Este protocolo describe una metodología eficiente para la extracción y cuantificación de cafeína en suspensiones celulares de C. arabica L. y un proceso experimental para la evaluación de la actividad enzimática de la cafeína sintasa con el nivel de expresión de el gen que codifica esta enzima.
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Artículo de método
Extracción de cafeína, la actividad enzimática y la expresión del gen de la sintasa de cafeína de suspensiones celulares de plantas
En este artículo
Resumen
Resumen
Cafeína (1,3,7-trimetilxantina) es un alcaloide de purinas presente en bebidas populares como el café y té. Este metabolito secundario es considerado como una defensa química ya que tiene actividad antimicrobiana y es considerado un insecticida natural. La cafeína también puede producir efectos negativos alelopáticos que impiden el crecimiento de las plantas circundantes. Además, personas de todo el mundo consuman cafeína por sus efectos analgésicos y estimulantes. Debido al interés en las aplicaciones tecnológicas de la cafeína, ha crecido la investigación sobre la vía biosintética de este compuesto. Estos estudios se han centrado principalmente en la comprensión de los mecanismos bioquímicos y moleculares que regulan la biosíntesis de la cafeína. Cultivo de tejidos in vitro se ha convertido en un sistema útil para el estudio de este camino biosintético. Este artículo describe un protocolo paso a paso para la cuantificación de cafeína y de medición de los niveles de transcripción del gen (ECC1) codificación cafeína sintasa (CS) en suspensiones celulares de C. arabica L., así como su actividad.
Introducción
La cafeína es un metabolito secundario que es biosynthesized por plantas del género Coffea1. Este alcaloide pertenece a la familia de metilxantinas y es considerada como una defensa química de la planta porque puede actuar contra los efectos adversos de agentes patógenos y herbívoros2,3. Además, este metabolito es responsable de las propiedades estimulantes de la bebida de café, que es consumido en todo el mundo4,5. Debido a sus propiedades, diversos grupos de investigación están interesados en el estudio de la vía bios....
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Protocolo
1. la cafeína extracción en suspensiones celulares de C. arabica L.
- Uso de suspensiones de células de C. arabica 9. Mantener las suspensiones quincenales subcultivos en un medio Murashige y Skoog a pH 4.3 con constante 100 rpm de agitación a 25 ° C bajo luz continua (8,3 W/m2).
- Cosecha de las células debajo de filtración de vacío utilizando papel de filtro de poro de 11 μm y un embudo de Buchner.
- Registrar el peso fresco de las células colectadas usando una escala, envuelva en papel aluminio, congelar en nitrógeno líquido y mantenerlos a-80 ° C hasta su análisis.
- Liofilizar el....
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Resultados
Extractos de cafeína obtenidos mediante el proceso aquí presentado fueron analizados por TLC-densitometría sometiendo las muestras para la placa de cromatografía de acuerdo con el esquema mostrado en la figura 1. Para cuantificar los niveles de cafeína en los extractos de la célula, una curva con diferentes concentraciones del estándar comercial para este compuesto fue utilizado (figura 2A). Se analizó el patrón de absorción de l.......
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Discusión
Aquí presentamos las condiciones óptimas para evaluar el contenido de cafeína, niveles de actividad y transcripción de CS en una en vitro planta de cultivo de tejidos, tales como suspensiones celulares de C. arabica. Informes anteriores han confirmado que las células manteniendo bajo irradiación de la luz y en presencia de teobromina en el medio de cultivo son los parámetros adecuados para incrementar el nivel de cafeína, lo que es posible evaluar los métodos de separación de la cafeína utilizando croma.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo de nuestro laboratorio fue financiado por una subvención de la Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT 219893) a Smiths. Esta investigación también fue apoyada por una beca otorgada a RJPK (núm. 37938) por CONACyT y el Sistema Nacional de Investigadores (4422). Los autores agradecen CIATEJ para el uso de sus instalaciones durante la escritura de este manuscrito. Especial agradecimiento se extiende a Dr. Víctor Manuel González Mendoza para todas las recomendaciones en la sección de biología molecular y Valentín Mendoza Rodríguez, IFC, UNAM por las facilidades durante la filmación de este artículo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Murashige & Skoog Mezcla de sales basales | Laboratorios de Fitotecnología | M524 | Tamaño del paquete: 50 L Reactivo (mg/L) Nitrato de amonio (1650) Ácido bórico (6.2) Cloruro de calcio, anhidro (322.2) Cloruro de cobalto• H2O (0.025) Sulfato cúprico&toro; 5H2O (0.025) Na2EDTA• 2H2O (37.26) Sulfato ferroso&toro; 7H2O (27.8) Sulfato de magnesio, anhidro (180.7) Sulfato de manganeso• H2O (16.9) Ácido molibdico (sal sódica)• 2H2O (0,25) Yoduro de potasio (0,83) Nitrato de potasio (1900) Fosfato de potasio, monobásico (170) Sulfato de zinc• 7H2O (8.6) Suplementado con mioinositol (100) tiamina (10) cisteína (25) sacarosa (30000) ácido 2,4-diclorofenoxiacético (3) 6-bencilamina purina (1) |
| Cafeína | SIGMA | C0750-5G | STANDARD-5g |
| Teobromina | SIGMA | T4500 | 20 g |
| CAMAG TLC Scanner-4 | CAMAG | 27.62 | |
| WinCATS Software Administrador de cromatografía plana | CAMAG | 1.4.10 | Software |
| Alcohol isoamílico (24:1) | SIGMA | C-0549 | 500 mL |
| Ciclohexano | JALMEX | C4375-13 | 1 L |
| Acetona | J.T. BAKER | 4 L | |
| Metanol | J.T. BAKER | 9093-03 | 4 L |
| Cloroformo | JALMEX | C-4425-15 | 3.5 L |
| TLC gel de sílice 60 F254 | Merck | 1.05554.0001 | Placa TLC |
| β-mercaptoetanol | M6250 | SIGMA | 100 mL |
| (+)-L-ascorbato de sodio | A4034 | SIGMA | 100 g |
| Trizma base | SIGMA | T6066 | 1 Kg |
| Ácido clorhídrico 36.5-38% | J.T. Baker | 9535-05 Kit de ensayo de | 2,5 L |
| Kit | 232227 | termocientífico | |
| Metilo [3H]-S-adenosil metionina | Perkin Elmer | NET155 | Actividad específica de 15 Ci/mmol |
| Viales de centelleo líquido | SIGMA | Z253081 | |
| Baño/circulador termostático | Cole Parmer | 60714 | |
| Tubo | de microcentrífugaEppendorf | Tubo de 1,5 mL | |
| Viales criogénicos | Heathrow Scientific | HS23202A | 2 |
| mL Centrífuga 5804 | Eppendorf | 5804 000925 | |
| Vortex | Thermolyne | LR 5947 | |
| Mortero de porcelana | Fisherbrand | FB961B | |
| Papel de filtro | Whatman | Z274844 | Medio |
| de porosidadPicofuge | Stratagene | 400550 | 2000 x g |
| Balanza analítica | Y | HR-120 | Modelo HR-120 |
| Contador de centelleo | Beckman Coulter | 6500 | |
| Gel sistema de fotodocumentación | Bio-Rad | Chemic XRS | Modelo Chemic XRS |
| Lámpara UV compacta | UVP | 95002112 | UVGL-25 |
| Scienceware HDPE Embudo Buchner | SIGMA | 2419907 | Tipo 37600 |
| mezclador TRIzol reactivo | Thermo scientific | 15596-018 | 200 mL |
| ReverdAid Transcriptasa inversa | Thermo scientific | #EP0441 | 10000 U |
| Oligo (dT)18 primer | Thermo scientific | #S0131 | 100 µ M |
| DNasa I, sin RNasa | Thermo scientific | #EN0525 | 1000 U |
| Cloruro de magnesio | Thermo scientific | EN0525 | 1,25 mL |
| Ácido etilendiaminotetraacético | Thermo scientific | EN0525 | 1 mL |
| dNTP mix | Thermo scientific | R0191 | R0191 |
| SYBR Green qPCR Master Mix (2X) | Thermo scientific | K0251 | Para 200 reacciones de 25 µ L |
| PikoReal | Thermo scientific | 2.2 | Software |
| Fenol, pH 8.0, equilibrado, Grado de biología molecular, Ultrapuro | USB | J75829 | 100 mL |
| Alcohol isopropílico | Karal | 2040 | 1 L |
| Alcohol etílico | SIGMA | 64175 | 1 L |
| Pirocarbonato de dietilo | SIGMA | D5758 | 100 mL |
| Rotador de laboratorio | LW Científico | Mod. LW210 |
Referencias
- Ferruzzi, M. G. The influence of beverage composition on delivery of phenolic compounds from coffee and tea. Physiolgy & Behavior. 100 (1), 33-41 (2010).
- Majhenič, L., Škerget, M., Knez, Ž Antioxidant and antimicrobial activity of guarana seed extracts. Food Chemistry. 104 (3), 1258-1268 (2007).
- Sled....
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Reimpresiones y permisos
