El protocolo de estrés leve crónico impredecible para inducir la Anhedonia en ratones

Desorden depresivo importante (MDD) es una condición debilitante, que se ha indicado como la 11^th de causa de carga global de enfermedad¹, con una prevalencia durante la vida de 11 – 16%^2,3. MDD se ha asociado con impedimentos severos en pacientes funcionamiento social y ocupacional, menor calidad de vida, numerosos trastornos físicos y mentales y mayor riesgo de mortalidad^{4,5,6 , 7}. hay varios farmacoterapias eficaces y las intervenciones psicológicas para MDD; sin embargo, más de la tercera parte de los pacientes no alcanzan la remisión con las opciones terapéuticas existentes^8,9,10,11. Por lo tanto, mejor asignación de la fisiopatología de la MDD y el desarrollo de nuevos fármacos están siendo de suma importancia. Para hacer frente a estas necesidades de modelos animales de tareas científicamente validadas para ser utilizados.

El estrés leve crónico impredecible (UCMS) es un paradigma roedor famoso utilizado para inducir depresión y ansiedad como comportamientos^12,13,14,15. El objetivo principal de UCMS es generar déficits conductuales (por ejemplo, anhedonia y desesperanza conductual^12,15) en ratones y ratas y promover la proyección de posibles agentes terapéuticos farmacológicos. El procedimiento fue introducido por primera vez por Katz¹⁶ y posteriormente desarrollado por Willner^17,18, rindiendo grandes resultados conductuales y neurobiológicos rememorando sintomatología depresiva¹². Fue diseñado inicialmente para las ratas y luego acomodó a ratones^13,19. En el procedimiento, animales adolescentes están expuestos crónicamente a diferentes estresores leves impredecibles. Posteriormente, se administran agentes farmacológicos. Se obtienen los índices conductuales y biológicos a la terminación del tratamiento. Uno de los más destacados ensayos realizados tras UCMS es la prueba de preferencia de sacarosa (SPT). El SPT se basa en preferencia innata de los roedores de la solución azucarada en vez de agua y es ampliamente reconocida como un modelo traslacional esencial para la evaluación de la anhedonia^{12,18,20, 21} (que es un síntoma de la base en la depresión humana^22,23).

Al entrar en la cuarta década desde su introducción, UCMS se ha aplicado en ratones y ratas en innumerables estudios. La mayoría de estos estudios emplearon UCMS como método para inducir comportamientos depresivos^12,13,21,24. Los estudios también han utilizado el modelo para generar anxiogenic efectos^{25,26,27,28,29}. Preferencias de sacarosa y la sacarina son las pruebas principales para evaluar anhedonia siguiendo UCMS^{12,18,30,31,32,33}. Otras medidas de resultado notable que muy están incorporados en la literatura UCMS son: la suspensión de la cola prueba (TST)^28,34,35, test de natación forzada (FST)^{28,34 , 36 , 37} (ambos miden estrés afrontamiento/comportamiento desesperación), la prueba de campo abierto (OFT; medición de conducta exploratoria, ansiedad-como comportamiento y actividad locomotriz)^25,28,38, el elevado Además de laberinto (EPM; medición ansiedad-como comportamiento)^25,39,40 y pruebas adicionales de medición comportamientos depresivos, ansiedad-como comportamiento, funcionamiento cognitivo y comportamiento social¹² . Administración crónica de antidepresivos tricíclicos (TCAs; imipramina^35,41,42,43, desipramina^18,44,45 ), antidepresivos tetracíclicos (TeCAs; maprotilina^46,47, mianserin⁴⁸), inhibidores de la recaptación de serotonina (ISRS, fluoxetina^46,47,49 , escitalopram^30,50, paroxetina^51,52), melatonina^43,49, Agomelatina⁵³, el inhibidor de ácido graso amida hidrolasa (FAAH) URB597⁵⁴ y varios compuestos naturales^{30,37,50,55,56,57,58} han sido demostrado para invertir los síntomas inducidos por UCMS depresivo y ansiedad-como. En general, estos efectos terapéuticos no han sido obtenidos mediante tratamientos agudo¹² (por ejemplo, paroxetina^51,52, imipramina^{53,54,59 ,60}, fluoxetina⁵³, Agomelatina⁵³, URB597⁵⁴, brofaromina⁶⁰).

La exposición de estrés durante la infancia y adolescencia es un factor de riesgo importante para la formación anterior de MDD (entre varios otros trastornos psiquiátricos) en la edad adulta^61,62,63. Eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal (HPA) es el principal sistema neuroendocrino, regulación de la respuesta bio-conductuales al estrés⁶⁴. Estrés a largo plazo durante los periodos sensibles del desarrollo neurológico de la infancia y adolescencia que dañen el equilibrio del eje HPA. Puede provocar un estado de mayor activación simpática, reactividad desequilibrada y hypercortisolemia duradera a través del estado de reposo; por lo tanto, haciendo vulnerable a la depresión o psicopatologías relacionadas con la ansiedad^65,66,67,68personas. UCMS traduce adecuadamente esta patogenesia: tensión aplicación en ratones ' adolescencia induce una susceptibilidad como depresivos a largo plazo. Por otra parte, los déficits conductuales inducidos por UCMS, está sustentada por alteraciones significativas en la HPA axis funcionamiento (p. ej., causando una reducción en el factor neurotrófico derivado del cerebro hippocampal [BDNF; una proteína altamente implicada en el equilibrio el eje HPA^69,70]³⁰, o por alterar la regulación de la secreción de corticosterona a la sangre^71,72), en similitud a la fisiopatología en los seres humanos^{12, 50,73}.

UCMS tiene varias características, reforzando un modelo para la depresión: por ejemplo, (i) la obtención de anhedonia (que se considera un endofenotipos de MDD^23,74); (ii) UCMS permite evaluar gran variedad de comportamientos depresivos como desesperación conductual, conducta social reducida, deterioro en el estado de la piel y más³⁴; y (iii) crónica (2-4 semanas), pero no aguda, administración de antidepresivos siguientes exposición de estrés podría producir un efecto terapéutico prolongado paralelo al efecto obtenido en pacientes humanos por los mismos agentes^{30,75 ,76,77}.

Estas características refuerzan la validez de UCMS comparado con otros modelos animales de depresión. La FST⁷⁸ y el⁷⁹ del TST son dos modelos que se utilizan para inducir o para evaluar el comportamiento depresivo. Como modelos para inducir comportamientos depresivos tienen claras deficiencias en comparación con UCMS; no sugerirán el cambios de comportamiento a largo plazo y podría simplemente reflejar un ajuste de la tensión aguda en lugar de producir una manifestación depresiva como artículo⁷⁶.

Un alternativo modelo animal de depresión es el modelo social de la derrota. A diferencia de la FST y el TST este modelo (como UCMS) requieren la aplicación de estrés crónico (id est [es decir], la recurrente sujeción del animal social aversivo encuentros con homólogos dominantes)^{76,77 , 80 , 81 , 82}. la principal ventaja del modelo social de la derrota es que emplea estímulos sociales como factores estresantes, reflejando así el papel del estrés psicosocial en la patogenia de la depresión humana. Similar a UCMS, el modelo social de la derrota provoca a largo plazo comportamientos depresivos y alteraciones neuroendocrinas. Otra vez paralelo al UCMS, podría revertirse el déficit social inducida por la derrota vía crónica pero no aguda, la administración de antidepresivos. En general, hay gran soporte para la utilización de UCMS y derrota social como los aparatos para la investigación de la fisiopatología de la depresión^76,77,81,82 . Sin embargo, un déficit importante del modelo social de la derrota es que podría ser aplicado únicamente en roedores macho, las hembras no presentan suficiente comportamiento agresivo hacia uno a⁸³. En contraste, UCMS ha demostrado para producir varios efectos depresivos en ambos ratones machos y hembras³⁴.

El estrés leve crónico predecible (PCMS) es otro modelo de roedor que impone un régimen de exposición recurrente diaria a moderación estrés^{28,84,85,86,87}. Varios estudios han demostrado que PCMS aumentó de^28,de comportamientos ansiedad⁸⁷; Aunque hay contradictorios informes de capacidad de PCMS vis-á-vis inducir comportamientos depresivos a largo plazo. A diferencia de UCMS, PCMS ha producido resultados menos satisfactorios refiriéndose a su capacidad para inducir un estado similar al anhedónico^28,84,86. Esto es consistente con la fenomenología humana, en que impredecible estresores son más perjudiciales que predecible los⁸⁸.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comisión de Colegio académico Tel-Aviv-Yaffo.

1. los animales

1. Uso pre-adolescente (es decir, 3 semanas de edad) Instituto de cáncer Research (ICR) marginado ratones machos.
2. Aleatorizar ratones a dos grupos de igual tamaño tensión (UCMS vs ingenuo). Utilice 15 ratones por grupo de tratamiento (p. ej.: si hay 3 farmacológico grupos de tratamiento utilizan 90 ratones general; 2 [UCMS vs ingenuo] x 3 [tratamientos] × 15 [ratones] = 90)
3. Ratones de la casa según el grupo de estrés; es decir, ratones de ingenua la casa con los ratones ingenuos sólo y casa UCMS grupo ratones con los ratones del grupo UCMS solamente.
4. Animales en jaulas estándar de inicio de la casa (30 × 15 × 14 cm; 5 ratones por jaula; cada jaula de ratones de todos los grupos de tratamiento [es decir, grupos de tratamiento farmacológico]; mantener los ratones en la misma jaula durante todo el experimento, excepto cuando se indique lo contrario) .
5. Jaulas casa se llenan de aserrín fresco (reemplazado dos veces a la semana) y añadir un trozo de algodón para el enriquecimiento.
6. Animales en la jaula del hogar por un período de aclimatación de una semana en casa. Permite el acceso ad libitum a chow roedor y agua (excepto durante las aplicaciones de estresor UCMS).
7. Mantener un ciclo de constante 12 h luz/oscuridad (excepto cuando se indique lo contrario). Durante los procedimientos UCMS mantener ratones ingenuo en su jaula casera.

2. UCMS

1. Designar un cuarto separado en el laboratorio, para el uso exclusivo del protocolo UCMS.
2. Diseño de un régimen de 4 semana estresante en la que cada uno de los siete factores de estrés (es decir, mojada jaula, serrín humedecido, jaula inclinada, jaula vacía, estrés social, moderación de ratones e interrupción del ciclo luz/oscuridad) se utiliza una vez por semana, en un día diferente cada semana (para un diseño posible ver suplementales tabla 1).
3. Tras una semana de aclimatación (véase 1.6) iniciar la aplicación de factores de estrés (Asegúrese de que los ratones son aproximadamente 4 semanas de edad).
4. Cada día, antes de la aplicación del factor estresante, transferir las jaulas del grupo UCMS desde la sala de la vivienda a la sala UCMS.
5. Durante las aplicaciones del estresor, bloquear el acceso a los roedor chow y agua para el grupo UCMS (excepto durante el cambio de luz/oscuridad del ciclo).
   Nota: Esto podría obtenerse por la sustitución de la original jaula tapa (que contiene agua y alimentos), para una tapa de la jaula vacía.
6. Aplicar los siguientes factores de estrés según el régimen diseñado anteriormente (ver 2.2):
   1. Jaula mojada
      1. Lugar de ratones junto con sus homólogos de jaula casa en una jaula vacía (es decir, jaula sin serrín).
      2. Llene la jaula vacía con agua guardado en 24 ± 1 ° C a una profundidad de 1 cm (vierta con cuidado para evitar derrames de agua directo en ratones). Tener ratones en la jaula mojada durante 4 horas.
      3. Transferir cada ratón a un transitorio individual separado secado de la jaula con una lámpara de calor por encima de ella, una almohada debajo de él y ropa de cama de papel toalla. Coloque un termómetro en la jaula transitoria para verificar que la temperatura no supere los 37 ° C.
      4. Mantenga cada ratón en la jaula transitoria hasta que se seque y parece vigorizado (aproximadamente 10 – 15 min). Volver a ratones a casa jaula con sus homólogos de la misma.
   2. Serrín húmedo
      1. Vierta el agua mantenido a 24 ± 1 ° C a la estructura de la casa hasta que el aserrín es moderadamente húmedo (vierta con cuidado para evitar derrames de agua directo en ratones).
         Nota: No es necesario utilizar aserrín fresco antes de verter el agua.
      2. Después de 4 h, secar ratones en jaulas transitorias como se describe en 2.6.1.3. Lugar de ratones con contrapartes jaula casera en una jaula estéril con aserrín fresco.
   3. Jaula inclinada
      1. Inclinación de jaulas a 45° contra la pared durante 4 horas.
         Nota: Durante este período, ratones de estresor permanecen en su jaula casera con sus homólogos.
   4. Jaula vacía
      1. Transferencia de ratones, junto con sus homólogos específicos jaula casera, de la caja de página a una jaula vacía durante 4 horas.
   5. Estrés social
      1. Transferencia de ratones, junto con sus homólogos específicos jaula casera, de la caja de página a una jaula que fue ubicada por un grupo diferente de ratones por un periodo de al menos 3 d antes de la aplicación del factor estresante. Tener ratones en la jaula desconocida durante 4 horas.
         Nota: Para evitar incertidumbre Coloque una pegatina en cada jaula para indicar jaula de ratones origen.
   6. Sistema de seguridad para ratones
      1. Colocar por separado cada ratón en un limitador ratón limpio de ratones retorno 4 h. a casa jaula con sus homólogos de la misma.
   7. Interrupción del ciclo luz/oscuridad
      1. Transferencia de ratones en su casa jaula con sus homólogos específicos, a la sala UCMS. Mantener la luz, durante 24 horas consecutivas.
         Nota: Solamente durante este estresor ratones se permitirá acceso ad libitum a chow roedor y agua.
7. Tras aplicación de estresor, regresa jaulas del grupo UCMS desde la sala UCMS a la sala de la vivienda.
8. Durante las 4 semanas de la exposición de estrés, mantener el grupo de ingenuos en sus jaulas hogar ubicados en la sala de la vivienda.
   Nota: Ratones ingenuos no se transfieren a las habitaciones UCMS porque la exposición a otros ratones sometidos a estrés procedimiento podría inducir un efecto de stressogenic, incluso sin exposición directa al estresor^89,90.
9. Control de los animales durante el UCMS
   1. Durante el estresante aplicaciones (excepto durante la interrupción de luz/oscuridad del ciclo) controlar ratones cada 30 minutos por un experimentado experimentador. Si se observa una dificultad anormal (p. ej., temblores, letargo, falta de movimiento) (precaución especial debe colocarse en hipotermia potenciales durante la 'jaula mojada' y 'aserrín humedecido') aliviar inmediatamente el ratón desde el factor estresante.
   2. Inspeccione cada ratón diario por heridas u otras anormalidades físicas o de comportamiento. Si tal inspección consulte con veterinario de laboratorio para decidir si el ratón debe ser excluido de la experiencia.
   3. Peso de cada ratón cada 3 días. Fuerte reducción en el peso corporal (es decir, > reducción del 10% del peso inicial o > 15% reducción de última medida peso) deben notificarse al veterinario del laboratorio y el ratón debe ser excluido de la experiencia.

3. detección de antidepresivos

1. Al día siguiente cese del protocolo UCMS, iniciar la administración de agentes farmacológicos terapéuticos putativos (es decir, el escitalopram [15 mg/kg, i.p.; 3 semanas; en la administración por día]^30,50, o novela herbal tratamiento [NHT, 30 mg/kg i.p.; 3 semanas; una administración al día]^30,50).
   Nota: Para las dosis de otras drogas no incluidas en el presente Protocolo ver: flouxetine^{46, 47, 49, 89, 90}, paroxetina⁵¹,^35,41,42,43de la imipramina, desipramina^18,44,45, maprotilina^46,47, mianserin⁴⁸, la melatonina^43,49, URB59754 y otros naturales compuestos de^{37,55,56,57,58}.
   Nota: NHT es una fórmula herbal que se ha desarrollado en nuestro laboratorio. Está formado por 4 componentes:
   Crataegus Pinnatifida, Triticum Aestivum, Brownie de Lilium y Fructus Zizyphi azufaifa. La fórmula se prepara mediante la disolución de los constituyentes (adquiridos como gránulos liofilizados) juntos en una solución salina que contiene DMSO 1% para dar una concentración final de 0,47 mg/ml (cada uno)^27,50.
2. Incluyen un grupo control de tratamiento y administrar solución salina (i.p.; 3 semanas; una inyección por día) a este grupo.
3. Calcular dosis de medicamentos según ratones ' de peso, como en el pesaje anterior.
4. Administrar medicamentos de forma crónica (administración de drogas generalmente uno al día mediante inyección intraperitoneal [IP] durante 3 semanas).
   Nota: No hay para anestesiar los ratones antes de la inyección intraperitoneal.
5. Siguen pesando ratones cada 3 d; el último pesaje debe ser 3 d antes de la última administración del fármaco.

4. evaluación de tono hedónico en el SPT

1. Después de la fase del tratamiento, retire cada ratón de la casa jaula y colocar individualmente en una jaula llenada de aserrín fresco y un trozo de algodón para el enriquecimiento.
2. Preparar dos botellas, una con agua destilada y otra con solución de sacarosa 2% (podría utilizarse otra sustancia: por ejemplo, sacarina⁹¹, etanol³⁰).
   Nota: Cada botella debe contener el mismo volumen de líquido. Aclimatación previa ni fases de habituación son necesarios antes de la introducción de fluidos.
3. Pesan las dos botellas y ponerlos en la tapa de la jaula para permitir ratones acceso ad libitum a ambas soluciones por un período de (uno de los siguientes): 24/48/72/144 h.
4. Coloque las dos botellas en ambos extremos de la tapa de la jaula. Lugar de chow roedor entre las dos botellas para permitir el acceso ad libitum al alimento.
5. Reemplazar botellas cada 24 h, usando las botellas estériles con fluido fresco.
   Nota: como ratones se alojan individualmente no hay para cambiar el aserrín incluso después de h 144⁹².
6. Posiciones del interruptor de inyectores cada 12 h (cuando la duración de la prueba es de 24 h) o una vez al día (cuando la duración de la prueba supera 24 horas) para contrarrestar la posibilidad de que los resultados fueron confundidos por la preferencia de posición.
7. Pesar de botellas cada día para estimar el consumo de cada botella.
8. Calcular preferencia de sacarosa como cociente de la ingesta de sacarosa de la ingesta total de líquido (es decir, sucrosa/sacarosa + agua).

Para corroborar la eficacia del procedimiento UCMS para inducir déficits de tipo depresivo, se llevó a cabo un control de la manipulación. Ratones ICR marginado machos fueron asignados aleatoriamente a las condiciones UCMS o ingenuos (4 semanas, como se describe en el protocolo de 2.2). Posteriormente, el SPT (6 días, como se describe en el protocolo 4) fue administrado para evaluar si los ratones después de experimentar UCMS demostraron déficits hedónicos. Poco después, ratones fueron sacrificados y el hipocampo se diseca completamente para el FNDC (una proteína altamente implicada en la fisiopatología de la depresión70,93) evaluación por análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Vea la figura 1 para el diseño del estudio.

Independiente de muestras t-test reveló una diferencia significativa entre los grupos de su preferencia de sacarosa (t(23) = 2.32, p < 0.05). El grupo UCMS demostró disminuido la preferencia de sacarosa, en comparación con la ingenua del grupo (ver figura 2A). Esto sugiere que el protocolo UCMS era eficaz en la inducción de anhedonia. Independiente muestras t-test en BDNF hippocampal niveles revelaron una diferencia significativa entre los grupos (t(23) = 2.43, p < 0.05). El grupo UCMS demostró disminuido niveles BDNF hippocampal comparados con la ingenua del grupo (ver figura 2B). Esto sugiere que el protocolo UCMS condujo a la disminución en los niveles BDNF hipocampales, como es evidente en la depresión humana94.

En otro estudio de nuestro laboratorio, hemos examinado los antidepresivo-como efectos de dos fármacos siguiendo protocolo UCMS. 30 procedimiento de UCMS el siguiente (como se describe en 2.) macho ICR marginado ratones recibidas crónica (3 semanas) el tratamiento con el SSRI escitalopram (15 mg/kg, i.p.), NHT (30 mg/kg, i.p.; para más información sobre NHT ver referencias25 30,50,75) o solución salina. Tras la fase de tratamiento, se llevó a cabo el SPT y se evaluaron los niveles BDNF hippocampal. Vea la figura 3 para el diseño del estudio.

Dos análisis de varianza (ANOVA) sobre preferencia de sacarosa reveló tratamiento significativo (F(2,92) = 4.01, p < 0.05) y la interacción de tratamiento × UCMS (F(2,92) = 4.92, p < 0.01) efectos (véase Figura 4A). Análisis post-hoc de Sidak revelaron que el grupo UCMS-solución salina mostró una disminución significativa en la preferencia de sacarosa respecto al grupo de ingenuos-solución salina (p < 0,001); no disminuye se observaron en el UCMS-escitalopram y en los grupos UCMS-NHT en comparación con los grupos de ingenuo (no significativa [NS]). Además, el grupo UCMS-solución salina mostró preferencia sacarosa disminuida en comparación con el escitalopram UCMS (p < 0.05) y los grupos UCMS-NHT (p < 0,001). Éstos sugieren que escitalopram y NHT normalizaron la anhedonia UCMS-inducida.

ANOVA de dos vías en los niveles BDNF hippocampal reveló UCMS significativo (F(1,22) = 8,92, p < 0.01), tratamiento (F(2,22) = 18.36, p < 0.001) y UCMS × tratamiento interacción (F(2,22) = 5.19, p < 0.05) efectos (véase Figura 4B). Análisis post-hoc de Sidak revelaron que el grupo UCMS-solución salina mostró una disminución significativa en los niveles BDNF hippocampal comparado con el grupo ingenuo-solución salina (p < 0,001); no disminuciones similares se observaron en el UCMS-escitalopram y en los grupos UCMS-NHT en comparación con los grupos de ingenuo (N.S.). Además, el grupo UCMS-solución salina mostró disminución de BDNF hipocampo en comparación con el escitalopram UCMS y los grupos UCMS-NHT (p < 0,001 en ambos contrastes). Éstos sugieren que escitalopram y NHT normalizaron la reducción UCMS-inducida en los niveles BDNF en el hipocampo.

Figura 1: un diagrama que representa un diseño experimental posible. Tras una semana de aclimatación, ratones fueron asignados aleatoriamente a UCMS o ingenuo condiciones (persistencia de 4 semanas). Posteriormente, preferencia de sacarosa fue examinado y ratones fueron preparados para la evaluación de BDNF. SPT: test de preferencia sacarosa; CD: la dislocación cervical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: los efectos de UCMS en preferencia de sacarosa y los niveles BDNF hippocampal. (A) ratones sometidos a 4 semanas de UCMS demostraron una reducción significativa en la preferencia de sacarosa, en comparación con ratones de ingenuo. (B) los ratones sometidos a 4 semanas de UCMS demostraron una reducción significativa en los niveles BDNF hipocampales en comparación con ratones de ingenuo. n = 12 – 13 ratones por grupo. Los resultados se expresan como media ± SEM. *p < 0.05 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: diagrama que representa un diseño experimental posible. Tras una semana de aclimatación, ratones fueron asignados aleatoriamente a UCMS o ingenuo condiciones (persistencia de 4 semanas). Posteriormente, los ratones recibieron tratamiento crónico con solución salina, escitalopram (15 mg/kg, i.p.) o NHT (30 mg/kg, i.p.), dura 3 semanas (una administración al día). Después del tratamiento, preferencia de sacarosa fue examinado y ratones fueron preparados para la evaluación de BDNF. SPT: test de preferencia sacarosa; CD: la dislocación cervical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: los efectos del tratamiento crónico con escitalopram y NHT en reducciones UCMS-inducida en preferencia de sacarosa y los niveles BDNF hippocampal. (A) ambos escitalopram y NHT previno la reducción UCMS-inducida en la preferencia de la sacarosa; n = 15 – 17 ratones por grupo. (B) ambos escitalopram y NHT previno la reducción UCMS-inducida en los niveles BDNF hipocampales; n = 4 a 6 ratones por grupo. Los resultados se expresan como media ± SEM. *p < 0.05 ***p < 0.001. Esta cifra ha sido modificada desde un estudio previamente publicado de nuestro laboratorio y reproducida bajo licencia de la acceso abierto PLoS ONE ("CC-BY") que permite la reimpresión de30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1 mesa adicional: Programa de estrés leve crónico impredecible (UCMS). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.