estudio de los receptores NMDA con sensibilidad D/glicina-serina y glutamato
En este artículo
Resumen
Resumen
Los receptores N-metil-D-Aspartato (NMDA) (NMDAR) se clasifican como receptores de glutamato ionotrópicos y tienen un papel crítico en el aprendizaje y la memoria. Mal funcionamiento NMDAR, expresado como sea sobre - o debajo - activity causada por mutaciones, expresión alterada, tráfico y localización, puede contribuir a numerosas enfermedades, especialmente en el sistema nervioso central. Por lo tanto, entender la biología del receptor, así como facilitar el descubrimiento de compuestos y moléculas pequeñas es crucial en los esfuerzos para combatir enfermedades neurológicas. Enfoques actuales del estudio de los receptores tienen limitaciones como bajo rendimiento, alto costo y la incapacidad para el estudio de sus capacidades funcionales debido a la necesaria presencia de bloqueadores de los canales para evitar la excitotoxicidad mediada de NMDAR. Además, los sistemas de análisis existentes son sensibles a la estimulación por el glutamato solo y carecen de sensibilidad a la estimulación por glicina, otro ligando co del NMDAR. Presentamos el primer ensayo de placa de base con la energía de alto rendimiento para el estudio de un receptor NMDA con sensibilidad a ligandos Co, glutamato y D-serina/glicina. Este enfoque permite el estudio de las diferentes composiciones de subunidad NMDAR y estudios funcionales del receptor en modos sensibles a glutamato y glicina. Además, el método no requiere la presencia de inhibidores durante las mediciones. Los efectos de los moduladores alostéricos positivos y negativos se pueden detectar con este ensayo y la farmacología conocida de NMDAR ha sido replicada en nuestro sistema. Esta técnica supera las limitaciones de los métodos existentes y es económica. Creemos que esta nueva técnica acelerará el descubrimiento de terapias para patologías de NMDAR-mediada.
Introducción
Con los avances actuales en la medicina, la esperanza de vida ha aumentado significativamente; sin embargo, tiene tan la prevalencia de enfermedades relacionadas con la edad. Enfermedades del sistema nervioso central (SNC) tales como esquizofrenia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Alzheimer y de Parkinson, entre otros, no son la excepción y se han proyectado para aumentar durante el próximo decenio1, 2 , 3. el mal funcionamiento de receptores de glutamato ionotrópicos conocido como receptores N-metil-D-Aspartato (NMDAR) se ha relacionado con la enfermedad d....
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Protocolo
1. preparación de las células
Nota: Este protocolo, incluyendo la generación de datos, utiliza las células HEK293 transduced con un baculovirus codificación NR1 y NR2A las células.
- Semillas el número apropiado de células HEK293 y añada el virus NR1 y NR2A las concentraciones finales apropiadas (1.00 μl cada una). Para una placa de 384 pozos, utilice 10.000 células/pozo en un volumen final de 30 μl.
- Como alternativa, las células HEK293-NR1-NR2A en el número de células adecuado y el volumen (para una placa de 384 pozos, uso 10.000 células/pozo en un volumen final de 30 μL) de la semilla. Añadir tetraciclina en una concentr....
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Resultados
Antes de probar los efectos de moléculas pequeñas, uno debe determinar los niveles de expresión óptima de NMDARs, así como las concentraciones de ligando óptima. Como se describe, las células fueron sembradas a 10.000 células por pocillo en una placa de 384 pozos, HEK293 en presencia de 5 μm CGP060667, luego transduced con cantidades variables de NR1 y NR2A virus. Después de incubación durante la noche, inducida por el ligando calcio se midió flujo (figura 1).......
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Discusión
El éxito de este ensayo depende en gran medida la salud de las células HEK. Las células que experimentan un crecimiento exponencial y con número de paso bajo se debe utilizar. Este análisis implica a muchos traslados y adiciones de soluciones, así que con cuidado asegurarán una mayor precisión en sus resultados. Concentraciones de compuestos y otros reactivos deben ser también revisado en cruz para minimizar los errores. Al sustituir los medios de comunicación de la célula con el tampón de ensayo para el análisis del flu.......
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Divulgaciones
Los autores tienen ningún conflicto de intereses y nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean dar las gracias a la oficina del programa de Post bachillerato académicos e institutos de Novartis para la investigación biomédica en su conjunto para la financiación de este estudio.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| HEK-293 | ATCC | CRL-1573 | |
| Línea celular de receptor NMDA (NR1/NR2A) humano | ChanTest Corporation | CT6120 | |
| pFastBac Vector de expresión dual | ThermoFisher Scientific | 10712-024 | |
| Corning Microplaca de fondo plano claro de 384 pocillos | Corning Life Sciences | 3844 | |
| FLIPR Calcium 6-QF Kit de ensayo | molecular Dispositivos | R8192 | |
| Glicina | Sigma-Aldrich | G7126 | |
| Glutamato | Sigma-Aldrich | 49621 | |
| D-serina | Sigma-Aldrich | S4250 | |
| L701,324 | Tocris | 907 | |
| Tampón HEPES | Boston Bio Producto | BB-103 | |
| Solución de cloruro de magnesio | Sigma-Aldrich | 63069 | |
| Cloruro de calcio | VWR | E506 | |
| HBSS | ThermoFisher Scientific | 14025-092 | |
| Probenecid | ThermoFisher Scientific | P36400 | |
| DMEM/F-12, medios GlutaMAX | ThermoFisher Scientific | 10565018 | |
| MDL105,519 | NIBR | Sintetizado internamente | |
| NVP-AAM077 | NIBR | Sintetizado internamente | |
| CGP070667 | NIBR | Sintetizado internamente |
Referencias
- Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis. Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).
- Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T.
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Reimpresiones y permisos
